Name: Fettsäure- 13C Isotopologue Profilierung gibt Einblick in trophische Carbon Transfer und Fettstoffwechsel der Wirbellosen Verbraucher (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: Lernen Sie die Isotopologen-Profilierung zur Untersuchung des trophischen Fettsäure-Transfers bei wirbellosen Bodentieren. Diese Methode erfasst Lipidstoffwechselprozesse wie Kettenverlängerung und Beta-Oxidation.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Die finanzielle Unterstützung von R. Menzel und L. Ruess von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (RU RU780/11-1) ist dankbar anerkannt. R. Nehring wurde von RU 780/10-1 finanziert. Schließlich sind wir sehr dankbar, dass Dr. Hazel Ruvimbo Maboreke für das Korrekturlesen unserer Handschrift.

<ol><li>Ruess, L., et al. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1890/04-1399/abstract">Application of lipid analysis to understand trophic interactions in soil.</a> Ecology. 86 (8), 2075-2082 (2005).</li>
<li>Ruess, L., et al. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0038071707001046">Lipid composition of Collembola and their food resources in deciduous forest stands - Implications for feeding strategies.</a> Soil Biology and Biochemistry. 39 (8), 1990-2000 (1990).</li>
<li>Chamberlain, P. M., Bull, I. D., Black, H. I. J., Ineson, P., Evershed, R. P. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0038071705000477">Fatty acid composition and change in Collembola fed differing diets: identification of trophic biomarkers.</a> Soil Biology and Biochemistry. 37 (9), 1608-1624 (2005).</li>
<li>Stott, A. W., Davies, E., Evershed, R. P., Tuross, N. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s001140050354">Monitoring the routing of dietary and biosynthesised lipids through compound-specific stable isotope (delta C-13) measurements at natural abundance.</a> Naturwissenschaften. 84 (2), 82-86 (1997).</li>
<li>Ruess, L., Haggblom, M. M., Langel, R., Scheu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitrogen+isotope+ratios+and+fatty+acid+composition+as+indicators+of+animal+diets+in+belowground+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Oecologia%22%5BJournal%5D)">Nitrogen isotope ratios and fatty acid composition as indicators of animal diets in belowground systems.</a> Oecologia. 139 (3), 336-346 (2004).</li>
<li>Pollierer, M. M., Scheu, S., Haubert, D. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0038071710000611">Taking it to the next level: Trophic transfer of marker fatty acids from basal resource to predators.</a> Soil Biology and Biochemistry. 42 (6), 919-925 (2010).</li>
<li>Ferlian, O., Scheu, S., Pollierer, M. M. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0038071712001575">Trophic interactions in centipedes (Chilopoda, Myriapoda) as indicated by fatty acid patterns: Variations with life stage, forest age and season.</a> Soil Biology and Biochemistry. 52, 33-42 (2012).</li>
<li>Ruess, L., Chamberlain, P. M. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0038071710002683">The fat that matters: Soil food web analysis using fatty acids and their carbon stable isotope signature.</a> Soil Biology and Biochemistry. 42 (11), 1898-1910 (2010).</li>
<li>Traugott, M., Kamenova, S., Ruess, L., Seeber, J., Plantegenest, M. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B9780124200029000032">Empirically characterising trophic networks: What emerging DNA-based methods, stable isotope and fatty acid analyses can offer.</a> Adv Ecol Res. 49, 177-224 (2013).</li>
<li>Hammer, B. T., Fogel, M. L., Hoering, T. C. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0009254198000941">Stable carbon isotope ratios of fatty acids in seagrass and redhead ducks.</a> Chemical Geology. 152 (1-2), 29-41 (1998).</li>
<li>Budge, S. M., Iverson, S. J., Koopman, H. N. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1748-7692.2006.00079.x/abstract">Studying trophic ecology in marine ecosystems using fatty acids: A primer on analysis and interpretation.</a> Marine Mammal Science. 22 (4), 759-801 (2006).</li>
<li>Haubert, D., et al. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1600-0706.2009.17587.x/full">Trophic structure and major trophic links in conventional versus organic farming systems as indicated by carbon stable isotope ratios of fatty acids.</a> Oikos. 118 (10), 1579-1589 (2009).</li>
<li>Ngosong, C., Raupp, J., Richnow, H. H., Ruess, L. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S003140561100028X">Tracking Collembola feeding strategies by the natural 13C signal of fatty acids in an arable soil with different fertilizer regimes.</a> Pedobiologia. 54 (4), 225-233 (2011).</li>
<li>Bec, A., et al. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.2041-210X.2011.00111.x/abstract">Assessing the reliability of fatty acid-specific stable isotope analysis for trophic studies.</a> Methods in Ecology and Evolution. 2 (6), 651-659 (2011).</li>
<li>Gladyshev, M. I., Makhutova, O. N., Kravchuk, E. S., Anishchenko, O. V., Sushchik, N. N. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0075951115001243">Stable isotope fractionation of fatty acids of Daphnia fed laboratory cultures of microalgae.</a> Limnologica. 56 (Supplement C. 56 (Supplement C), 23-29 (2016).</li>
<li>Gladyshev, M. I., Sushchik, N. N., Kalachova, G. S., Makhutova, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+isotope+composition+of+fatty+acids+in+organisms+of+different+trophic+levels+in+the+Yenisei+river%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Stable isotope composition of fatty acids in organisms of different trophic levels in the Yenisei river.</a> PLoS One. 7 (3), e34059(2012).</li>
<li>Eisenreich, W., Dandekar, T., Heesemann, J., Goebel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+metabolism+of+intracellular+bacterial+pathogens+and+possible+links+to+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Carbon metabolism of intracellular bacterial pathogens and possible links to virulence.</a> Nature Reviews Microbiology. 8 (6), 401-412 (2010).</li>
<li>Eylert, E., Bacher, A., Eisenreich, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMR-based+isotopologue+profiling+of+microbial+carotenoids%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">NMR-based isotopologue profiling of microbial carotenoids.</a> Methods Mol Biol. 892, 315-333 (2012).</li>
<li>Garton, N. J., O'Hare, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuberculosis%3A+feeding+the+enemy%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Tuberculosis: feeding the enemy.</a> Chemical Biology. 20 (8), 971-972 (2013).</li>
<li>Rosenblatt, J., Chinkes, D., Wolfe, M., Wolfe, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+isotope+tracer+analysis+by+GC-MS%2C+including+quantification+of+isotopomer+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Stable isotope tracer analysis by GC-MS, including quantification of isotopomer effects.</a> Am J Physiol. 263 (3), E584-E596 (1992).</li>
<li>Fernandez, C. A., Des Rosiers, C., Previs, S. F., David, F., Brunengraber, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correction+of+13C+mass+isotopomer+distributions+for+natural+stable+isotope+abundance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Correction of 13C mass isotopomer distributions for natural stable isotope abundance.</a> J Mass Spectrom. 31 (3), 255-262 (1996).</li>
<li>Heuner, K., Eisenreich, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intracellular+metabolism+of+legionella+by+isotopologue+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The intracellular metabolism of legionella by isotopologue profiling.</a> Methods Mol Biol. 954, 163-181 (2013).</li>
<li>Willenborg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+pivotal+carbon+metabolism+of+Streptococcus+suis+serotype+2+under+ex+vivo+and+chemically+defined+in+vitro+conditions+by+isotopologue+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of the pivotal carbon metabolism of Streptococcus suis serotype 2 under ex vivo and chemically defined in vitro conditions by isotopologue profiling.</a> J Biol Chem. 290 (9), 5840-5854 (2015).</li>
<li>Menzel, R., Ngosong, C., Ruess, L. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s00049-017-0236-2">Isotopologue profiling enables insights into dietary routing and metabolism of trophic biomarker fatty acids.</a> Chemoecology. 27 (3), 101-114 (2017).</li>
<li>Buse, T., Ruess, L., Filser, J. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0031405613000231">New trophic biomarkers for Collembola reared on algal diets.</a> Pedobiologia. 56 (3), 153-159 (2013).</li>
<li>Hutson, B. R. <a target="_blank" href="http://agris.fao.org/agris-search/search.do?recordID=US201302427834">Effects of variations of the plaster-charcoal culture method on a Collembolan, Folsomia candida.</a> Pedobiologia. 18, 138-144 (1978).</li>
<li>Fountain, M. T., Hopkin, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folsomia+candida+%28Collembola%29%3A+a+%26%2334%3Bstandard%26%2334%3B+soil+arthropod%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Entomol%22%5BJournal%5D)">Folsomia candida (Collembola): a &#34;standard&#34; soil arthropod.</a> Annu Rev Entomol. 50, 201-222 (2005).</li>
<li>ISO, I. O. fS. <a target="_blank" href="https://www.iso.org/standard/19245.html">Soil Quality-Inhibition of reproduction of Collembola (Folsomia candida) by soil pollutants</a>. , ISO 11267:1999 (1999).</li>
<li>Welch, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+cellular+fatty+acid+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Applications of cellular fatty acid analysis.</a> Clin Microbiol Rev. 4 (4), 422-438 (1991).</li>
<li>Dodds, E. D., McCoy, M. R., Rea, L. D., Kennish, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gas+chromatographic+quantification+of+fatty+acid+methyl+esters%3A+flame+ionization+detection+vs.+electron+impact+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Lipids%22%5BJournal%5D)">Gas chromatographic quantification of fatty acid methyl esters: flame ionization detection vs. electron impact mass spectrometry.</a> Lipids. 40 (4), 419-428 (2005).</li>
<li>Kuppardt, S., Chatzinotas, A., Kastner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+fatty+acid+and+RNA+stable+isotope+probing-based+method+for+tracking+protist+grazing+on+bacteria+in+wastewater%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Development of a fatty acid and RNA stable isotope probing-based method for tracking protist grazing on bacteria in wastewater.</a> Appl Environ Microbiol. 76 (24), 8222-8230 (2010).</li>
<li>Zhang, X., He, H., Amelung, W. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0038071707002489">A GC/MS method for the assessment of 15N and 13C incorporation into soil amino acid enantiomers.</a> Soil Biology and Biochemistry. 39 (11), 2785-2796 (2007).</li>
<li>Vetter, W., Thurnhofer, S. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/lite.200700062/abstract">Analysis of fatty acids by mass spectrometry in the selected ion monitoring mode.</a> Lipid Technol. 19 (8), 184-186 (2007).</li>
<li>Thurnhofer, S., Vetter, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gas+chromatography%2Felectron+ionization-mass+spectrometry-selected+ion+monitoring+method+for+determining+the+fatty+acid+pattern+in+food+after+formation+of+fatty+acid+methyl+esters%5BTitle%5D)+AND+%22J+Agric+Food+Chem%22%5BJournal%5D)">A gas chromatography/electron ionization-mass spectrometry-selected ion monitoring method for determining the fatty acid pattern in food after formation of fatty acid methyl esters.</a> J Agric Food Chem. 53 (23), 8896-8903 (2005).</li>
<li>Haubert, D., Haggblom, M. M., Scheu, S., Ruess, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+fungal+food+quality+and+starvation+on+the+fatty+acid+composition+of+Protaphorura+fimata+%28Collembola%29%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Biochemistry+and+Physiology+B-Biochemistry+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Effects of fungal food quality and starvation on the fatty acid composition of Protaphorura fimata (Collembola).</a> Comparative Biochemistry and Physiology B-Biochemistry & Molecular Biology. 138 (1), 41-52 (2004).</li>
</ol>

Isotopologue Profilierung
Eine detaillierte Analyse der quantitativen Aspekte bei 13C Verteilung in FAs braucht Spitzentechnologie, Kohlenstoff in Nahrungsketten Partitionierung zuzuweisen. Die vorliegende Arbeit beschäftigt Isotopologue Profilierung zur Beurteilung der 13C /12C-Verhältnisse in gemeinsamen FA Biomarker für tropische Interaktionen. Diese Methode ist gut etabliert für Aminosäureanalyse von Flüssigchromatographie (LC-MS) und galt ...

In einem kryptischen Lebensraum wie Boden trophische Beziehungen sind schwer zu Adresse und sind durch die geringe Größe der Fauna weiter beschränkt. Im letzte Jahrzehnt hat Fortschritte in biochemische Ökologie, insbesondere bei der Verwendung von Fettsäuren als Biomarker für die Definition von Fütter Strategien der Bodenfauna unter Feld Bedingungen1,2,3gesehen. Dies ist, dass Fettsäuren aus Ressourcen in Verbraucher-Gewebe als gesamte Moleküle eingebaut werden können, bezeichnet ein Prozess diätetische routing4. Übertragung von Fettsäuren ist über drei trophischen Ebenen, d. h. aus Pilzen, Nematoden, Collembolen5berichtet worden. Vor kurzem, die räuberischen Fauna galt6,7 und die ersten Reviews auf Fettsäuren als trophische Markierungen im Boden Nahrungsnetze wurden veröffentlicht8,9.
Nähere Informationen zu trophischen Interaktionen wird durch Fettsäure-stabiler Isotope probing (FA-SIP) erreicht. Die Bestimmung von 13C /12C-Verhältnisse in Fettsäuren in Diäten und Verbraucher können zuschreiben binäre Verknüpfungen und Abschätzung den damit verbundenen CO2-Fluss und beschäftigt in terrestrischen, Süßwasser und marinen Nahrungsnetze10,11 ,12,13. Die Grundannahme ist, dass weitergeleitete diätetischen Fettsäuren nicht enzymatischen Prozessen unterworfen sind; daher ihre 13C signal, d. h. 13C /12C Verhältnis der Fettsäure in der Konsumgüterindustrie ist ähnlich wie in der Diät-1. Jedoch wurde eine allmähliche Entleerung der 13C Signatur oben in der Nahrungskette in aquatischen Systemen, dadurch behindern breite Anwendung des FA-SIP trophische Studien14,15,16berichtet. Kenntnisse in den Lipidstoffwechsel in den meisten Wirbellosen in terrestrischen Nahrungsketten ist übrigens nach wie vor begrenzt.
Das Verständnis der Lipid Metabolismus Bahnen bei den Verbrauchern ist Voraussetzung für die Nutzung der trophischen Marker Fettsäuren als Mittel zur Bestimmung der quantitativen Kohlenstoff Strömung im Nahrungsnetz Ökologie. Mit diesem im Verstand, 13C-Isotopologue Profilierung, welche im Prinzip für die Untersuchung von Kohlenstoff-Stoffwechsel jedes biologische System17, angewendet werden kann ist eine vielversprechende Methode. Nach der Einführung des 13C gekennzeichnet Carbon Substrat, die Verteilung der 13C in der metabolischen Netzwerkes ist seit der erzeugten Stoffwechselprodukte in der Consumer-Show eine spezifische Isotopologue Verteilung nachvollziehbar. Dies kann durch quantitative nukleare metabolische Resonanz Spektroskopie18,19 oder Massenspektrometrie20,21, mit der letzteren bevorzugten in biologischen Proben mit niedrigen Biomasse aufgrund seiner höheren beurteilt werden Empfindlichkeit.
Obwohl Isotopologue Profilierung wurde erfolgreich angewendet, Aminosäuren und bot Einblick in den in-Vivo Kohlenstoff-Stoffwechsel der bakteriellen Krankheitserregern17,22,23, deren Umsetzung in Fettsäuren Säuren ist zurückgeblieben. Die erste detaillierte Analyse über das Schicksal von einem stabilen isotopenmarkierter Vorläufer Fettsäure, diätetische routing oder Abbau durch β-Oxidation, Boden Wirbellosen Verbraucher, wurde vor kurzem von Menzel Et Al. durchgeführt. 24. hier werden die methodischen Grundlagen für Einbau Experimente mit 13C gekennzeichnet, gefolgt von Isotopologue Analyse der wichtigsten Nachkommen in häufigen Boden Wirbellosen, die Collembolen Fettsäuren zur Verfügung gestellt. Diese Microarthropods sind ein gutes Modell-Gruppe, da sie wichtige Bestandteile des Bodens Nahrungsnetz und sind gut für ihre trophische Marker Fettsäuren8,25untersucht bilden.
Das Verständnis der Lipid Metabolismus Bahnen bei den Verbrauchern ist Voraussetzung für die Nutzung der trophischen Marker Fettsäuren als Mittel zur Bestimmung der quantitativen Kohlenstoff Strömung im Nahrungsnetz Ökologie. Dieses Protokoll bietet das Design und die Einrichtung für ein Labor Ernährung Experiment und die biochemische Verfahren zur Extraktion und Methylierung von dominanten Lipide Brüche (neutralen Lipiden, Phospholipiden) von Collembolen. Es zeigt, wie die Isotopologue Zusammensetzung der Fettsäuren durch Massenspektrometrie analysiert wird und beschreibt die zugehörige Formel und Berechnungen. Dieses Verfahren führt zu: (i) die Verhältnisse der Isotopologues überschreiten die Masse des Ions (d. h. die Fettsäure Molekulare Ionen M+) Eltern von einem oder mehreren mass-Einheiten (M+ 1M+ 2M+ 3, etc.) und (Ii) die gesamte 13 C-Anreicherung in Fettsäuren abgeleitet aus den 13C gekennzeichneten Vorläufer. Obwohl für Collembolen verwendet, kann dieser Ansatz in der Regel auf andere Räuber-Beute-Interaktion auf der Prämisse angewendet werden, dass diese sind in ausreichender Menge unter kontrollierten Bedingungen zu eine erfolgreichen Label Akzeptanz zu gewährleisten und anschließende Überprüfung.

<table><tbody><tr><td>neoLab-Runddosen</td><td>neoLab</td><td>2-1506</td><td>69 x 40 mm, 10 pacs/Pack</td></tr><tr><td>Aktivkohle aktiviert</td><td>Carl Roth</td><td>X865.1</td><td>p.a., Pulver, CAS-Nr. 7440-44-0</td></tr><tr><td>Alabaster Dental</td><td>R&Ouml; HRICH-GIPSE</td><td>---</td><td>http://www.roehrich-gipse.de/dentalgipse.php</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Carl Roth</td><td>7331.1</td><td>HPLC &ge; 99,9 %</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Carl Roth</td><td>P717.1</td><td>HPLC &ge; 99,9 %</td></tr><tr><td>Hexan</td><td>Carl Roth</td><td>7339.1</td><td>HPLC &ge; 98 %</td></tr><tr><td>tert-Butylmethylether (MTBE)</td><td>Carl Roth</td><td>T175.1</td><td>HPLC &ge; 99,5 % </td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Carl Roth</td><td>7328.2</td><td>HPLC &ge; 99,9 %</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Carl Roth</td><td>6771.1</td><td>p.a. > 99 %, in Pellets</td></tr><tr><td>di-Natriumhydrogenphosphat</td><td>Carl Roth</td><td>P030.1</td><td>p.a. &ge; 99 % , wasserfrei</td></tr><tr><td>Na-Dihydrogenphosphat Dihydrat</td><td>Carl Roth</td><td>T879.1</td><td>p.a. &ge; 99 %</td></tr><tr><td>Hypochlorsäure (6 N)</td><td>VWR International</td><td>26.115.000</td><td>AVS TITRINORM vol. Lösung</td></tr><tr><td>Bond Elut (Säulen)</td><td>Agilent Tech.</td><td>14102037</td><td>HF Bond Elut-SI, 500 mg, 3 mL, 50/PK</td></tr><tr><td>Pr&auml; Paratengl&Auml; ser Duran</td><td>Glasger&auml; tebau Ochs</td><td>135215</td><td>&Oslash; 16 x 100 mm, zzgl. Schraubverschluss mit praktischer Rändelung und integrierter PTFE/Silikon-Dichtung</td></tr><tr><td>Supelco 37 Component FAME Mix</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47885-U Supelco</td><td>10&nbsp; mg/ml in Methylenchlorid, analytischer Standard</td></tr><tr><td>FlowMesh</td><td>Carl Roth</td><td>2796.1</td><td>Polypropylengewebe, ca. 0,3 mm dick, mit einem Strangabstand von 1 mm</td></tr><tr><td>Bakteriensäuremethylester (BAME) Mix</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47080-U Supelco</td><td>10&nbsp; mg/mL in Methylcaproat, analytischer Standard</td></tr><tr><td>Methylnonadecanoat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>74208</td><td>analytischer Standard &ge; 98,0 %</td></tr><tr><td>Hexadecansäure-1-13C (Palmitinsäure)</td><td>Larodan Fine Chemicals</td><td>78-1600</td><td>GC &ge; 98,0 % (13C: 99,0 %)</td></tr><tr><td>RVC 2-25 CDplus</td><td>Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen</td><td></td><td>Kompakter Midi-Konzentrator</td></tr> <tr><td>für den LabortischAlpha 2-4 LDplus</td><td>Martin Christ Gefrier-trocknungsanlagen Trocknungsverteiler</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MZ 2C NT</td><td>Vacuubrand GMBH</td><td></td><td>Vakuumpumpe</td></tr><tr><td>Roto-Shake Genie</td><td>Scientific Industries</td><td></td><td>Kombiniertes Wipp- und Drehgerät</td></tr><tr><td>XP64 Mikrokomparator</td><td>Mettler Toledo</td><td></td><td>Superhochpräzisionswaage</td></tr><tr><td>GC-System 7890A</td><td>Agilent Tech.</td><td></td><td>Gaschromatograph</td></tr><tr><td>7000 GC/MS Triple Quad</td><td>Agilent Tech.</td><td></td><td>Triple Quad Massenspektrometer</td></tr><tr><td>Serie 7683B Injektor</td><td>Agilent Tech.</td><td></td><td>Probeninjektor</td></tr><tr><td>Heraeus Multifuge 3SR+</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Zentrifuge mit 10 ml Röhrchenrotor</td></tr></tbody></table>

fettsäure- 13c isotopologue profilierung gibt einblick in trophische carbon transfer und fettstoffwechsel der wirbellosen verbraucher

Fatty Acid 13C Isotopologue Profiling Provides Insight into Trophic Carbon Transfer and Lipid Metabolism of Invertebrate Consumers

Fettsäuren (FAs) sind nützliche Biomarker im Nahrungsnetz Ökologie, denn sie sind in der Regel als vollständige Molekül assimiliert und in Verbraucher-Gewebe mit Minderjährigen oder keine Änderung, so dass die diätetische routing zwischen verschiedenen trophischen Ebenen übertragen. Der FA-trophische Marker-Ansatz ist allerdings immer noch durch die begrenzte Kenntnisse in Lipidstoffwechsel von der Bodenfauna behindert. Diese Studie verwendete völlig gekennzeichneten Palmitinsäure (13C16:0, 99 % der Atom) als Tracer in Fettsäure-Stoffwechsel Bahnen von zwei weit verbreitete Boden Collembolen, Protaphorura Fimata und Heteromurus Redwood. Um das Schicksal und die metabolischen Veränderungen dieser Vorstufe zu untersuchen, ist eine Methode des Isotopologue profiling vorgestellt, durch Massenspektrometrie mit dem einzelnen Ion monitoring durchgeführt. Darüber hinaus wird die vorgelagerten Labor Fütterungsversuch sowie die Extraktion und die Methylierung von dominanten Lipid Brüche (neutralen Lipiden, Phospholipiden) und die zugehörige Formel und Berechnungen beschrieben. Nicht nur Ausbeute 13C beschriftet Vorläufer die insgesamt 13C-Anreicherung in Fettsäuren abgeleitet sondern produziert auch das Muster der Isotopologues überschreiten die Masse des Ions (d. h. das FA molekularen Ion Elternteil Isotopologue Profilierung M+) jeweils mit der Bezeichnung FA durch eine oder mehrere Masseneinheiten (M+ 1M+ 2M+ 3, etc.). Dieses Wissen erlaubt Rückschlüsse auf das Verhältnis der diätetischen routing von einem völlig verbrauchte FA im Vergleich zu de-Novo -Biosynthese. Die Isotopologue Profilierung empfiehlt sich als ein nützliches Instrument zur Bewertung der Fettsäure-Stoffwechsel in Bodentiere trophische Interaktionen zu entwirren.

Frische Gewicht und Lipid Inhalt der Collembolen Im Laufe des beschriebenen Versuchs änderte der Inhalt in NLFAs und PLFAs deutlich im Laufe der Zeit sich nicht während das Frischgewicht der Proben leicht aber nicht signifikant24erhöht. Beide Parameter zeigen ein hohes Maß an körperlicher Fitness der Collembolen Exemplare. Achten Sie darauf, zu untersuchen, Collembolens frische Gewicht und Lipid Inhalt während des Experiments, die Probenahme-Tag...

Die Fettsäure trophische Marker Ansatz, d. h. die Aufnahme von Fettsäuren als gesamte Molekül und Transfer in das Gewebe der Verbraucher ohne oder geringfügige Änderung, durch Wissenslücken im Fettsäure-Stoffwechsel der kleinen Boden Wirbellosen behindert wird. Isotopologue Profilierung dient als ein wertvolles Instrument zur trophische Interaktionen zu entwirren.

Fettsäure- 13C Isotopologue Profilierung gibt Einblick in trophische Carbon Transfer und Fettstoffwechsel der Wirbellosen Verbraucher

Fatty acids (FAs) are useful biomarkers in food web ecology because they are typically assimilated as a complete molecule and transferred into consumer ...

Das übergeordnete Ziel dieses Isotopologen-Profilings ist es, den trophischen Transfer von Nahrungsfettsäuren bei wirbellosen Konsumenten zu verfolgen, einschließlich ihrer Verarbeitung und ihres Fettstoffwechsels, wie z. B. Kettenverlängerung oder Beta-Oxidation. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen in der Ökologie des Nahrungsnetzes zu beantworten, z. B. wer wen isst, eine Frage, die in einem kryptischen Ökosystem wie dem Boden nicht leicht zu beantworten ist. Die Technik wird von Dilara Simsek, einer Masterstudentin aus dem Labor von Prof. Liliane Ruess, vorgeführt.Um Plastikmikrokosmen mit dicht schließenden Deckeln zuzubereiten, mischen Sie in einem Gipstopf neun Teile Gips aus Paris und einen Teil trockene Aktivkohle. Fügen Sie 10 Teile destilliertes Wasser hinzu und lassen Sie die Mischung fünf Minuten lang ohne Rühren bei Raumtemperatur ruhen. Rühre die Mischung mit einem Laborlöffel im Uhrzeigersinn bei mäßiger Geschwindigkeit um, um Luftblasen zu vermeiden, bis eine dicke, suppige Konsistenz erreicht ist.Gießen Sie dann die Mischung bis zu einer Höhe von etwa einem Zentimeter in die Mikrokosmen. Glätten Sie den Putz, indem Sie leicht auf die Bank klopfen und schwenken. Beachten Sie, dass Löcher aus Luftblasen und Furchen, die mit einem sterilen Spatel hinzugefügt werden, fruchtbare Collembolen dazu ermutigen können, dort Eier abzulegen.In dieser Studie wurden jedoch Löcher und Furchen vermieden, um die gleichen reproduzierbaren Bedingungen zu haben. Nachdem Sie die Mikrokosmen trocknen lassen und dann befeuchtet haben, verwenden Sie ein Saugrohr, das mit einem kleinen Stück Netz versehen ist, um 30 frisch geschlüpfte Collembolen auf den Gipsboden des Mikrokosmen zu übertragen. Stellen Sie etwa eine Messerspitze granulierte Trockenhefe als Nahrung zur Verfügung und erneuern Sie sie mindestens zweimal pro Woche.Planen Sie drei unabhängige Replikate pro Probenahmetag. In dieser Studie wurden die Tage null bis sieben und 14 untersucht. Inkubieren Sie die Mikrokosmen im Dunkeln bei 15 Grad Celsius und halten Sie eine konstante Temperatur, da die Fettsäuren durch den tierischen Stoffwechsel verändert werden, um die Anforderungen an die Membranfluidität zu erfüllen.Um die Tiere zu ernten, werden die Tiere direkt nach dem Wiegen gemäß dem Textprotokoll vorsichtig von den Waagschalen in 10-Milliliter-Reagenzgläser aus Glas umgefüllt. Verwenden Sie einen Milliliter Methanol in HPLC-Qualität, um die Röhrchen zu füllen, und lagern Sie sie bis zur Analyse bei minus 20 Grad Celsius. Nachdem Sie drei Glasreagenzgläser für jede Probencharge vorbereitet und das auf die Proben zur Lagerung aufgetragene Methanol reduziert haben, fügen Sie jeder Probe, einschließlich Leerproben, fünf Milliliter einphasiges Extraktionslösungsmittel hinzu und extrahieren Sie die Collembolan-Lipide bei Raumtemperatur, indem Sie sie über Nacht bei 200 U/min schütteln.Nach der Extraktion der Proben gemäß dem Textprotokoll wird zur Analyse des Fettsäuremusters für jede Probe eine Kieselsäuresäule vorkonditioniert, indem jeder Säule zwei Milliliter Chloroform zugesetzt werden. Nachdem das Chloroform die Säulen passiert hat, verwenden Sie eine Pasteurpipette aus Glas, um die untere Chloroformphase aus den Proben zu entfernen. Übertragen Sie es dann in eine einzelne Spalte.Verwenden Sie fünf Milliliter Chloroform, um die neutralen Lipide (NLFAs) in Fraktionen in einzelne Glasgefäße zu eluieren. Verwenden Sie dann 10 Milliliter Aceton, um die Glykolipide zu eluieren, und fünf Milliliter Methanol, um die Phospholipidfettsäuren oder PLFAs zu eluieren. Nach der Extraktion werden die offenen Röhrchen NLFA und PLFA in einen Rotationsvakuumkonzentrator (RVC) überführt und die Proben bei 60 Grad Celsius in einem Vakuum von 24 hPa für etwa 90 Minuten oder bis zum Trocknen verdampft.Nach der Isolierung und dem Waschen der Fettsäuremethylester (FAMEs) wird die obere lipidhaltige Phase mit einer Pasteur-Glaspipette in ein mit einem Teflonseptum ausgestattetes Probenfläschchen aus Glas mit Chromatographie übertragen. Verkapseln Sie das Fläschchen und lagern Sie es bis zur Analyse bei minus 20 Grad Celsius. Um FAMEs in NFLA- und PLFA-Proben zu identifizieren, richten Sie auf einem GC-FID eine Sequenz mit der entsprechenden Software des Geräts gemäß den Anweisungen des Herstellers ein.Beginnen Sie die Sequenz mit den externen Standardmischungen, gefolgt von den Proben. Bei jedem Durchlauf kommt es zu einer leichten Verzögerung der Elutionszeit der Fettsäuren aus der GC-Säule. Nehmen Sie entweder jeden 10. Durchlauf einen Standard in die Probensequenz auf oder verwenden Sie die Retentionszeitsperre für Palmitinsäure.Stellen Sie das Programm ein und berechnen Sie die nmol der Fettsäure gemäß dem Textprotokoll. Um die Kohlenstoff-13-Analyse durch Isotopologen-Profiling durchzuführen, verwenden Sie eine polare Kapillarsäule, da sie auch bei gleicher Anzahl von Doppelbindungen die Trennung von ungesättigten Fettsäuren ermöglicht. Die Wahl der GC-Säule ist entscheidend für die Ergebnisse, da sie eine gute Repräsentation des Moleküls Ion in den Fettsäuren bestimmt.Starten Sie bei einer DB-23-Säule die Ofentemperatur bei 130 Grad Celsius und erhöhen Sie sie um 6,5 Grad Celsius pro Minute auf 170 Grad Celsius. Anschließend eine Erhöhung um drei Grad Celsius pro Minute auf 203 Grad Celsius vornehmen und 1,9 Minuten lang halten. Fahren Sie dann mit einer Erhöhung um 40 Grad Celsius pro Minute auf 230 Grad Celsius fort und halten Sie die Temperatur 8,3 Minuten lang.Stellen Sie die Temperatur der Transferleitung auf 280 Grad Celsius ein. Nachdem Sie die Programmeinrichtung gemäß dem Textprotokoll abgeschlossen haben, bestimmen Sie den Kohlenstoff-13-Einbau in das Molekülion der Fettsäuren, indem Sie zunächst einen ersten Scan durchführen, um zu sehen, was vorhanden ist. Führen Sie dann die Überwachung ausgewählter Ionen (SIM) für die entsprechenden Ionen aus und erfassen Sie Daten bei interessierenden Molekülmassen, indem Sie m/z-Scan-Fenster oder SIM-Gruppen auswählen, die die chromatographische Spitzenzeit der jeweiligen Fettsäure umfassen.In der Regel werden zwei bis vier Ionen pro Analyt und Zeitfenster überwacht. Für die Massenentwicklung verwenden wir Gesamtionenzahlen mit externen Fettsäurestandards. Basierend auf ihrer Retentionszeit und ihren Fragmentionen werden Zeitsegmente ausgewählt.Weisen Sie das molekulare Ion M plus der jeweiligen Fettsäure und aller ihrer Isotopologen M plus eins, M plus zwei usw. nach. Ordnen Sie den trophischen Kohlenstofffluss, die Position des Kohlenstoff-13-Einbaus, zu und berechnen Sie die Kohlenstoff-13-Anreicherung gemäß dem Textprotokoll. Diese Abbildung zeigt ein SIM-MS-Spektrum von reiner Palmitinsäure von 16 bis null.Die natürliche Häufigkeit von Kohlenstoff-13 in dieser Verbindung wird durch das Vorhandensein von M plus eins und M plus zwei Isotopologen zusätzlich zum Molekülion M plus nachweisbar. Zum Vergleich: Dieses Spektrogramm repräsentiert die gesamte markierte Palmitinsäure. Dabei spiegelt das alleinige Vorkommen des Ions M plus 16 die hohe Reinheit der synthetisch markierten Verbindung wider.Die folgenden SIM-Scans wurden von vier dominanten Fettsäuren in der PLFA-Fraktion von Heteromurus nitidus am ersten Tag nach der Markierung abgeleitet. Die Assimilation des markierten Markermoleküls in Palmitinsäure wird durch die Häufigkeit des M plus 16-Isotopologen sichtbar, da es die gesamte markierte Fettsäure darstellt. Des Weiteren kann eine Entsättigung von 16 bis Null oder eine Dehnung plus Entsättigung zugeordnet werden.Dabei zeigt der Nachweis von Isotopologen, die größer als M plus 16 sind, z.B. M plus 17 und M plus 18, eine Kettenverlängerung des markierten Vorläufers 16 auf Null durch die Verwendung von C2-13-Fragmenten. Hier werden die relativen Anteile der Ionen M plus eins bis M plus drei und M plus 16 bis M plus 20 der fünf am stärksten markierten NLFA und PLFA von Protaphorura fimata dargestellt, geschätzt am Tag Null und am ersten Tag. Bei diesem Verfahren ist zu bedenken, dass Verbraucher von Natur aus bestimmte C-Isotope enthalten.Diese Menge muss in Kontrollversuchen ohne gekennzeichnetes Diät bestimmt werden. Dieses natürliche bestimmte C-Signal wird als Hintergrund von den Etikettenvorlagen subtrahiert. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Lösungsmitteln äußerst gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten.

fatty-acid-13c-isotopologue-profiling-provides-insight-into-trophic

Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Stabile Isotope Profilierung mittels Gaschromatographie-Massenspektrometrie des Vermittlers Stoffwechselflusses ist in dem Fadenwurm...

Stabilen Isotopen Profiling von Intermediary Metabolic Flux in Entwicklungs-und Erwachsenen-Stadium Caenorhabditis elegans</em

Dieses Protokoll demonstriert die Extraktion und Analyse von freien und veresterten bioaktiven Fettsäuren aus Zellen. Fettsäuren werden mittels stabiler Isotopenverdünnung, chiraler Flüssigkeitschromatographie und Elektroneneinfang der atmosphärischen chemischen Ionisation, Mehrfachreaktionsüberwachung, Massenspektrometrie (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS) genau quantifiziert.

Cellular Lipidextraktion für Targeted Stable Isotope Dilution Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie-Analyse

Wir präsentieren robust biochemischen und mikroskopischen Methoden zur...

Biochemische und High Throughput Mikroskopische Beurteilung der Fettmasse in<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Säugetier-Hülle enthält Lösungsmittel extrahierbaren Lipide, die chemischen Zusammensetzungen der einzelnen Arten charakteristisch bieten kann. Dieser Beitrag stellt eine Routinemethode zur Trennung breiten Lipidklassen aus Integumentary Geweben isoliert mit Dünnschicht-Chromatographie und Bestimmung der Triacylglycerid Profil von Matrix-Assisted Laser Desorption / Ionisation Time-of-Flight-Massenspektrometrie.

Profilierung der Triacylglycerid Inhalt in Bat Integumentary Lipide durch präparative Dünnschicht-Chromatographie und MALDI-TOF-Massenspektrometrie

Phospholipid-Fettsäuren liefern Informationen über die Struktur des Bodens mikrobiellen Gemeinschaften. Wir stellen Verfahren zur Extraktion aus Bodenproben mit einem einphasigen Gemisch von Chloroform, Fraktionierung des extrahierten Lipiden Festphasenextraktionssäulen verwendet und Methanolyse Fettsäuremethylester zu erzeugen, die durch Kapillar-Gaschromatographie analysiert.

Extraktion und Analyse von Microbial Phospholipidfettsäuren in Böden

Zebrafische entwickeln sich zu einem wertvollen Modell für die Verarbeitung von Nahrungslipiden und Stoffwechselkrankheiten. Beschrieben werden Protokolle von lipidreichem Larvenfutter, Live-Imaging von fluoreszierenden Lipidanaloga in der Nahrung und die Quantifizierung der Nahrungsaufnahme. Diese Techniken können auf eine Vielzahl von Screening-, Bildgebungs- und hypothesengesteuerten Untersuchungstechniken angewendet werden.

High-fat Feeding Paradigm für Larval Zebrabärbling: Füttern, Live-Imaging und Quantifizierung der Nahrungsaufnahme

Der Artikel beschreibt eine Methode, die den Durchsatz erhöht, während der Aufwand und die Genauigkeit für die Extraktion von Lipiden aus den Zellmembranen von Mikroorganismen zur Verwendung bei der Charakterisierung sowohl der Gesamtlipide als auch der relativen Häufigkeit von Indikatorlipiden zur Bestimmung der mikrobiellen Bodenstruktur in Studien mit vielen Proben ausgeglichen werden.

Eine Lipid-Extraktions- und Analysemethode zur Charakterisierung von Boden-Mikroben in Experimenten mit vielen Proben

Hier hochauflösenden 1 H und 13 C - Kernresonanzspektroskopie (NMR) wurde als ein schnelles und zuverlässiges Werkzeug für die quantitative und qualitative Analyse von verkapselten Fischölergänzungen verwendet.

NMR-Spektroskopie als robustes Werkzeug für die schnelle Bewertung des Lipidprofil von Fischöl

Dieses Protokoll dient zur Bestimmung von Lipiden in Meerwasser und biologischen Proben. Lipide in Filtraten werden mit Chloroform oder Mischungen von Chloroform und Methanol im Falle von Feststoffen extrahiert. Lipidklassen werden durch Stäbchendünnschichtchromatographie mit Flammenionisationsdetektion gemessen und ihre Summe ergibt den Gesamtlipidgehalt.

Bestimmung von Gesamtlipid und Lipidklassen in marinen Proben

In dieser Arbeit stellen wir eine kostengünstige quantitative Methode vor, die Deuteriumoxid- und Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GCMS) zur Analyse der Gesamtfettsäure-De-novo-Lipogenese in braunem Fettgewebe in vivo verwendet.

Quantitative Bestimmung der de novo Fettsäuresynthese im braunen Fettgewebe mittels Deuteriumoxid

Hier wird eine Methode zum Screening von Lipidstrukturen durch Markierung stabiler Isotope unter Verwendung ihrer Retentionszeit, Mobilität und Fragmentierung vorgestellt.

De-novo-Verfolgung von Lipiden mittels stabiler Isotopenmarkierung LC-TIMS-TOF MS/MS

Lernen Sie die Isotopologen-Profilierung zur Untersuchung des trophischen Fettsäure-Transfers bei wirbellosen Bodentieren. Diese Methode erfasst Lipidstoffwechselprozesse wie Kettenverlängerung und Beta-Oxidation.

Fettsäure- 13C Isotopologue Profilierung gibt Einblick in trophische Carbon Transfer und Fettstoffwechsel der Wirbellosen Verbraucher (Video) | JoVE Journal

Fettsäure- ¹³C Isotopologue Profilierung gibt Einblick in trophische Carbon Transfer und Fettstoffwechsel der Wirbellosen Verbraucher

Weitere Videos entdecken