Name: Zweistufigen Ansatz - und Ende-Frühstadium der Orgel Formation im Vogelgrippe-Modell zu erkunden: die Thymusdrüse und Nebenschilddrüsen Organogenese Paradigma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 43 s
Description: Erfahren Sie einen zweistufigen Ansatz zur Untersuchung der Organogenese mit in-vitro-Kultur und in-ovo-Transplantation am Hühnermodell. Diese Methode ermöglicht die Analyse früher und später Entwicklungsstadien.

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Die Autoren sind António Cidadão, Isabel Alcobia und Leonor Parreira dankbar für die kritische Lektüre des Manuskripts zu Padma Akkapeddi für video Erzählung und Vitor Proa aus der Histologie-Service des Instituto de Histologia e Biologia zufügen Desenvolvimento, Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa, für den technischen Support. Wir sind insbesondere verpflichtet, Paulo Caeiro und Hugo Silva aus Unidade de Audiovisuais (Referat audiovisuelle Medien), Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa für ihr herausragendes Engagement für die Produktion von diesem Video. Wir anerkennen Leica Microsystems freundlicherweise dafür ein Stereoskop ausgestattet mit video-System und Interaves - Sociedade Agro-Pecuária, S.A. für den Beitrag mit Wachteln Eier befruchtet. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa (FMUL).

Alle diese Experimente zu folgen, die Pflege der Tiere und ethischen Richtlinien des Centro Académico de Medicina de Lisboa.
1. Inkubation von befruchteten Wachteln und Hühnereier
<ol><li>Inkubieren Sie japanischen Wachtel (Coturnix Coturnix Japonica) und (Gallus Gallus) befruchteten Huhneier 3 und 8 Tagen, beziehungsweise.<ol>
<li>Legen Sie die Eier mit der Luftkammer (Ei stumpfen Ende) nach oben in einem befeuchteten Inkubator bei 38 ° C.</li>
		<li>Verwenden Sie rund 20 Wachteleier und 40 Hühnereier, um dieses Experiment durchzuführen. Hinweis: Diese Zahlen sollte verdoppelt werden, wenn dieses Verfahren zum ersten Mal zur Gründung.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Isolierung der Wachtel embryonalen Region mit mutmaßlichen Gebietder Zebrafischembryonen und Nebenschilddrüse Grundlagen
Hinweis: Führen Sie Ei Manipulation Verfahren unter sterilen Bedingungen mit einer horizontalen Laminar-Flow-Kapuze und sterilisierte Instrumente und Materialien.
<ol><li>Vorbereiten eine großen Borosilikat Glasschüssel über 3/4 gefüllt mit kaltem Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) Lösung.</li>
	<li>Öffnen Sie ein Wachtelei nach 3 Tagen Inkubationszeit, indem Sie auf die Schale und schneiden eine kreisförmige Öffnung auf der gegenüberliegenden Seite des stumpfen Ende mit gebogenen Schere. Sorgfältig entfernen Sie, Schale und übertragen Sie den Embryo auf die Glasschale gefüllt mit kaltem PBS.</li>
	<li>Halten Sie den Embryo Wachtel (Q) auf der E3 (qE3) (Wachtel Etappe entspricht der HH-Bühne 21 des Huhns) mit Hilfe von dünnen Zange. Machen Sie einen Schnitt in der dotterhäutchen Membran umhüllt das Eigelb mit einer gebogenen Schere. Weiter, um auch extern an den Umfang der extraembryonalen Schiffe zu schneiden.</li>
	<li>Transfer des Embryos zu einer kleinen Schüssel ca. 3/4 gefüllt mit kaltem PBS mit Hilfe von dünnen Zange. Den Embryo aus dem restlichen angeschlossenen Dotter gründlich zu waschen.</li>
	<li>Verwenden einen Skimmer, um den Embryo zu einem 100 mm Glas Petrischale mit schwarzem Sockel zu übertragen (siehe Tabelle der Materialien) mit 10 mL kaltem PBS.</li>
	<li>Ort der Petrischale unter einem Stereomikroskop. Hinweis: Ab diesem Punkt führen Sie die Mikrochirurgie Verfahren unter einem Stereomikroskop für progressive Vergrößerung. Als eine Beleuchtungsquelle ist es ratsam, LED-Leuchten im Stereomikroskop oder in der optischen Fasern aufgenommen, in Anbetracht der begrenzten Wärmelast verwenden.</li>
	<li>Den Embryo an der Unterseite der Platte mit dünnen Insekt Stifte zu halten. Platzieren von vier Pins bilden eine quadratische Form der extraembryonalen Region.</li>
	<li>Die extraembryonalen Membranen der cephalic Region mit Hilfe von dünnen Zange zu entfernen und dort eine fünfte Pin. Hinweis: Wenn der Embryo korrekt positioniert ist, sollte dann Gleichheitspartei Vesikel, das Herz Rohr, und die 1St2Ndund 3rd pharyngealen Bögen (PAs) sichtbar.</li>
	<li>Die embryonale Region of Interest, d. h., 3rd und 4th pharyngealen Bogen Region (3/4PAR), mit Wecker Auge Schere zu sezieren.<ol>
<li>Fang an zu schneiden längs und parallel zu der Embryo-Achse zwischen der Somiten/neuralen Schlauch und PAs.</li>
		<li>Entfernen Sie das ventral positionierte Herz Rohr durch Schneiden. Halten die Schere in der gleichen Position, drehen Sie die Petrischale um den Embryo entsprechend der Richtung des Schnittes zu positionieren.</li>
		<li>Schneiden Sie zwischen den 2Nd und 3rd PAs und unterhalb der 4th PA</li>
		<li>Die übrigen Membranen aus 3/4PAR mit Hilfe von dünnen Zange zu lösen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aspirieren Sie die isolierte Gewebe (3/4PAR) und den Transfer zu einer Glasschale 3/4 mit kaltem PBS mit einer 2 mL sterile Kunststoff Pipette gefüllt. Hinweis: Im folgenden Geweben können angebaut in-vitro- bis zu 48 Stunden oder sofort die CAM ein Huhn Embryo in E8 aufgepfropft werden.</li>
	<li>Halten Sie die Glasschale mit isolierten 3/4PAR auf Eis während der Vorbereitung des in-vitro- Tests.</li>
</ol>3. in Vitro organotypischen Assay: Kultur der embryonalen Region mit mutmaßlichen Gebietder Zebrafischembryonen und Nebenschilddrüse Grundlagen
<ol><li>Bereiten Sie das Kulturmedium mit RPMI-1640 Medium mit 10 % FBS und 1 % Penicillin/Streptomycin ergänzt. Hinweis: Lösliche pharmakologische Reagenzien können auf das Medium (z. B. LY-411.575 (Ly) und di-Benzazepine oder Cyclopamine und Vismodegib, Kerbe und Igel (Hh) Signalwege, bzw. zu hemmen. hinzugefügt werden Für diesen Test 50-200 nM von Ly oder 5-15 µM der Di-Benzazepine um zu hemmen, Kerbe signalisieren in den 3 4PAR. verwenden / 20 µM Cyclopamine oder 10 µM von Vismodegib Hh Signalisierung in der 3/4PAR-5zu hemmen.</li>
	<li>Bereiten Sie die in-vitro- Kultur von 3/4PP Explant in einem 6-Well-Platte.<ol>
<li>Füllen Sie einen Brunnen aus dem 6-Well-Platte mit 5 mL Kulturmedium. Legen Sie eine 24 mm Polycarbonat Membran einfügen (siehe Tabelle der Materialien) mit Hilfe von dünnen Zange gut.</li>
		<li>Unter dem Stereomikroskop übertragen 3/4PAR Explant aus der Glasschale auf der Membranoberfläche indem Sie sanft mit Hilfe einer Transplantation Löffel (oder Spachtel) und dünne Zange. Legen Sie die Explantate mit der ventralen Seite nach oben und der dorsalen Seite in Kontakt mit der Membran. Fügen Sie bis zu sieben Explantaten pro Membran einfügen. Fahren Sie mit Schritt 3.4.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Alternativ explants Kultur in schwimmenden Membranfilter.<ol>
<li>Bereiten Sie eine 35 mm Petrischale mit 5 mL Kulturmedium. Mit Hilfe von dünnen Zange, Schwimmer eine Membran Filtern (siehe Tabelle der Materialien) und eine trockene Oberfläche Kontakt mit der Luft zu halten.</li>
		<li>Unter dem Stereomikroskop transfer 3/4PAR Explant aus der Glasschale zum Membranfilter durch sanftes Gleiten mit Hilfe einer Transplantation Löffel (oder Spachtel) und dünne Zange. Legen Sie die Explantate mit der ventralen Seite nach oben und der dorsalen Seite in Kontakt mit der Membran. Fügen Sie bis zu 8 Explantaten pro Membranfilter.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Legen Sie vorsichtig die Explantaten in 3.2 und 3.3 in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C mit 5 % CO2Schritte vorbereitet.</li>
	<li>Nach einer Inkubationszeit von 48 h 6-Well-Platte und die 35 mm Petrischale aus dem Inkubator zu entfernen.<ol>
<li>Sammeln Sie die kultivierten Explantaten aus der Membran-Einsatz von 6-Well-Platte.<ol>
<li>Die Membran einfügen PBS bei Raumtemperatur (RT) hinzufügen.</li>
			<li>Nehmen Sie Explantaten aus der Membran durch kräftiges Spülen mit einer 2 mL sterile Kunststoff-Pipette ab.</li>
			<li>Übertragen Sie mit Hilfe von Spachtel und dünne Zange die kultivierten Explantaten zu einer Glasschale 3/4 gefüllt mit PBS bei RT</li>
		</ol>
</li>
		<li>Ebenso sammeln Sie die kultivierten Explantaten von schwimmenden Membranfilter in 35 mm Petrischale.<ol>
<li>Membranfilter mit dünnen Pinzette zu übertragen, um eine neue 35 mm Petrischale gefüllt mit PBS bei RT</li>
			<li>Nehmen Sie Explantaten aus dem Membranfilter durch kräftig Pipettieren mit einer 2 mL sterile Kunststoff Pipette ab.</li>
			<li>Tilgen Sie mit Hilfe von dünnen Zange Explant-freie Membranfilter, nachdem bestätigt wird, dass keine Explantaten blieb daran befestigt.</li>
			<li>Übertragen Sie mit einem Spatel und dünne Zange die Explantaten auf einer Glasschale gefüllt mit PBS bei RT</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Die kultivierten Explantaten mit einem Spatel zu 1 mL Reagenz für total RNA Isolierung zu übertragen und verwenden für Genexpression Studien. Vorsicht: Dieses Reagenz kann (siehe Tabelle der Materialien) ein ernstes Gesundheitsrisiko sein. Tragen Sie geeignete Schutzbrille, Kleidung und Handschuhe. Befolgen Sie die Handhabung und lesen Sie die Sicherheitsdatenblätter des Herstellers zu.</li>
	<li>Alternativ Transplantat der kultivierten Gewebe auf CAM von Hühnerembryos am E8. Folgen Sie mit Schritt 4 fort.</li>
</ol>4. Vorbereitung der CAM
<ol><li>Entfernen Sie die Hühnereier mit 8 Tagen Embryonalentwicklung aus dem Inkubator. Hinweis: Eier wurden mit Luftkammer mit Blick nach oben bei 38 ° C in einem befeuchteten Inkubator inkubiert.</li>
	<li>Decken Sie die stumpfe Ende des Eies mit durchsichtigen Klebeband zu verhindern, dass Teile der Schale fallen in die Luftkammer. Tippen Sie auf die Schale und geschnitten Sie eine kreisförmige Öffnung in das Ei mit gebogenen Schere. Die Luftkammer sollte sichtbar sein.</li>
	<li>Entfernen Sie mit Vorsicht die weiße Membran der Luftkammer mit dünnen Pinzette. CAM ist dann sichtbar und zugänglich für ektopische Gewebetransplantation. Hinweis: Verwenden Sie nicht PBS Hydrat der CAM, vor oder nach der Transplantation, da PBS Gleit- und Abhandenkommen der Explantate fördert. Wenn die Membran austrocknet, verwerfen Sie das Ei.</li>
</ol>(5) Pfropfen von kultivierten Explantaten auf der CAM
<ol><li>Erstellen Sie kleine vaskuläre Läsionen/Wunden in den kleineren Gefäßen des Nockens mit einer Microscalpel in einer Halterung. Hinweis: Verwenden Sie die Spitze einer Pasteurpipette, um Blut durch Kapillarität bei übermäßige Blutungen zu entfernen.</li>
	<li>Verwenden Sie einen Spachtel und dünne Zange um kultivierten Explant auf den verletzten Bereich des Nockens übertragen.</li>
	<li>Schneiden Sie ein Stück von einem Filterpapier etwas größer als die modellabhängigen und legen Sie es auf der Oberseite der modellabhängigen. Hinweis: Das Filterpapier hilft Verfolgung der modellabhängigen Position nach seiner Entwicklung in der CAM. Es erlaubt auch tägliche Drug-Delivery, die modellabhängigen Entwicklungsphase in Ovo , bei Bedarf (im Schritt 5.6 beschrieben).</li>
	<li>Das Ei-Fenster mit durchsichtigen Klebeband verschließen und mit einem Kohlestift identifizieren. Hinweis: Das Kunststoffband schützt den Embryo vor Austrocknung während der Inkubationszeit.</li>
	<li>Inkubieren Sie das manipulierte Ei für 10 Tage in einem befeuchteten Inkubator bei 38 ° c Folgen Sie mit Schritt 6 fort.</li>
	<li>Optionaler Schritt: Tägliche Gesundheitsbehörde während der Inkubationszeit.<ol>
<li>Um den Filter zu gelangen, heben Sie teilweise das Kunststoffband auf. Fügen Sie 100 µL medikamentenlösung, Tropfen für Tropfen auf dem Papier. Verschließen Sie das Fenster wieder zu und das Ei wieder in den befeuchteten Inkubator bei 38 ° C. Hinweis: Für diesen Test wird die Dosis von 20 µM Cyclopamine hemmen Hh Signalisierung während in Ovo Entwicklung5.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(6) ektopische Orgel Formation im Camchat nach 10 Tagen In Ovo Entwicklung
<ol><li>Entfernen Sie nach 10 Tagen Inkubation das Ei aus dem Inkubator und ziehen Sie sorgfältig das Kunststoffband.</li>
	<li>Schneiden Sie die CAM rund um die Filter-Region mit gebogenen Schere und Übertragung der CAM abgeleitet Explant mit Filterpapier auf ein kleines Glas Schüssel ca. 3/4 gefüllt mit kaltem PBS.</li>
	<li>Übertragen Sie mit Hilfe von dünnen Zange die CAM abgeleitet Explant mit einem 100 mm Petrischale mit schwarzen Sockel mit 10 mL PBS. Entfernen Sie vorsichtig das Filterpapier und der Überschuß der Membran mit Wecker Auge Schere und dünne Zange.</li>
	<li>CAM-Explant Fixativ Lösung zu übertragen (3,7 % PFA mit PBS-Puffer) mit einem Schaumlöffel. Einschläfern der Hühnerembryos ohne herausnehmen aus dem Ei durch einen präzisen Schnitt in den Hals-Bereich des Embryos mit Hilfe der großen Schere machen.</li>
	<li>Beurteilen Sie die Orgel-Bildung in Paraffin Abschnitten des CAM-abgeleitete Explantaten durch konventionelle Histologie und Immunhistochemie.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Ein wesentlicher Aspekt für den Erfolg dieser Methode ist die Qualität der Hühner und Wachteln Eier. In Anbetracht der langen Inkubationszeiten, besonders während der in Ovo Test, eine gute Qualität von Hühnereiern verbessert Preise Lebensfähigkeit (bis zu 90 %) durch das Ende des Verfahrens. Um dies zu erreichen, Eier von verschiedenen Herstellern zu testen. Brüten unmanipuliertes Eier über einen längeren Zeitraum (bis zu 16-17 Tage) und ihre Entwicklung zu überprüfen. Um eine gute Qualität-Charge in Betracht g...

Vogelgrippe Embryonen haben in zukunftsträchtigen Entwicklungsbiologie Studien verbreitet wurde. Die Hauptvorteile des Aviären Modells gehören die Möglichkeit zum Öffnen der Eier, die relativ einfachen Zugang zu den Embryo und die Fähigkeit, Mikromanipulation durchführen. Einige Beispiele umfassen die klassischen Wachtel-Huhn-Chimäre-System für das Studium Zelle Schicksal1, Anwendung von speziellen Wachstumsfaktoren der Embryo2und das Wachstum der ektopische Zellstrukturen in der CAM1,3, 4.
Um neue Einblicke in verschiedene Stadien der Orgel Formation zu erhalten, haben wir vor kurzem eine Methode entwickelt die Pfropfen Techniken mit in-vitro- Manipulation von embryonalen Gewebe5verbindet. Die zweistufigen Ansatz ermöglicht die Diskriminierung und Exploration von beiden frühen - und -spätstadien der Organogenese, die oft aufgrund der sehr dynamischen und komplexen Gewebe Interaktionen2begrenzt werden. Darüber hinaus das Fehlen von geeigneten Gewebe-spezifische Marker häufig schränkt die Verwendung von gentechnisch veränderten Tiermodelle6. Diese neuartige Methode der zweistufigen Ansatz überwindet weitgehend solche Beschränkungen.
Frühstadium der Orgel Formation, in einem ersten Schritt untersuchen die Wachtel embryonalen Gebiet bestehend aus prospektiven Orgel Rudiment isoliert und gewachsen in einem in Vitro organotypischen System für 48 h. Während dieser Zeit kann pharmakologische Modulation der spezifische Signalwege durch Hinzufügen von Drogen auf das Kulturmedium5,7durchgeführt werden. Darüber hinaus kultivierten Gewebe gesammelt zu irgendeinem Zeitpunkt des in-vitro- Wachstum und sondiert für Genexpression (mit Methoden wie qPCR, Microarrays, etc.).
Im zweiten Schritt 48 h-kultivierte Gewebe sind dann auf der CAM ein Huhn (c) Embryo im embryonalen Tag (E) 8 (cE8) gepfropft (Hamburger und Hamilton (HH)-Etappen 33-35)8. Die CAM verhält sich wie eine vaskuläre Lieferant von Nährstoffen und Gas Austausch1,3,4 , veredelte Gewebe ermöglicht seine Entwicklung in Ovo für längere Zeit erlaubt. Diese experimentelle Schritt ist besonders gut geeignet um spätstadien der Organogenese zu studieren als voll ausgebildete Organe nach 10 Tagen in Ovo Entwicklung5,9,10,11 gewonnen werden können . Morphologische Analyse erfolgt einfach durch konventionelle Histologie, angemessene Orgel Formation zu bestätigen und Spender Ursprung der Zellen durch Immunhistochemie mit Spezies-spezifische Antikörper (d.h., MAb Wachtel perinukleäre (QCPN)) identifiziert werden kann. Während der Inkubationszeit CAM können Transplantate auch in Anwesenheit von pharmakologischen Wirkstoffen angebaut und in jedem Stadium der Entwicklung, das Fortschreiten der Organogenese bewerten gesammelt werden.
Der hier beschriebene, in die Tiefe, zweistufigen Ansatz hat bereits in Figueiredo Et Al. beschäftigt 5 die Vogelgrippe Nebenschilddrüse/Thymus gemeinsame Primordium Entwicklung zu erkunden. Dementsprechend werden die inhärenten Besonderheiten der embryonalen Gebiete und Entwicklungsstadien der Organogenese beteiligt der Thymus und Nebenschilddrüsen unter vorgestellt.
Der Thymus und Nebenschilddrüsen Epithelien, entstammen zwar funktionell verschiedene, das Entoderm pharyngealen Beutel (PP)12. Stammen Vogelgrippe, die Epithelien dieser Organe aus der dritten und vierten PP Entoderm (3/4PP)12, während bei Säugetieren das zebrafischembryonen Epithel der 3PP entstammt und das Epithel der Nebenschilddrüsen aus dem 3PP und 3/4PP bei Maus und Mensch stammt, jeweils13,14.
Eines der frühesten Stadien bei der Bildung dieser Organe ist die Entstehung von diskreten Thymus und Nebenschilddrüse Domains in der gemeinsamen Primordium. Bei Hühnern können diese Domains von in Situ Hybridisierung mit spezifischen molekularen Markern, am E4.515identifiziert werden. Während Entwicklung voranschreitet, diese Orgel Rudimente individualisieren und aus dem Rachen zu trennen, während eine dünne Mesenchymale Kapsel, durch Neuralleiste stammenden Zellen gebildet, die sie (bei E5 umgibt; HH-stage-27). Später das zebrafischembryonen Epithel von hämatopoetischen Vorläuferzellen (bei E6.5; kolonisiert HH-stage 30)12.
Wie in Altertumswissenschaften Wachtel-Huhn1,12ist der zweistufigen Ansatz besonders nützlich, um die Bildung der hämatopoetischen/lymphatischen Organe, nämlich den Thymus5untersuchen. Da die Wachteln mit der Orgel Rudiment explant veredelt im Huhn Embryo vor der hämatopoetischen Vorläuferzellen Zelle Kolonisation, entsteht eine Chimäre Thymus mit Huhn Blut übertragbare Vorläuferzellen Wachtel zebrafischembryonen epithelialen Gegenstück zu infiltrieren. Diese Methode ist daher ein nützliches Werkzeug, um den Beitrag der hämatopoetischen Zellen in der Entwicklung des Aviären Hämato/lymphatischen Systems zu erkunden.

<table><tbody><tr><td>Mit Hühnern befruchtete Eier (Gallus gallus)</td><td>Pintobar, Portugal</td><td></td><td>Geflügelzucht&nbsp;</td></tr><tr><td>Mit Wachteln befruchtete Eier (Coturnix coturnix)</td><td>Interaves, Portugal</td><td></td><td>Vogelfarm&nbsp;</td></tr><tr><td>15 mL PP Zentrifugenröhrchen</td><td>Corning</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>50 mL PP Zentrifugenröhrchen</td><td>Corning</td><td>430290</td><td></td></tr><tr><td>60 x 20 mm Pyrexschalen</td><td>Duran Gruppe</td><td>21 755 41</td><td></td></tr><tr><td>100 x 20 mm Pyrexschalen</td><td>Duran Gruppe</td><td>21 755 48</td><td></td></tr><tr><td>Polycarbonat Membraneinsatz</td><td>Corning</td><td>3412</td><td>24 mm Transwell mit 0,4 mm Poren-Polycarbonat-Membraneinsatz&nbsp;</td></tr><tr><td>Membranfilter</td><td>Millipore</td><td>DTTP01300</td><td>0,6 mm Isopore Membranfilter</td></tr><tr><td>6-Well-Kulturplatten</td><td>Nunc, Thermo Fisher Scientific</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>Petrischale, 35 x 10 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5112&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pyrex-Schalen</td><td></td><td></td><td>aus dem Supermarkt&nbsp;</td></tr><tr><td>Transferpipetten</td><td>Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific</td><td>2041S</td><td>2 mL Kunststoffpipette</td></tr><tr><td>Glaspasteurpipette</td><td>normax</td><td>5426015</td><td></td></tr><tr><td>Whatman&nbsp; qualitatives Filterpapier</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHA1001090</td><td>Filterpapier</td></tr><tr><td>durchsichtiges Kunststoffband</td><td></td><td></td><td>aus dem Supermarkt&nbsp;</td></tr><tr><td>Cytokeratin (pan; sauer und basisch, Typ I und II Cytokeratine), Klon Lu-5</td><td>BMA Biomedicals</td><td>T-1302</td><td></td></tr><tr><td>Cyclopaminhydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4116</td><td>Pharmakologischer Inhibitor des Hh-Signalwegs</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Standart FBS</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>GIBCO, Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>QCPN</td><td>Antikörper-Entwicklungsstudien Hybridoma Bank</td><td>QCPN</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Ergänzung&nbsp;</td><td>GIBCO, Thermo Fisher</td><td>Scientific 61870010</td><td></td></tr><tr><td>Bluesil RTV141A/B Silikonelastomer 1,1 kg Kit</td><td>ELKEM/Silmid</td><td>RH141001KG</td><td>Zur Vorbereitung der hinteren Basis für die Petrischale</td></tr><tr><td>Stemolecule LY411575</td><td>Stemgent</td><td>04-0054</td><td>Pharmakologischer Inhibitor des Notch-Signalwegs</td></tr><tr><td>TRIzol Reagenz</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td><td>15596026</td><td>Reagenz für die vollständige RNA-Isolierung</td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinzetten</td><td>Fine Science Werkzeuge</td><td>11251-30&nbsp;</td><td>Dünne Pinzette</td></tr><tr><td>Extra feine Bonn Schere, gebogen</td><td>Fine Science Tools</td><td>14085-08</td><td>Gebogene Schere</td></tr><tr><td>Insektenstifte&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>26001-30</td><td></td></tr><tr><td>Mikrospatel&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>10087-12</td><td>Transplantationslöffel</td></tr><tr><td>Minutien Pins</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-20</td><td>Microscalpel</td></tr><tr><td>Moria Vernickelter Stifthalter</td><td>Fine Science Tools</td><td>26016-12</td><td>Halter</td></tr><tr><td>Moria Perforierter Löffel</td><td>Fine Science Tools</td><td>10370-17</td><td>Skimmer</td></tr><tr><td>Wecker Augenschere</td><td>Fine Science Tools</td><td>15010-11</td><td></td></tr><tr><td>Kamera</td><td>Leica Microsystems&nbsp;</td><td>MC170 HD-Stereoskop</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Leica Microsystems&nbsp;</td><td>Leica M80</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Leica Microsystems&nbsp;</td><td>DM2500</td><td></td></tr></tbody></table>

zweistufigen ansatz - und ende-frühstadium der orgel formation im vogelgrippe-modell zu erkunden: die thymusdrüse und nebenschilddrüsen organogenese paradigma

Two-step Approach to Explore Early- and Late-stages of Organ Formation in the Avian Model: The Thymus and Parathyroid Glands Organogenesis Paradigm

Die Vogelgrippe Embryo wurde als ein experimentelles Modell von größter Bedeutung für die bahnbrechenden Entdeckungen in der Entwicklungsbiologie. Mehrere Ansätze, die Bildung von Wachteln-Huhn Chimären und die Verwendung der chorioallantoic Membrane (CAM), die Entwicklung von ektopische Gewebe reichen zurück bis in das letzte Jahrhundert zu erhalten. Heute bietet die Kombination aus diesen klassischen Techniken mit den letzten in-vitro- Methoden neuartige Perspektiven um Orgel Bildung weiter zu erforschen.
Hier beschreiben wir ein zweistufiges Konzept um - und Ende-Frühstadium der Organogenese zu studieren. Kurz, ist die embryonale Region mit dem mutmaßlichen Gebiet der Orgel von Wachteln Embryonen und angebaut in Vitro isoliert in einem organotypischen System (bis zu 48 Stunden). Kultivierten Gewebe sind anschließend auf der CAM ein Huhn Embryos gepfropft. Nach 10 Tagen in Ovo Entwicklung sind voll ausgebildete Organe veredelte Gewebe entnommen. Diese Methode ermöglicht auch die Modulation der Signalwege durch die regelmäßige Verabreichung von pharmakologischen Wirkstoffen und Genmanipulation der Gewebe im gesamten in-vitro- und in Ovo Entwicklungsschritte. Darüber hinaus kann Gewebe entwickeln bei jedem Zeitfenster zur Analyse ihrer Genexpression Profil (mit quantitativen PCR (qPCR), Microarrays, etc.) und Morphologie (bewertet mit konventionellen Histologie und Immundiagnostik) gesammelt werden.
Die experimentelle Prozedur dient als ein Werkzeug Orgel Bildung außerhalb der Vogelgrippe Embryo, von den frühen Stadien der Organogenese, voll ausgebildet und funktionelle Organe folgen.

Die oben beschriebenen Protokolldetails eine Methode, die Untersuchung der beiden frühen - und -spätstadien der Organogenese, oft begrenzt durch komplexe zelluläre und molekulare Interaktionen ermöglicht.
Diese Methode war zuvor in Figueiredo Et Al. beschäftigt. 5 , die Rolle der Kerbe und Hh-Signalisierung bei der Vogelgrippe Nebenschilddrüse/Thymus gemeinsame Primordium Entwicklung zu entwirren...

Dieser Artikel enthält einen aktualisierten Ansatz zum klassischen Wachtel-Huhn-Chimäre System Orgel Formation, zu studieren, durch die Kombination von neuartige in-vitro- und in Ovo experimentellen Verfahren.

Zweistufigen Ansatz - und Ende-Frühstadium der Orgel Formation im Vogelgrippe-Modell zu erkunden: die Thymusdrüse und Nebenschilddrüsen Organogenese Paradigma

The avian embryo, as an experimental model, has been of utmost importance for seminal discoveries in developmental biology. Among several approaches, the ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, einen zweistufigen Ansatz zur Untersuchung der frühen und späten Stadien der Organogenese zu bieten, indem die In-vitro-Manipulation von embryonalem Gewebe mit In-Ovo-Transplantationstechniken unter Verwendung des Vogelmodells kombiniert wird. Bei dieser Methode wird das embryonale Territorium, das das prospektive Organrudiment umfasst, isoliert und in einem organotypischen System für 48 Stunden gezüchtet. Durch die Nachahmung der normalen Entwicklung ermöglicht dieser In-vitro-Ansatz einen einfachen Zugang zu embryonalen Territorien, ohne dass spezifische molekulare Marker erforderlich sind, und ermöglicht die experimentelle Manipulation früher Entwicklungsstadien in der Organbildung, die auf hochdynamischen räumlichen Modifikationen und komplexen Gewebeinteraktionen beruhen.Dann wird kultiviertes Gewebe auf die chorioallantoische Membran eines Hühnerembryos transplantiert. Die chorioallantoische Membran verhält sich als vaskulärer Nährstofflieferant und ermöglicht den Gasaustausch zu den transplantierten Geweben, was ihre Entwicklung im Ovo ermöglicht. Dieser Schritt eignet sich besonders gut für die Untersuchung später Stadien der Organogenese, da nach 10 Tagen In-Ovo-Entwicklung vollständig ausgebildete Organe erreicht werden können.Darüber hinaus können pharmakologische Wirkstoffe entlang der in vitro und in ovo Entwicklung verabreicht werden, was eine entwicklungsstadienspezifische Modulation der Signalwege ermöglicht. Letztendlich können die sich entwickelnden Gewebe in jedem Zeitfenster entnommen werden, um das Fortschreiten der Organogenese zu bewerten und auf Genexpression und morphologische Merkmale zu analysieren. Durch die Verfolgung der Organbildung außerhalb des Vogelembryos kann diese Methode dazu beitragen, Schlüsselfragen der Entwicklungsbiologie zu klären, wie z. B. die Identifizierung der Signale, die an den verschiedenen Schritten der Organbildung beteiligt sind.Dieses experimentelle Verfahren soll am Beispiel der Organogenese des Thymus und der Nebenschilddrüsen veranschaulicht werden. Bei Vögeln stammen die Epithelien dieser Organe von einem endodermalen gemeinsamen Primordium des dritten und vierten Pharynxbeutels ab und treten als diskrete Domänen um den embryonalen Tag vier bei den Wachteln und vier/fünf beim Huhn auf. Im Laufe der Entwicklung individualisieren sich die Grundlagen des Organs und trennen sich vom Rachen.Später in der Entwicklung wird das Thymusepithel von hämatopoetischen Vorläuferzellen besiedelt. Die hier vorgestellte Methode beginnt mit der Isolierung des embryonalen Territoriums der Wachtel, das das mutmaßliche Territorium dieser Organe enthält, d.h. der Rachenregion, die den dritten und vierten Bogen am dritten embryonalen Tag enthält. Befruchtete Wachteleier wurden mit der Luftkammer nach oben drei Tage lang bei 38 Grad Celsius in einem befeuchteten Brutkasten bebrütet.Zu Beginn die Wachteleier aus dem Brutkasten nehmen. Führen Sie Eimanipulationsverfahren unter sterilen Bedingungen mit einer horizontalen Laminar-Flow-Haube und sterilisierten Instrumenten und Materialien durch. Bereiten Sie eine große Pyrex-Schüssel vor, die mit kaltem PBS gefüllt ist.Öffnen Sie mit einer gebogenen Schere das Wachtelei, indem Sie auf die Schale klopfen und eine kreisförmige Öffnung in die gegenüberliegende Seite der Luftkammer schneiden. Gießen Sie den Embryo vorsichtig in die Schale. Halten Sie den Embryo in einer dünnen Pinzette und machen Sie mit Hilfe der gebogenen Schere einen Schnitt in die Vitellinmembran, die das Joch umgibt.Schneiden Sie um und außerhalb des Umfangs der extraembryonalen Gefäße in einer kontinuierlichen Bewegung. Übertragen Sie den Embryo in eine kleine Schüssel mit kaltem PBS. Verwenden Sie dann einen Abschäumer, um den Embryo in eine Pyrex-Petrischale mit schwarzer Basis zu übertragen, die kaltes PBS enthält.Halten Sie den Embryo unter einem Stereomikroskop mit dünnen Insektennadeln an den Boden der Platte. Platzieren Sie vier Stifte, die eine quadratische Form bilden, in der extraembryonalen Region. Entfernen Sie mit einer Pinzette die überschüssigen embryonalen Membranen der Kopfregion und setzen Sie dort einen fünften Stift ein.Nun ist der Embryo richtig positioniert und das Vesikel oticus, der Herzschlauch sowie der erste, zweite und dritte Rachenbogen sind sichtbar. Beginnen Sie, die Region von Interesse, d. h. die dritte und vierte Pharynxbogenregion, mit einer Wecker-Augenschere zu präparieren. Machen Sie einen Schnitt in Längsrichtung und parallel zur Embryonalachse zwischen dem Bereich der Somiten und des Neuralrohrs und den Rachenbögen.Entfernen Sie dann den ventral positionierten Herzschlauch, indem Sie ihn abschneiden. Halten Sie die Schere in der gleichen Position, drehen Sie die Petrischale, um den Embryo entsprechend der Schnittrichtung neu zu positionieren. Zum Schluss zwischen dem zweiten und dritten Rachenbogen und unterhalb des vierten Rachenbogens schneiden.Aspirieren Sie das isolierte Gewebe und geben Sie es mit einer sterilen Kunststoffpipette in eine mit kaltem PBS gefüllte Glasschale. Bewahren Sie es während der Vorbereitung des In-vitro-Assays auf Eis auf. Füllen Sie eine Vertiefung aus einer Sechs-Well-Platte mit 5 mL Nährmedium und setzen Sie eine Polycarbonat-Membraneinlage auf die Vertiefung.Unter dem Stereomikroskop übertragen Sie das Explantat durch sanftes Gleiten mit Hilfe eines Spachtels und einer Pinzette von der Glasschale auf die Membranoberfläche. Alternativ können Explantate in schwimmenden Membranfiltern kultiviert werden. Bereiten Sie für dieses Verfahren eine 35-Millimeter-Petrischale mit 5 mL Nährmedium vor.Verwenden Sie eine Pinzette, um den Membranfilter schwimmen zu lassen, so dass eine trockene Oberfläche mit Luft in Kontakt kommt. Übertragen Sie das Explantat wie zuvor durch leichtes Gleiten aus der Glasschale auf die Membranoberfläche. Die Explantate sollten mit der Bauchseite nach oben und der dorsalen Seite in Kontakt mit der Membran platziert werden.Fügen Sie bis zu acht Explantate pro Membranfilter hinzu. Legen Sie die Sechs-Well-Platte und die Petrischale mit den Explantaten vorsichtig in einen befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent Kohlendioxid. Nach einer Inkubationszeit von 48 Stunden nehmen Sie die Platte und die Petrischale aus dem Inkubator.Um die kultivierten Explantate von der Sechs-Well-Platte zu sammeln, geben Sie PBS bei Raumtemperatur in den Membraneinsatz. Lösen Sie die kultivierten Explantate von der Membran, indem Sie sie mit einer sterilen Kunststoffpipette kräftig spülen. Übertragen Sie die kultivierten Explantate mit Spachtel und Pinzette in eine Glasschale, die bei Raumtemperatur mit PBS gefüllt ist.Sammeln Sie auf ähnliche Weise die kultivierten Explantate aus dem schwimmenden Membranfilter. In diesem Fall wird der Membranfilter mit einer Pinzette in eine neue Petrischale überführt, die bei Raumtemperatur mit PBS gefüllt ist. Lösen Sie die Explantate durch kräftiges Pipettieren vom Membranfilter.Entleeren Sie den explantatfreien Membranfilter, nachdem Sie sich vergewissert haben, dass keine Explantate mehr daran haften. Übertragen Sie die Explantate vorsichtig mit einem Spatel und einer Pinzette auf 1 ml Gesamt-RNA-Isolierungsreagenz, um Genexpressionsstudien durchzuführen. Kultivierte Explantate können alternativ in ovo angebaut werden, um die Organbildung zu konkurrieren.Bereiten Sie zunächst die chorioallantoische Membran vor. Nehmen Sie dazu die Hühnereier mit einer Entwicklungszeit von acht Tagen aus dem Brutschrank. Die Eier wurden mit der Luftkammer nach oben in einem befeuchteten Inkubator bei 38 Grad Celsius inkubiert.Decken Sie das stumpfe Ende des Eies mit durchsichtigem Plastikband ab, um zu verhindern, dass Schalenstücke in die Luftkammer fallen. Klopfen Sie auf die Schale und schneiden Sie mit einer gebogenen Schere eine kreisförmige Öffnung in das Ei. Die Luftkammer sollte sichtbar werden.Entfernen Sie langsam die weiße Membran der Luftkammer mit einer Pinzette. Die Chorioallantoismembran ist dann sichtbar und für die Transplantation von ektopischem Gewebe zugänglich. Verwenden Sie PBS nicht zur Hydratation der Chorioallantoismembran vor oder nach der Transplantation, da PBS das Gleiten und die Fehlplatzierung der Explantate fördert.Beginnen Sie mit kleinen Gefäßläsionen in den kleineren Gefäßen der Membran. Verwenden Sie für dieses Verfahren ein Mikroskalpell in einer Halterung. Bei übermäßigen Blutungen aus der Wunde das Blut mit der Spitze einer Pasteur-Pipette durch Kapillarität entfernen.Übertragen Sie das Explantat mit einem Spatel und einer Pinzette auf den verwundeten Bereich der Membran. Schneiden Sie ein Stück Filterpapier ab, das etwas größer ist als das Explantat und legen Sie es auf das Explantat. Das Filterpapier hilft dabei, die Explantatstelle nach ihrer Entwicklung in der chorioallantoischen Membran zu verfolgen.Bei Bedarf ermöglicht das Filterpapier auch die tägliche Wirkstoffabgabe an das Explantat während der In-Ovo-Entwicklung. Verschließen Sie das Eierfenster mit durchsichtigem Plastikband und markieren Sie es mit einem Kohlestift. Das Kunststoffband schützt den Embryo während der Inkubationszeit vor Austrocknung.Inkubieren Sie das manipulierte Ei in einem befeuchteten Brutapparat bei 38 Grad Celsius. Nach 10 Tagen Inkubation entnehmen Sie das Ei und ziehen das Plastikband vorsichtig heraus. Schneiden Sie mit einer gebogenen Schere die chorioallantoische Membran um den Filterbereich herum ab und geben Sie das Explantat mit Filterpapier in eine kleine Pyrex-Schale, die mit kaltem PBS gefüllt ist.Übertragen Sie das Explantat mit einer Pinzette in eine 100-Millimeter-Schale mit schwarzer Basis, die mit PBS gefüllt ist. Entfernen Sie das Filterpapier und den Überschuss der Membran vorsichtig mit einer Wecker Augenschere und einer Pinzette. Mit dem Abschäumer werden die Transplantate in eine Fixierlösung überführt und die Organbildung in Paraffinschnitten mittels konventioneller Histologie und Immunhistochemie beurteilt.Hier ist das Versuchsdesign dargestellt, mit dem die frühen Stadien der Thymus- und Nebenschilddrüsenbildung untersucht wurden. Als Beispiel wurde die Expression von Genen, von denen bekannt ist, dass sie an der Entwicklung der Pharynxbogenregion beteiligt sind, während der normalen Entwicklung mittels quantitativer real-time PCR untersucht. Transkripte der drei Gene Tbx1, Six1 und Bmp4 wurden in frisch isolierten Geweben und nach 48-stündiger Kultivierung nachgewiesen.Um die Rolle der Notch- und Hedgehog-Signalwege zu untersuchen, wurden dem Kulturmedium während der In-vitro-Entwicklung pharmakologische Inhibitoren zugesetzt. Die Expressionsniveaus der drei Gene waren in der dritten und vierten Pharynxbogenregion, die 48 Stunden lang in Gegenwart eines Notch-Inhibitors gezüchtet wurde, im Vergleich zu kontrollierten Bedingungen signifikant reduziert. Umgekehrt waren nur Bmp4-Transkripte in kultivierten Geweben signifikant reduziert, wenn die Hedgehog-Signalgebung blockiert wurde.Um die späten Stadien der Organogenese von Thymus und Nebenschilddrüsen zu untersuchen, wurden die kultivierten Gewebe auf die Chorioallantoismembran transplantiert und für weitere zehn Tage verdoppelt. Die organmorphologische Analyse wurde mit konventioneller Histologie und Immunhistochemie durchgeführt. Einige repräsentative Ergebnisse sind die folgenden:Die Transplantate zeigten einen voll ausgebildeten chimären Thymus mit QCPN-positiven, von Wachteln stammenden Thymusepithelzellen und lymphoiden Zellen von Hühnerspendern.Darüber hinaus zeigten Thymus- und Paratyphus-Epithelien nach dem Nachweis von Zytokeratin normale morphologische Merkmale. Das Thymusepithel wies eine retikuläre Architektur auf, während die Zellen des Nebenschilddrüsenparenchyms kugelförmig waren, in Clustern angeordnet und von zahlreichen Kapillaren umgeben waren. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie den zweistufigen Ansatz der In-vitro- und In-Ovo-Entwicklung am Vogelmodell anwenden können, um die Rolle der Signalwege zu untersuchen, die an den verschiedenen Schritten der Organbildung beteiligt sind.

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Das Verständnis frühen Organogenese das vereinfachte<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridisierung Protokoll<em&gt; Xenopus</em

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Zweistufigen Ansatz - und Ende-Frühstadium der Orgel Formation im Vogelgrippe-Modell zu erkunden: die Thymusdrüse und Nebenschilddrüsen Organogenese Paradigma (Video) | JoVE Journal

Zweistufigen Ansatz - und Ende-Frühstadium der Orgel Formation im Vogelgrippe-Modell zu erkunden: die Thymusdrüse und Nebenschilddrüsen Organogenese Paradigma

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