Isolation und Kultur von Nagetier Microglia zur Förderung einer dynamisches verzweigt Morphologie in serumfreien Medium

Das übergeordnete Ziel dieses Zellkulturprotokolls ist es, hochreine Mikrogliakulturen von sich entwickelnden oder erwachsenen Nagetieren zu erzeugen, die ohne Kontakt mit Serum gehalten werden können. Dieses Verfahren kann dazu beitragen, wichtige Fragen der Neurowissenschaften im Zusammenhang mit der Morphologie der Mikroglia, der fibrösen Ketose und der Interaktion der Mikroglia mit anderen ZNS-Zelltypen zu beantworten. Der Hauptvorteil dieses Protokolls besteht darin, dass Mikroglia schnell aus Nagetiergewebe jeden Alters isoliert und kultiviert werden können, ohne dem Serum ausgesetzt zu sein.

Um das Gehirn zu entfernen, schneiden Sie den Hinterhauptkondylus beidseits mit einer Präparierschere aus dem Rückenmark eines Tieres ab und achten Sie darauf, das Gehirn nicht zu beschädigen. Schneiden Sie dann die Haut entlang der Oberseite des Schädels und schneiden Sie eine Seite entlang des Scheitel- und Stirnbeins in Richtung Nasenbein auf. Ziehen Sie die Oberseite des Schädels vorsichtig mit einer Pinzette zurück, entfernen Sie schnell das Gehirn und legen Sie es in vorgekühltes DPBS auf Eis.

Wiederholen Sie den Vorgang für alle verbleibenden Tiere. Nachdem die Gehirne in kaltem DPBS gesammelt wurden, hacken Sie jedes Gehirn in einer Petrischale auf Eis mit einer kalten Skalpellklinge in einen Würfelmillimeter und geben Sie es in einen eiskalten Homogenisator mit fünf bis sieben Millilitern eiskaltem Douierungspuffer. Verwenden Sie anschließend einen locker sitzenden Dounce-Homogenisator, um das Gewebe mit 10 bis 20 sanften und unvollständigen Bewegungen zu dissoziieren.

Achten Sie darauf, das Gewebe am Boden des Homogenisators nicht direkt zu zerquetschen. Schieben Sie das Gewebe stattdessen durch den Raum zwischen den Seiten des Kolbens und des Homogenisators. Es ist wichtig, das Gewebe mit mehreren Dounzierungsrunden langsam zu homogenisieren, um die Lebensfähigkeit der Mikroglia zu erhalten.

Entfernen Sie anschließend vorsichtig den Kolben, um das Eindringen von Luftblasen zu verhindern. Lassen Sie schlecht dissoziierte Gewebestücke am Boden des Homogenisators absetzen und übertragen Sie den Überstand in ein neues, gekühltes konisches 50-Milliliter-Röhrchen. Ersetzen Sie anschließend das entfernte Volumen durch frischen Dounzierpuffer und wiederholen Sie den Dissoziationsvorgang für insgesamt drei bis vier Runden oder bis das gesamte Gewebe dissoziiert ist.

Bei diesem Verfahren wird in das konische 50-Milliliter-Röhrchen, das die Zellsuspension enthält, eiskalter Brausepuffer gegeben und das Gesamtvolumen auf 33,5 Milliliter eingestellt. Geben Sie anschließend 10 Milliliter MSB in die Zellsuspension und mischen Sie gründlich, indem Sie das Röhrchen mehrmals umdrehen. Dies führt zu einer Endkonzentration von 23 % MSB in einem Volumen von 43,5 Millilitern.

Danach zentrifugieren Sie die Zellen 15 Minuten lang bei 500 x g bei 4 Grad Celsius mit langsamem Bremsen. Entfernen Sie dann die oberste Schicht aus Myelin und Schmutz sowie den Überstand mit einer Pipette. Achten Sie beim Entfernen der obersten Schicht darauf, dass so viel wie möglich davon entfernt wird.

Anschließend resuspendieren Sie das Zellpellet in 12 Millilitern Panning-Puffer. Zerreiben Sie die Zellsuspension vorsichtig, um verbleibende Zellklumpen aufzubrechen. In diesem Schritt wird die Zellsuspension durch ein 70-Mikrometer-Zellsieb geleitet, um große Ablagerungen oder Zellklumpen zu entfernen.

Spülen Sie die beschichtete Pannenschale OX42 dreimal mit DPBS aus. Lassen Sie die Platte zwischen den Wäschen nicht vollständig trocknen. Gießen Sie die letzte DPBS-Wäsche ab und tragen Sie die gefilterte Zellsuspension auf die Panning Dish auf.

Schwenken Sie die Platte vorsichtig, um die Zellen zu verteilen. Inkubieren Sie die Platte dann 20 Minuten lang auf einer ebenen Fläche bei Raumtemperatur, damit die Zellen haften können. Inkubieren Sie nicht länger als 20 Minuten, da es sonst sehr schwierig wird, sich von den Zellen aus der Schale zu erholen.

Spülen Sie anschließend die Panning Dish 10 Mal mit DPBS aus, um nicht anhaftende Zellen zu entfernen. Mikroglia werden fest mit der Platte verbunden, also schwenken Sie die Platte bei jedem Spülgang, um sicherzustellen, dass andere nicht anhaftende Zellen entfernt werden. Gießen Sie die letzte DPBS-Wäsche ab und ersetzen Sie sie durch 15 Milliliter DPBS und 200 Mikroliter Trypsin.

Um die Zellen zu trypsinisieren, inkubieren Sie die Schale weniger als oder gleich 10 Minuten bei 37 Grad Celsius. Nach 10 Minuten Trypsinisierung kleben die Mikroglia immer noch an der Platte. Gießen Sie die Mischung ab und waschen Sie die Platte vorsichtig zweimal mit DPBS, um das Trypsin zu entfernen.

Ersetzen Sie es dann durch 12 Milliliter eiskaltes MGM. Stellen Sie die Pfanne anschließend zwei Minuten lang auf Eis, um die Wechselwirkung zwischen Zellen und Substrat zu schwächen, und stellen Sie sicher, dass die Schale flach ist, um zu verhindern, dass Bereiche der Pfanne austrocknen. Pipettieren Sie danach kräftig mit einer 10-Milliliter-Pipette und einer Pipettensteuerung auf hoher Geschwindigkeit, um Zellen aus der Schwenkschale zu gewinnen.

Zeichnen Sie mit dem Flüssigkeitsstrahl aus der Pipette ein 16 x 16 großes Gitter, um zu versuchen, alle Zellen zu entfernen. Es ist wichtig, ein Gleichgewicht zwischen der allgemeinen Zellregeneration und der Gesundheit Ihrer Kultur zu finden. Wiederholtes Pipettieren des Zellüberstands gegen die Panning-Schale führt zu einer verminderten Lebensfähigkeit Ihrer Kultur.

Überprüfen Sie die Zellen unter einem Mikroskop bei 20-facher Vergrößerung, um sicherzustellen, dass sie sich von der Platte gelöst haben. Markieren Sie die Stellen auf der Oberseite der Schale, an denen Zellen festsitzen, und wiederholen Sie das Pipettieren in diesen Bereichen. Sammeln Sie die Zellsuspension und geben Sie drei bis vier Milliliter Überstand in jedes konische 15-Milliliter-Röhrchen.

Schleudern Sie es 15 Minuten lang bei 500 x g bei vier Grad Celsius mit langsamem Bremsen. Nach 15 Minuten aspirieren Sie den Überstand und lassen 0,5 Milliliter MGM mit dem Zellpellet zurück. Suspendieren Sie dann jedes Pellet im restlichen MGM und ziehen Sie die Zellen aus allen Röhrchen.

Zählen Sie anschließend die Zellen mit einem Hämozytometer. Plattieren Sie nun 15 Mikroliter Kollagen-IV-Beschichtung direkt in der Mitte einer 24-Well-anionisch kationisch beschichteten Gewebekulturplatte und inkubieren Sie 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Nachdem Sie die Zellen mit einem Hämozytometer gezählt haben, verdünnen Sie sie auf 2,3 x 10 bis fünf pro Milliliter in MGM.

Aspirieren Sie den Kollagen-IV-Spot und plattieren Sie sofort 15 Mikroliter Zellsuspension an diese Stelle, um 3,5 x 10 für die drei Zellen pro Spot zu erhalten. Inkubieren Sie anschließend fünf bis zehn Minuten bei 37 Grad Celsius, damit die Zellen haften können. Geben Sie dann vorsichtig 500 Mikroliter CO2-äquilibriertes TIC in die Vertiefung

Bei der Beschichtung von Deckgläsern beschichten Sie die sterilen Glasdeckgläser zunächst eine Stunde lang bei Raumtemperatur mit 10 Mikrogramm pro Milliliter PDL in Wasser. Waschen Sie sie dann dreimal mit Wasser und lassen Sie sie in einer Haube unter UV-Licht trocknen, bevor Sie mit der Spotbeschichtung der Deckgläser fortfahren. Um die erfolgreiche Isolierung und Kultivierung hochreiner Mikroglia zu demonstrieren, isolierten wir Mikroglia von P21-Ratten und kultivierten diese Zellen acht Tage lang in TIC oder TIC, ergänzt mit 10%FCS.

Die Zellen wurden dann fixiert und mit Mikrogliamarkern und Proliferationsmarkern gefärbt. Zellen, die in TIC kultiviert wurden, zeigen eine verzweigte Morphologie, ein geringes Maß an Proliferation und die Expression von Mikroglia-Markern. Im Vergleich dazu waren Zellen, die in TIC kultiviert wurden und mit 10%FCS supplementiert wurden, auch für Mikrogliamarker gefärbt, zeigten aber ein hohes Maß an Proliferation und Amöbenmorphologie, Eigenschaften, die häufig bei aktivierten Mikroglia beobachtet werden.

Neben der Färbung von Zellmarkern kann RNA-Seq an frisch isolierten Zellen ein leistungsfähiges und empfindliches Werkzeug für die Bewertung des RNA-Profils der Zellen darstellen und die Ausgangsreinheit von Kulturen bestimmen. Die CD11b-Mikropanning führt typischerweise zu einem kleinen Prozentsatz von CD11b-positiven Neutrophilen und Monozytenverschleppungen, zusätzlich zu CD11b-positiven Mikroglia. Diese Zellen sterben in der TIC nach einigen Tagen ab, können aber die Analyse früherer Zeitpunkte erschweren.

Hier ist ein Zeitrafferfilm von P21 Ratten-Mikroglia nach 14 DIV in TIC. Nach zwei Wochen zeigen serumfreie Kulturen ein dynamisches Überwachungsverhalten mit schnellen Prozessverlängerungen und -retraktionen in der gesamten Schale. Hier ist ein Zeitrafferfilm von P21-Rattenmikroglia nach fünf DIV in TIC vor und nach der Exposition mit fötalem Kälberserum.

Eine rasche morphologische Veränderung ist nach Serumexposition erkennbar. Einmal gemeistert, kann dieses Protokoll in vier bis fünf Stunden durchgeführt werden, wenn es richtig durchgeführt wird. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Assays zur Überwachung der Phagozytose, der Chemotaxis, des Überlebens, der Zytokinfreisetzung und der transkriptionellen Reaktionen auf Reize durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur Funktion der Mikroglia zu beantworten.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Mikroglia schnell aus adultem Nagetiergewebe isolieren und unter serumfreien Bedingungen kultivieren können.