Name: Isolation und Kultur von Nagetier Microglia zur Förderung einer dynamisches verzweigt Morphologie in serumfreien Medium (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min
Description: Erfahren Sie die Isolierung und Kultur von Mikroglia aus Nagetiergewebe in serumfreiem Medium. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung der dynamischen Morphologie und Interaktionen mit anderen ZNS-Zelltypen.

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Diese Arbeit wurde von Christopher und Dana Reeve Foundation International Research Consortium auf Verletzungen des Rückenmarks, Dr. Miriam und Sheldon G. Adelson Medical Research Foundation, der Stiftung JPB Novartis Institute der Grundlagenforschung unterstützt, großzügige Beiträge von Vincent und Stella Coates und Damon Runyon Cancer Research Foundation (DRG-2125-12).

Alle Verfahren, die Nagetiere entsprach Stanford University Richtlinien, welche nationalen und staatlichen Gesetze und Richtlinien einhalten. Stanford University Verwaltungs-Panel auf Laboratory Animal Care stimmten alle tierische Verfahren.
Hinweis: Alle Lösung und Puffer Kompositionen sind in der Tabelle der Materialienzur Verfügung gestellt.
1. bereiten Sie eine Petrischale für CD11b Immunopanning (Tag 0)
Hinweis: Bereiten Sie 1 Immunopanning Gericht für jeden 1-2 juvenile Ratten Gehirne.
<ol><li>Eine 15 cm Petrischale 25 mL 50 mm Tris pH 9.5 Lösung hinzufügen.</li>
	<li>Fügen Sie Ziege Anti-Maus IgG (H + L-Ketten hinzu), die Schüssel für eine Endkonzentration von 6 µg/mL. Wirbel-Platte zu verteilen.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Schale für 1-3 h bei 37 ° c</li>
	<li>Spülen Geschirr dreimal mit DPBS++ (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit Ca2 + und Mg2 +), dann mit einer Lösung aus schwenken Puffer mit 1 µg/mL OX42 Antikörper zu ersetzen. Lassen Sie die Gerichte über Nacht bei Raumtemperatur auf einer flachen Oberfläche.</li>
</ol>(2) Gewebe Sammlung (Tag 1)
Hinweis: Dieses Protokoll dauert ca. 3-4 h.
<ol><li>Sicherzustellen Sie bevor Sie beginnen, dass alle Lösungen sind steril und gekühlt auf Eis. Entspannen Sie alle Instrumente auf Eis und mit Ethanol vor Gebrauch sterilisieren.</li>
	<li>Nach entsprechenden behördlichen Verfahren Opfere eine juvenile Laborratte durch Kohlendioxid ersticken. Hinweis: Alternativ können jüngere Tiere mit einer letalen Dosis von Ketamin/Xylazin (100-200 µL 24 mg/mL Ketamin, 2,4 mg/mL Xylazin) geopfert werden. Ketamin/Xylazin muss verwendet werden, wenn Tiere weniger als 14 Tage alt sind. Wenn mehrere Tiere zu verwenden, extrahieren Sie das Gewebe von einem Tier zu und in vorgekühlt DPBS++ auf dem Eis vor der nachfolgenden Tiere.</li>
	<li>Klemmen Sie ein Hindpaw und sorgen für komplette Teilnahmslosigkeit des Tieres, bevor Sie fortfahren.</li>
	<li>Transcardially Durchspülen des Tieres mit 10-30 mL eiskaltes Perfusion Puffer mit einer 27½-G-Nadel bis Puffer klar ist. Hinweis: Volumen der Perfusion Puffer variiert je nach Größe/Alter des Tieres.</li>
	<li>Entfernen Sie sofort nach der Perfusion der Kopf des Tieres. Aus das Rückenmark der occipital-Kondylus auf jeder Seite mit Dissektion Schere schneiden, achten Sie darauf, das Gehirn schädigen. Nach dem Schneiden Schneiden jeder Seite sorgfältig, einseitig entlang der parietalen und Stirnbein auf dem Nasenbein. Mit einer Pinzette vorsichtig zurückziehen Sie der Spitze des Schädels, schnell entfernen Sie das Gehirn (oder CNS Strukturen von Interesse), und in vorgekühlt DPBS++ auf Eis.</li>
	<li>Wiederholen Sie für alle verbleibenden Tiere. Hinweis: Alle Schritte des Verfahrens sollte in einem Laminar-Flow-Abzug unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden.</li>
</ol>3. mechanische Dissoziation (Tag 1)
<ol><li>Nachdem alle Gehirne gesammelt haben, ein Gehirn in 1 mm3 Stücke in einer Petrischale auf Eis mit einem kalten Skalpellklinge hacken und transfer zum einen eiskalten Dounce-Homogenisator mit ca. 5-7 mL eiskaltes Douncing Puffer. Ein Gehirn zu einem Zeitpunkt zu distanzieren.</li>
	<li>Distanzieren Sie das Gewebe mit 10-20 sanft und unvollständige Strichen mit eine locker sitzende Dounce-Homogenisator. Achten Sie darauf, nicht direkt das Gewebe am unteren Rand der Homogenisator zu zerquetschen, aber stattdessen drängen des Gewebes durch den Raum zwischen den Seiten des Kolbens und der Homogenisator.</li>
	<li>Entfernen Sie vorsichtig den Kolben um Einführung von Luftblasen zu verhindern. Können Sie schlecht dissoziierten Gewebe Stücke sich am unteren Rand der Homogenisator und übertragen Sie überstand auf eine neue gekühlte 50 mL konische Rohr.</li>
	<li>Ersetzen Sie den entfernten Datenträger mit frischen Douncing Puffer, und wiederholen Sie die Schritte 3.2 und 3.3 für eine Gesamtmenge von ca. 3-4 Runden oder bis alle Gewebe getrennt worden. Wiederholen Sie den Vorgang für jedes Gehirn.</li>
</ol>4. Myelin Entfernung (Tag 1)
Hinweis: Myelin Abbau dient zur Isolierung der Mikroglia von Tieren, die älter als P12.
<ol><li>Messen Sie das Volumen der Zellsuspension in der 50 mL konische Röhre mit einer 25 mL-Pipette, dann fügen Sie eiskalte Douncing Puffer, um das Gesamtvolumen auf 33,5 mL einstellen.</li>
	<li>10 mL Myelin Trennung Puffer (MSB) am Zellsuspension und fügen Sie Mischung gründlich durch Umdrehen der Röhre mehrere Male hinzu. Dadurch wird eine 23 % Endkonzentration von MSB in einem Volumen von 43,5 mL.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie Zellen für 15 min bei 500 X g bei 4 ° C mit langsamen Bremsen. Hinweis: Die Zentrifuge dauert ca. 1,5-2 min zu verlangsamen. Dies generiert eine obere Schicht von Myelin und tote Zelle Schutt, einen etwas düsteren überstand und eine kleinere Pellets, die für lebende Zellen angereichert ist.</li>
	<li>Entfernen Sie die obere Schicht des Myelin/Schutt und der Überstand mit einer Pipette. Vorsicht beim Entfernen der obersten Schicht sicherzustellen, wie viele davon wie möglich entfernt wird.</li>
	<li>Aufschwemmen der Zelle Pellet in 12 mL Puffer schwenken. Genannte sanft die Zellsuspension zu brechen Klumpen von Zellen, die bleiben könnte.</li>
</ol>5. Immunopanning (Tag 1)
<ol><li>Durchlaufen Sie die Zellsuspension ein 70 µm Zelle Sieb, großen Trümmer oder Zelle Klumpen zu entfernen.</li>
	<li>Spülen Sie die OX42-beschichtete panning Schale dreimal mit DPBS++. Lassen Sie nicht die Platte trocken zwischen den Waschgängen.</li>
	<li>Die letzten DPBS++ waschen abgießen und panning Gericht die gefilterte Zellsuspension zuweisen. Vorsichtig schwenken Sie die Platte, um die Zellen zu verteilen, dann inkubieren Sie die Platte auf einer flachen Oberfläche bei Raumtemperatur für 20 min damit Zellen halten. Nicht länger als 20 min inkubieren oder Zellen werden sehr schwierig, aus der Schale zu erholen.</li>
	<li>Spülen Sie das panning Gericht mit DPBS++ 10 Mal, um nicht anhaftende Zellen zu entfernen. Mikroglia werden fest mit der Platte verbunden, so schwenken Sie die Platte mit jedem abspülen, um sicherzustellen, dass andere nicht anhaftende Zellen entfernt.</li>
	<li>Gießen Sie die letzten DPBS++ waschen und ersetzen durch DPBS++ 15 mL und 200 μL Trypsin (1,25 % Stammlösung).</li>
	<li>Inkubieren Sie die Schüssel für ≤10 min bei 37 ° C mit 10 % CO2 zu trypsinize. Hinweis: Nicht länger als 10 min weiter oder Mikroglia wird nur schwer zu entfernen.</li>
	<li>Nach 10 min Trypsinization wird die Mikroglia noch auf Platte geklebt werden. Trypsin/DPBS++ Gießen Sie ab und waschen Sie vorsichtig 2 X mit DPBS++ Trypsin zu entfernen, ersetzen mit 12 mL eiskaltes Mikroglia Wachstumsmedium (MGM).</li>
	<li>Ort schwenken Gericht für 2 min auf Eis zur Zelle/Substrat Interaktion zu schwächen, und sicherstellen, dass die Schale ist flach bis Bereiche der Schwenk Schale Austrocknen verhindert wird.</li>
	<li>Pipette kräftig mit einem 10 mL Pipette und Pipettieren Controller auf high-Speed Zellen aus der Schwenk Schale wiederherstellen. Zeichnen Sie ein 16 x 16-Gitter mit dem Strom der Flüssigkeit aus der Pipette zu versuchen, und entfernen alle Zellen.</li>
	<li>Überprüfen Sie die Zellen unter dem Mikroskop bei 20 X Vergrößerung, um sicherzustellen, dass Zellen von Platte losgelöst haben. Mark-Flecken auf der Schale, wo Zellen sind immer noch fest, und wiederholen Sie in diesen Bereichen pipettieren.</li>
	<li>Sammeln Sie Zellsuspension und aliquoten 3-4 mL überstand pro 15 mL konische Röhrchen. Spinnen Sie für 15 min bei 500 X g bei 4 ° C mit langsamen Bremsen. Hinweis: Spinning Mikroglia durch ein kleines Volumen ermöglicht die maximale Regeneration der Zellen.</li>
	<li>Aspirieren des Überstands, 0,5 mL von MGM mit der Pellet-Zelle zu verlassen.</li>
	<li>Aufschwemmen Sie jedes Pellet im übrigen MGM und bündeln Sie die Zellen von den Schläuchen.</li>
	<li>Anzahl Zellen mit Hemocytometer.</li>
	<li>Platte Zellen wie in Schritt 6 - 7 je nach Anwendung beschrieben.</li>
	<li>Zellkulturen bei 37 ° C mit 10 % CO2. Hinweis: Zellen können für bis zu 3-4 Wochen mit regelmäßigen Medien Änderungen oder eine Woche mit unveränderten Medien Kultur sein.</li>
</ol>6. Ort Beschichtung Gewebekultur Platten/Deckgläsern (Tag 1)
<ol><li>Platte 15 µL Kollagen IV Beschichtung direkt in der Mitte einer 24-Well anionischen/kationischen beschichtete Gewebe-Kultur-Platte (siehe Tabelle der Materialien für Details) und inkubieren Sie für 15 min bei 37 ° C mit 10 % CO2.</li>
	<li>Nach dem zählen von Zellen mit Hemocytometer verdünnen Sie Zellen auf 2,3 x 105/mL im MGM. Aspirieren Sie Kollagen IV-Stelle und sofort Platte 15 µL Zellsuspension zu dieser Stelle; Dadurch erhalten 3,5 x 103 Zellen/Spot. 5-10 min bei 37 ° C mit 10 % CO2 erlauben Zellen zu halten, fügen Sie 500 µL der CO2 -TGF-β2/IL-34/Cholesterin enthaltenden Wachstumsmedium (TIC) equilibriert inkubieren Sie sanft zum Brunnen.</li>
	<li>Wenn auf Deckgläsern, erste Mantel sterile Glasdeckgläser mit 10 µg/mL Trick-D-Lysin (PDL) in H2O 1 h bei RT, Beschichtung mit H2O 3 Mal waschen und trocknen in eine Haube unter UV-Licht. Sobald Deckgläsern trocken sind, fahren Sie mit vor Ort-Beschichtung auf den Deckgläsern, wie in Schritt 6.2 beschrieben.</li>
</ol>(7) Überzug für RNS/Protein isoliert
<ol><li>Am Tag 1, Mantel, das gesamte Gebiet von einer 24-Well anionischen/kationischen Gewebekultur Platte mit Kollagen IV Beschichtung beschichtet und inkubieren Sie für 10 min - 1 h bei 37 ° C mit 10 % CO2, dann entfernen und sofort Platte 3-5 x, equilibriert 104 Zellen/Brunnen in CO2 TIC-Medien.</li>
	<li>Am 2. Tag führen Sie ein Medienwechsel von 50 % für jede gut am Tag nach der Zubereitung. Abgestorbenen Zellen neigen dazu, in der Mitte des Brunnens cluster, so nehmen Medien von dort.</li>
	<li>Führen Sie eine 50 % Medienwechsel alle 2-3 Tage um die Kulturen zu erhalten. Wenn Medien Änderungen eine unerwünschte Variable für die Kulturen einführen, können Zellen für ca. 1 Woche ohne Medien Änderungen, im Gegensatz zu über 3 Wochen bei regelmäßiger Wartung überleben.</li>
</ol>

<ol><li>Colonna, M., Butovsky, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+Function+in+the+Central+Nervous+System+During+Health+and+Neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Microglia Function in the Central Nervous System During Health and Neurodegeneration.</a> Annu Rev Immunol. 35, 441-468 (2017).</li>
<li>Wu, Y., Dissing-Olesen, L., MacVicar, B. A., Stevens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia%3A+Dynamic+Mediators+of+Synapse+Development+and+Plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Microglia: Dynamic Mediators of Synapse Development and Plasticity.</a> Trends Immunol. 36 (10), 605-613 (2015).</li>
<li>Lou, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purinergic+receptor+P2RY12-dependent+microglial+closure+of+the+injured+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Purinergic receptor P2RY12-dependent microglial closure of the injured blood-brain barrier.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (4), 1074-1079 (2016).</li>
<li>Haynes, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+P2Y12+receptor+regulates+microglial+activation+by+extracellular+nucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The P2Y12 receptor regulates microglial activation by extracellular nucleotides.</a> Nat Neurosci. 9 (12), 1512-1519 (2006).</li>
<li>Gosselin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+environment-dependent+transcriptional+network+specifies+human+microglia+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity.</a> Science. 356 (6344), (2017).</li>
<li>Lavin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-resident+macrophage+enhancer+landscapes+are+shaped+by+the+local+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Tissue-resident macrophage enhancer landscapes are shaped by the local microenvironment.</a> Cell. 159 (6), 1312-1326 (2014).</li>
<li>Hoeffel, G., Ginhoux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogeny+of+Tissue-Resident+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Ontogeny of Tissue-Resident Macrophages.</a> Front Immunol. 6, 486(2015).</li>
<li>Bennett, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+for+studying+microglia+in+the+mouse+and+human+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">New tools for studying microglia in the mouse and human CNS.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (12), E1738-E1746 (2016).</li>
<li>Bohlen, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+Requirements+for+Microglial+Survival%2C+Specification%2C+and+Function+Revealed+by+Defined-Medium+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Diverse Requirements for Microglial Survival, Specification, and Function Revealed by Defined-Medium Cultures.</a> Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).</li>
<li>Herz, J., Filiano, A. J., Smith, A., Yogev, N., Kipnis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+Cells+in+the+Central+Nervous+System%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Myeloid Cells in the Central Nervous System.</a> Immunity. 46 (6), 943-956 (2017).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass die Forschung in der Abwesenheit von kommerziellen oder finanziellen Beziehungen geführt wurde, die als ein potenzieller Interessenkonflikt ausgelegt werden könnte.

Da Mikroglia als Sentinel immunen Zellen des ZNS dienen, sind sie sehr ansprechend auf Veränderungen der Umwelt; Daher ist großer Sorgfalt erforderlich, um entzündliche Reaktionen in den Zellen während ihrer Isolation und Kultur8zu minimieren. Dies geschieht in diesem Protokoll durch Geschwindigkeit und Temperatur. Die Zellen auf Eis oder bei 4 ° C zu halten, wann immer möglich Aktivierung, reduziert so dass alle Schritte der Zentrifugation bei 4 ° C erfolgen, die Tiere sind mit eiskalten Perfusio...

Als Makrophagen CNS Parenchym Mikroglia interagieren mit einer Vielzahl von neuronalen Schaltkreise und Glia Signalisierung Netzwerke. Sie spielen eine entscheidende Rolle in der Entwicklung und Homöostase des Gehirns durch synaptische Rebschnitt, apoptotische Zelle Abfertigung und transiente Interaktionen mit neuronalen Prozessen1,2. Mikroglia sind frühe Responder zu neurologischen Verletzungen, erweitern ihre langen, dünnen Prozesse Läsionsorte zu Entzündungsreaktionen zu koordinieren und Blutungen3,4zu begrenzen. Veränderungen in der Mikroglia Morphologie und Funktion sind allgegenwärtig in akuten und chronischen Verletzungen der CNS und Mikroglia Ausstellung verändert, Morphologie, Lokalisierung und Ausdruck von Entzündungsmediatoren in einem breiten Spektrum von Krankheit Staaten1. Menschliche genetische Studien zeigen, dass Mutationen, die Gefahr für Neurodegenerative Erkrankungen verändern oft überwiegend oder ausschließlich von Mikroglia im intakten ZNS, Hinweis auf eine entscheidende Rolle für die Mikroglia in der Pathogenese der Krankheit oder das Fortschreiten5 ausgedrückt werden . Da ihre Prominenz bei Verletzungen und Krankheit, ist fördern das Verständnis der Mikroglia Biologie einen hohen Stellenwert für die Entwicklung neuer therapeutischer Ansätze.
Viele wichtige Fortschritte für das Verständnis der Mikroglia Biologie entstanden durch Extrapolation Techniken und Mechanismen, die in Studien von anderen Makrophagen Populationen einschließlich Kulturmethoden, gen Expressionsprofile und Definition der funktionalen entdeckt / morphologischen Staaten. Obwohl generalisiert Makrophagen Funktionen oft auf überraschende Weise in der CNS-Landschaft spielen, Mikroglia selbst sind hochspezialisiert, ausstellenden eine verzweigte Morphologie und eine einzigartige gen Ausdruck Signatur, die sie von anderem Gewebe unterscheidet Makrophagen-6. Mikroglia haben eine Linie, die sich von den meisten anderen Gewebe Makrophagen unterscheidet; Sie besiedeln die CNS während einer frühen embryonalen Welle der primitiven Hämatopoese und selbst im gesamten Leben, unabhängig von der definitiven Hämatopoese7Beiträge zu erneuern. Die vollreifen gen Ausdruck Unterschrift des Erwachsenen Mikroglia wird nicht bis die zweite postnatalen Woche8erreicht. Ökologische Hinweise aus dem umliegenden Gewebe Rolle diktieren gewebespezifischen Makrophagen Funktionen6, die im ZNS beschränkt Belastung durch Blut übertragbare Faktoren gewährt durch die Blut - Hirn-Schranke9beinhaltet eine wichtige.
Ein Hindernis für die Mikroglia Beiträge zu CNS-Homöostase und Krankheit vollständig zu verstehen ist die Schwierigkeit, die speziellen Eigenschaften der Reifen Mikroglia gesehen in Vivo mit gereinigten Zellen Rekapitulation in-vitro-. Viele Methoden wurden entwickelt, um zu isolieren und Kultur intakt Mikroglia, aber die meisten Ansätze setzen auf Serum, Überleben der Zellen zu unterstützen. Wir haben gezeigt, dass die Zugabe von Serum, das ist ein von Natur aus Variable Reagenz enthält eine breite Palette von bioaktiven Moleküle, ist besonders problematisch, wenn arbeiten mit Mikroglia weil es eine amöboiden Morphologie fördert Verbreitung erhöht, und erhöhte Phagozytose9 oft gesehen in Vivo bei Mikroglia blutübertragbaren Faktoren nach der Unterbrechung der Blut - Hirn-Schranke ausgesetzt sind. Durch diese Metrik Serum-exponierten Zellen Microglia Verletzungen oder Krankheiten ähneln, aber derartige Veränderungen reduziert wenn Mikroglia in definierten Wachstumsmedium mit CSF-1 (oder IL-34), TGF-β, Cholesterin und Selenit kultiviert werden.
Dieses Protokoll enthält Details zur Kultivierung juvenile Ratte Mikroglia unter serumfreien Bedingungen im Zusammenhang mit kürzlich veröffentlichtes Werk9. Dieses Protokoll wurde für Ratten von postnatale Tag 21-30 (P21 - P30) gestrafft, aber an Microglia von Ratten und Mäusen jeden Alters isolieren angepasst werden kann, obwohl der Ertrag und die gesamte Tragfähigkeit abhängig von der Art und dem Alter des Tieres variiert. Maximale Erträge und optimale Rentabilität ist erreicht, wenn etwas unreif Mikroglia verwenden (~ P9), mit Erträgen und Lebensfähigkeit allmählich verjüngt sich zu etwas niedrigere Ebenen bei erwachsenen Tieren. Mikroglia kann auch von Mäusen isoliert sein, aber wir haben festgestellt, dass die Rattenzellen deutlich höhere Erträge, Rentabilität und Komplexität der verzweigten Morphologien, zeigen im Vergleich zu Mauszellen in serumfreien Kulturen. Tiere im Alter von mehr als P50 mit diesem Protokoll nicht ausgewertet wurden. Dieses Immunopanning-Isolierung-Verfahren wurde optimiert, um Veränderungen der Mikroglia transcriptional Profile bei Isolierung zu minimieren und nachgelagerten Lebensfähigkeit der Zellen zu maximieren. Mit diesen Techniken und Medien Formulierungen, können hohe Rentabilität Primärkulturen wochenlang aufrecht erhalten werden. Unter diesen Bedingungen kultiviert Mikroglia weisen eine stark verzweigte Morphologie mit schnellen ein- und Ausfahren der Prozesse und relativ niedrige Rate der Verbreitung. Wir unterstreichen die Bedeutung der Serum-Exposition auf diese Eigenschaften und stärken und Schwächen dieser Methode im Vergleich zu anderen Ansätzen zu diskutieren.

<table><tbody><tr><td>Ratte: Sprague-Dawley</td><td>Charles River</td><td>Cat# 400</td><td></td></tr><tr><td>Maus Anti-Ratte CD11b monoklonal (Klon OX42)</td><td>Bio-Rad</td><td>Cat# MCA275R</td><td>Panning: 1:1.000; Färbung: 1:500</td></tr><tr><td>Ziege polykolonal anti-Iba1</td><td>Abcam</td><td>Cat# AB5076</td><td>Färbung: 1:500</td></tr><tr><td>Kaninchen polyklonal anti-Ki67</td><td>Abcam</td><td>Cat# AB15580</td><td>Färbung: 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor Esel anti-maus 594</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# 11055</td><td>Färbung: 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor Esel anti-Ziege 488</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# A-21203</td><td>Färbung: 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor Donkey Anti-Rabbit 647</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# A-31573</td><td>Färbung: 1:500</td></tr><tr><td>Triton-X (Reinigungsmittel in ICC-Färbung)</td><td>Thermo Fisher</td><td>Cat# 28313</td><td></td></tr><tr><td>Heparansulfat</td><td>Galen Laborbedarf</td><td>Cat# GAG-HS01</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>Cat# M3149</td><td></td></tr><tr><td>Pepton aus Milchfeststoffen</td><td>Sigma</td><td>Cat# P6838</td><td></td></tr><tr><td>TGF-&beta; 2</td><td>Peprotech</td><td>Cat# 100-35B</td><td></td></tr><tr><td>Murine IL-34</td><td>R& D Systems</td><td>Cat# 5195-ML/CF</td><td></td></tr><tr><td>Schafwolle Cholesterin</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>Cat# 700000P</td><td></td></tr><tr><td>Kollagen IV</td><td>Corning&nbsp;</td><td>Kat# 354233</td><td></td></tr><tr><td>Ölsäure</td><td>Cayman Chemicals&nbsp;</td><td>Kat# 90260</td><td></td></tr><tr><td>11(Z)Eicosadienoic (Gondoin) Acid</td><td>Cayman Chemicals&nbsp;</td><td>Cat# 20606</td><td></td></tr><tr><td>Calcein AM Farbstoff</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# C3100MP</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium Homodimer-1</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# E1169</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Worthington</td><td>Cat# DPRFS</td><td></td></tr><tr><td>Percoll PLUS</td><td>GE Healthcare</td><td>Cat# 17-5445-02</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma</td><td>Cat# T9935</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>Kat# 21041-02</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/ Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>Katze # 15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Glutamin</td><td>Gibco</td><td>Katze # 25030-081</td><td></td></tr><tr><td>N-Acetylcystein & nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Cat# A9165</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma</td><td>Cat# 16634</td><td></td></tr><tr><td>Apo-Transferrin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Cat# T1147</td><td></td></tr><tr><td>Natriumselenit</td><td>Sigma</td><td>Cat# S-5261</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (hoher Glukosegehalt)</td><td>Gibco</td><td>Cat# 11960-044</td><td></td></tr><tr><td>Dapi Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>Cat# 0100-20&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Cat# A-003-E</td><td></td></tr><tr><td>Primärplatten&nbsp;</td><td>VWR</td><td>Cat# 62406-456</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Unternehmen</td><td>Katalognummer</td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>Lagerreagenzien&nbsp; </td>Apo-Transferrin-Rekonstitution<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>: 10 mg/ml in PBS Verwendete Konzentration: 1:100 Lagerung: -20 μm; C</td></tr><tr><td>N-Acetylcystein</td><td></td><td></td><td>Rekonstitution: 5 mg/ml in H2O Verwendete Konzentration: 1:1.000 Lagerung: -20 μm; C</td></tr><tr><td>Natriumselenit</td><td></td><td></td><td>Rekonstitution: 2,5 mg/ml in H2O Verwendete Konzentration: 1:25.000 Lagerung: -20 μm; C</td></tr><tr><td>Kollagen IV</td><td></td><td></td><td>Rekonstitution: 200 &mu; g/ml in PBS Verwendete Konzentration: 1:100 Lagerung: -80 μm; C</td></tr><tr><td>TGF-b2</td><td></td><td></td><td>Rekonstitution: 2 mg/ml in PBS Verwendete Konzentration: 1:1.000 Lagerung: -20 μm; C</td></tr><tr><td>IL-34</td><td></td><td></td><td>Rekonstitution: 200 μmu; g/ml in PBS Verwendete Konzentration: 1:1.000 Lagerung: -80 μm; C</td></tr><tr>Rekonstitution von<td>Schafwolle</td><td></td><td></td><td>: 1,5 mg/ml in 100 % Ethanol Verwendete Konzentration: 1:1.000 Lagerung: -20 μm; C</td></tr><tr><td>Heparansulfat-Rekonstitution</td><td></td><td></td><td>: 1 mg/ml in H2O Verwendete Konzentration: 1:1.000 Lagerung: -20 μm; C</td></tr><tr><td>Ölsäure/Gondoinsäure</td><td></td><td></td><td>Rekonstitution: Gondoinsäure: 0,001 mg/ml; Ölsäure: 0,1 mg/ml in 100 % Ethanol Verwendete Konzentration: 1:1.000 Lagerung: -20 μm; C</td></tr><tr>Heparin-Rekonstitution<td></td><td></td><td></td><td>: 50 mg/ml in PBS Verwendete Konzentration: 1:100 Lagerung: -20 μm; C</td></tr><tr><td>Name</td><td>Unternehmen</td><td>Katalognummer<</td><td>strong>Kommentare</td></tr><tr><td>Lösungen&nbsp; </stark>Perfusionspuffer</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td></td><td></td><td>Rezept: 50 &mu; g/mL Heparin in DPBS++ (PBS mit Ca++ und Mg+ +) Kommentare: Bei eiskalter</td></tr><tr><td>Verwendung Douncing Buffer</td><td></td><td></td><td>Rezept: 200 &mu; L von 0,4% DNaseI in 50 mL DPBS++ Bemerkungen: Bei eiskaltem</td></tr><tr><td>Panning Buffer</td><td></td><td></td><td>verwenden Rezept: 2 mg/mL Pepton aus Milchfeststoffen in DPBS++</td></tr><tr><td>Microglia Growth Medium (MGM)</td><td></td><td></td><td>Rezept: DMEM/F12 mit 100 Einheiten/mL Penicillin, 100 &mu; g/mL Streptomycin, 2 mM Glutamin, 5 &mu; g/mL N-Acetylcystein, 5 &mu; g/ml Insulin, 100 &mu; g/mL Apo-Transferrin und 100 ng/ml Natriumselenit Kommentare: Verwenden Sie eiskaltes MGM, um Mikroglia von der Immnopanning-Schale abzufüllen.</td></tr><tr><td>Kollagen IV Überzugsrezept</td><td></td><td></td><td>: MGM mit 2 μ; g/mL Kollagen IV</td></tr><tr><td>Myelin Seperation Buffer</td><td></td><td></td><td>Rezept: 9 mL Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS ohne Ca++ und Mg++, 9 &mu; L 1 M CaCl2, 5 &mu; L 1 M MgCl2 Kommentare: Nach der Zugabe von &nbsp; CaCl2 und MgCl2</td></tr><tr><td>TGF-b2/IL-34/Cholesterin enthaltende Wachstumsmedien (TIC)&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Rezept: MGM mit humanem 2 ng/mL TGF-b2, 100 ng/mL murinem IL-34, 1,5 &mu; g/mL Cholesterin aus Schafwolle, 10 &mu; g/mL Heparansulfat, 0,1 &mu; g/ml Ölsäure und 0,001 &mu; g/ml Gondoinsäure Kommentare: Achten Sie darauf, Cholesterin in Medien zu geben, die auf 37 μg erwärmt sind; C und fügen Sie nicht mehr als 1,5 μm hinzu. g/mL oder es fällt aus. Filtern Sie keine cholesterinhaltigen Medien. Äquilibrieren Sie TIC-Medien 30 Minuten bis 1 Stunde lang mit 10 % CO2, bevor Sie sie den Zellen hinzufügen, um einen optimalen pH-Wert zu gewährleisten.</td></tr></tbody></table>

isolation und kultur von nagetier microglia zur förderung einer dynamisches verzweigt morphologie in serumfreien medium

Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium

Mikroglia repräsentieren ca. 5-10 % aller Zellen des zentralen Nervensystems (ZNS) und sind immer mehr Aufmerksamkeit durch ihre Beiträge während der Entwicklung, Homöostase und Krankheit. Obwohl Makrophagen im Detail für Jahrzehnte, spezielle Funktionen der Mikroglia, die Gewebe-Bewohner Makrophagen des ZNS untersucht wurden, blieben weitgehend geheimnisvoll, teilweise aufgrund von Einschränkungen in der Fähigkeit, Reife Mikroglia rekapitulieren Unterkünfte in Kultur. Hier zeigen wir ein einfaches Verfahren für die schnelle Lokalisierung der reinen Mikroglia aus dem Reifen Nagetier Gehirn. Wir beschreiben auch serumfreien Kulturbedingungen, die hohe Rentabilität der Mikroglia im Laufe der Zeit unterstützen. Mikroglia, die unter diesen Bedingungen definiert-Medium kultiviert weisen aufwändige verzweigte Prozesse und dynamische Überwachung Verhalten. Wir veranschaulichen einige Auswirkungen der Serum-Exposition auf kultivierten Mikroglia und besprechen, wie diese serumfreien Kulturen im Vergleich zu Serum-exponierten Kulturen sowie Mikroglia in Vivo.

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Kultur hochreine verzweigt Mikroglia von jungen Ratten. Ähnliche Ergebnisse können mit unreifen, perinatale und Erwachsene Tiere, wie weiter unten besprochen. Da Zelle Isolationen oft beinhalten subtilen Nuancen und viele Möglichkeiten für Zellen sterben verwendet wir Qualitätskontrolle Kontrollpunkte um Erfolg in verschiedenen Schritten zu ermitteln. Wir überwacht in der Regel Zellsuspensionen mit einer Hemocytometer in mehreren Schritten in d...

Bemühungen, Mikroglia-Funktion im Detail zu verstehen haben durch das Fehlen von Mikroglia Kultur Modelle behindert worden, die die Eigenschaften der Reifen in Vivo Mikroglia rekapitulieren. Dieses Protokoll beschreibt einen Isolation und Kultur Ansatz entwickelt, um robuste überleben stark verzweigten Reife Ratte Mikroglia Bedingungen definiert-Mittel zu erhalten.

Isolation und Kultur von Nagetier Microglia zur Förderung einer dynamisches verzweigt Morphologie in serumfreien Medium

Microglia represent 5 - 10% of all central nervous system (CNS) cells and are increasingly drawing attention due to their contributions during ...

Das übergeordnete Ziel dieses Zellkulturprotokolls ist es, hochreine Mikrogliakulturen von sich entwickelnden oder erwachsenen Nagetieren zu erzeugen, die ohne Kontakt mit Serum gehalten werden können. Dieses Verfahren kann dazu beitragen, wichtige Fragen der Neurowissenschaften im Zusammenhang mit der Morphologie der Mikroglia, der fibrösen Ketose und der Interaktion der Mikroglia mit anderen ZNS-Zelltypen zu beantworten. Der Hauptvorteil dieses Protokolls besteht darin, dass Mikroglia schnell aus Nagetiergewebe jeden Alters isoliert und kultiviert werden können, ohne dem Serum ausgesetzt zu sein.Um das Gehirn zu entfernen, schneiden Sie den Hinterhauptkondylus beidseits mit einer Präparierschere aus dem Rückenmark eines Tieres ab und achten Sie darauf, das Gehirn nicht zu beschädigen. Schneiden Sie dann die Haut entlang der Oberseite des Schädels und schneiden Sie eine Seite entlang des Scheitel- und Stirnbeins in Richtung Nasenbein auf. Ziehen Sie die Oberseite des Schädels vorsichtig mit einer Pinzette zurück, entfernen Sie schnell das Gehirn und legen Sie es in vorgekühltes DPBS auf Eis.Wiederholen Sie den Vorgang für alle verbleibenden Tiere. Nachdem die Gehirne in kaltem DPB

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Isolieren primären Mikroglia aus der zellulären Heterogenität des Gehirns ist wichtig, um deren Rolle bei physiologischen und pathologischen Bedingungen zu untersuchen. Dieses Protokoll beschreibt eine mechanische Isolation und gemischten Zellkultur-Technik, die eine hohe Ausbeute und hoher Reinheit liefert, lebensfähigen primären Mikrogliazellen...

Primäre Mikroglia Isolation vom gemischten Zellkulturen von Gliazellen Neonatal Rattenhirngewebe

In diesem Video beschreiben wir ein Protokoll zur Isolierung von CD11b-Zellen, einschließlich Mikroglia, aus Mäuse-Welpengehirnen mittels magnetisch aktivierter Zellsortierung. Das Hirngewebe wird homogenisiert, um Einzelzellsuspensionen zu erhalten, die mit Anti-CD11b-Antikörpern beschichteten Mikrokügelchen inkubiert werden, gefolgt von einer magnetischen Säulentrennung, um die CD11b+-Zellpopulation zu reinigen.

Magnetische Isolierung von Mikroglia aus dem Gehirn von Maus-Welpen

Das Video zeigt eine einfache Methode, um murine Astrozyten isoliert von anderen Gehirnzellen zu kultivieren. Während der Kultivierung werden durch die Verwendung von Astrozyten-spezifischen Medien und die Hemmung der Adhärenz nicht-astrozytärer Zellen selektiv Astrozyten kultiviert. Diese kultivierten Astrozyten weisen eine sternförmige Morphologie mit feinen Fortsätzen auf.

Eine einfache Technik zur Isolierung und Kultivierung von murinen Astrozyten

Dieses Video zeigt eine Methode zur Isolierung und Kultivierung von Mikroglia aus Rattengehirnen. Dabei werden Mikroglia von anderen neuronalen und nicht-neuronalen Zellen mit Hilfe von Platten getrennt, die mit einem monoklonalen Antikörper beschichtet sind, der spezifisch für Mikroglia ist.

Isolierung und Kultivierung von Mikroglia aus Rattengehirnen mit serumfreien Medien

Dieses Video zeigt eine Technik zur selektiven Entnahme von Mikroglia aus einer primären neuronalen Rattenkultur. Kleinhirngranulaneuronen werden mit einem Antimetaboliten behandelt, um proliferierende Gliazellen zu eliminieren. Zusätzlich werden sie mit Lysosomen-Targeting-Wirkstoffen behandelt, um Mikroglia aus der Kultur zu entfernen.

Selektive Entnahme von Mikroglia aus einer Kleinhirn-Neuronenkultur der Ratte

Wir skizzieren Methoden für die effiziente und schnelle Isolierung / Kultur lebensfähiger Mikroglia aus dem Neugeborenen Hirnrinde und erwachsenen Rückenmark. Die Präparation und Beschichtung der kortikalen Mikroglia kann innerhalb von 90 Minuten erreicht werden, mit der anschließenden Mikroglia Ernte stattfindet ~ 10 Tage nach der ersten Sektion.

Kultivierung Mikroglia aus dem Neugeborenen und Erwachsenen Central Nervous System

Ein Schlüssel zur erfolgreichen Untersuchung der Mikroglia-Biologie ist die Erhaltung der Immunfunktion Mikroglia ex vivo bei der Isolierung von ZNS-Gewebe. Trenn Mikroglia über Dreh Schütteln Ergebnisse in hochreiner und immunofunctional Zellkulturen durch Fluoreszenz-Bildgebung, Immunzytochemie, und ELISA folgenden Mikroglia-Aktivierung mit der proinflammatorische Stimuli Lipopolysaccharide (LPS) und Pam 3 4 CSK (Pam) bewertet.

Isolation kortikaler Mikroglia mit bewahrten Immunophänotyp und Funktionalität aus Murine Neugeborene

Hier präsentieren wir ein Protokoll Mikroglia aus postnataler Maus Welpen (Tag 1) für in - vitro - Experimente zu isolieren. Diese improvisierte Isolierungsmethode erzeugt sowohl hohe Ausbeute und Reinheit, einen bedeutenden Vorteil gegenüber alternativen Methoden, die für die Zwecke der Erläuterung Mikroglia biology breites Spektrum Experimente ermöglicht.

Schnelle und Refined CD11b Magnetic Isolierung von primären Mikroglia mit erhöhter Reinheit und Vielseitigkeit

Ein Protokoll für die Isolierung von primären Mikroglia aus murine Gehirn wird vorgestellt. Diese Technik hilft bei der Förderung des gegenwärtigen Verständnis von neurologischen Erkrankungen. Dichte-Gradienten-Zentrifugierung und magnetische Trennung werden kombiniert, um genügend Ertrag einer hochreinen Probe zu produzieren. Darüber hinaus erläutern wir die Schritte zur Charakterisierung der Mikroglia.

Charakterisierung und Isolierung der Maus primären Mikroglia durch Dichte-Gradienten-Zentrifugierung

Dieses Protokoll ist eine effiziente, kostengünstige und robuste Methode zur Isolierung primärer Mikroglia aus lebendem, erwachsenem, menschlichem Hirngewebe. Isolierte primäre menschliche Mikroglia kann als Werkzeug für die Untersuchung zellulärer Prozesse bei Homöostase und Krankheit dienen.

Gewinnung menschlicher Mikroglia aus erwachsenem menschlichem Hirngewebe

Primäre Mikrogliakulturen werden häufig verwendet, um neue entzündungshemmende Moleküle zu bewerten. Das vorliegende Protokoll beschreibt eine reproduzierbare und relevante Methode zur magnetischen Isolierung von Mikroglia aus neugeborenen Welpen.

Magnetische Isolierung von Mikrogliazellen aus neugeborener Maus für primäre Zellkulturen

Erfahren Sie die Isolierung und Kultur von Mikroglia aus Nagetiergewebe in serumfreiem Medium. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung der dynamischen Morphologie und Interaktionen mit anderen ZNS-Zelltypen.

Isolation und Kultur von Nagetier Microglia zur Förderung einer dynamisches verzweigt Morphologie in serumfreien Medium

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