Name: Brühe Microdilution In Vitro Screening: eine einfache und schnelle Methode, um neue Antimykotika Verbindungen erkennen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Lernen Sie die Brühe-Mikroverdünnungsmethode zur schnellen Screening-Untersuchung neuer antimykotischer Verbindungen mit Candida albicans und Cryptococcus neoformans. Diese Technik ermöglicht Forschern die effiziente Bewertung von Natur- und Synthesestoffen.

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Wir bedanken uns bei Kaps-Brasilien, CNPq-Brasilien, FAP/DF für finanzielle Unterstützung. Wir sind dankbar, Dr. Hugo Costa Paes für das Manuskript überarbeiten.

(1) Lösungen und Medien
<ol><li>Bereiten Sie 2 X Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium, Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS), Sabouraud-Dextrose-Bouillon und Sabouraud-Dextrose-Agar nach Tabelle 1.</li>
</ol>(2) Pilz Inokulum Wachstumsbedingungen
<ol><li>Speichern Sie alle Pilzstämmen als gefrorene Bestände in 35 % Glycerin bei-80 ° C, bis benötigt.</li>
	<li>Führen Sie die folgenden Schritte vor jedem Experiment.<ol>
<li>Für Candida Albicans -Stämme:<ol>
<li>Ein Lager Fläschchen Auftauen und 200 µL bis 10 mL der Sabouraud-Dextrose-Bouillon in einem sterilen 50 mL Polypropylen-Rohr mit einer Kappe und Kultur über Nacht bei 30 ° C unter Rühren (200 u/min) zu übertragen. Denken Sie daran, neigen die Röhre und lassen Sie die Kappe leicht geöffnet für bessere Belüftung der Kultur.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Für Cryptococcus Neoformans Stämme:<ol>
<li>Kratzen Sie die Eisfläche des ein Lager Fläschchen. Die Zellen auf Sabouraud-Dextrose-Agar-Platten Teller und inkubieren Sie für 48 h bei 30 ° C. Halten Sie nach sichtbares Wachstum der isolierten Kolonien die Platten in den Kühlschrank (4 ° C) für bis zu 15 Tage mit Paraffin Film versiegelt.</li>
			<li>Eine mittlere isolierte Kolonie von der Platte mit einem sterilen Zahnstocher oder sterilen Impfkeimen Schleife zu sammeln und 10 mL der Sabouraud-Dextrose-Brühe in einem sterilen 50 mL konische Röhrchen zu impfen. Inkubieren Sie für ca. 24 h bei 30 ° C unter Rühren (200 u/min).</li>
			<li>Überschreiten Sie die 24 h Inkubation nicht. Denken Sie daran, neigen die Röhre und lassen Sie die Kappe leicht geöffnet für bessere Belüftung. Es ist immer gut, die Wachstumsphase der Zellen vor jedem Test zu standardisieren, da dies ein wichtiger Faktor Antibiotikaresistenzen. Hinweis: Beide Pilze wurden bei 30 ° C für die rasche Vermehrung in unseren Experimenten angebaut, aber die Temperatur kann geändert werden, um die Ziele der Studie, zum Beispiel klinische Behandlung (37 ° C). Am wichtigsten ist, sollte dieser erste Inkubationszeit im Voraus für jeden Pilz Isolat eingerichtet und erhalten während der Tests auf Reproduzierbarkeit zu gewährleisten.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nach Pilzwachstum sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugieren die konische Rohre bei 1.200 x g für 5 min bei Raumtemperatur. Verwerfen Sie den Überstand und 10 mL PBS.</li>
	<li>Die Zellen und die Zentrifuge bei 1.200 x g für 5 min bei Raumtemperatur wieder aufzuwirbeln.</li>
	<li>Wiederholen Sie die PBS waschen und Zentrifugation noch zweimal. Nach der dritten Wäsche Aufschwemmen der Zellen in 5 mL (entsprechend der Größe der Pellets) 2 X RPMI-1640 Medium.</li>
	<li>1 mL einer Verdünnung 1: 100 oder 1:1,000 in einem Microcentrifuge Schlauch (abhängig von der Trübung der Zellsuspension) vorzubereiten.</li>
	<li>Aliquoten 10 µL dieser Verdünnung, legen Sie sie in einer Hemocytometer-Kammer und die totale Anzahl der Zellen in den vier Quadranten unter dem Mikroskop. Berechnen Sie die Konzentration durch die Formel: (total Zelle Nummer/4) x Verdünnung Faktor X 104 (Kammer Verdünnung konstant).<ol>
<li>Sollte eine 100 % Rentabilität Rentabilität zählt und Wachstum Bedingungen für das Isolat untersucht systematisch korreliert haben. Hinweis: Die Standardisierung und Qualitätssicherung der Lebensfähigkeit zählt können durch Rücken-Plating in Übereinstimmung mit den Europäischen Ausschuss für antimikrobielle Empfindlichkeit Testing (EUCAST) antimykotische minimalen inhibitorischen Konzentration (MIC) Methode für Hefen10 erfolgen .</li>
		<li>Wenn die Wachstum/Lebensfähigkeit Korrelation nicht für das Isolat unter Studie nachgewiesen, Messen Sie die pilzartige Lebensfähigkeit durch lebende Zellen in einem Hemocytometer mit Hilfe der Farbstoffe, die selektiv abgestorbene Zellen, wie z. B. Phloxine B11, Trypan Blau Farbe zählen 12, oder Janus Grün13. Verwenden Sie die Pilzzellen für dieses Protokoll nur, wenn die Lebensfähigkeit der Bevölkerung zu diesem Zeitpunkt 90 % oder höher. Hinweis: Tot/lebendig Farbstoffe funktionieren nicht gut mit dem Pilz der Wahl. Bitte testen sie vor dem Gebrauch. Beispielsweise funktioniert die Trypan blau färben nicht gut mit C. Neoformans.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Danach bereiten die Zellsuspensionen in 2 X RPMI-1640-Mittel (2 X angepasst Inokulum in RPMI-1640 Medium). 96-Well Platten sollten Sie ein Volumen von 5 mL für jede Platte.<ol>
<li>Bereiten Sie alle C. Albicans Stämme ein Lager Zellsuspension von 4 x 103 Zellen/mL. Diese Konzentration ist 2 X der letzte Zelle Konzentration in jede Vertiefung (2 x 103 Zellen/mL).</li>
		<li>C. Neoformans Stämme Vorbereitung einer Aktie Kultur von Zellen 2 x 104 Zellen/mL. Diese Konzentration ist zweimal die endgültige Zellkonzentration in jede Vertiefung (1 x 104 Zellen/mL).</li>
		<li>Andere Pilze-test eine bekannte Antimykotika, welche Konzentration ideal für die besondere Untersuchung in Bezug auf die Inkubationszeit werden. Berücksichtigen Sie Stoffwechsel und die doppelte Zeit des Pilzes.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(3) Peptide (unbekannter Agent)
<ol><li>Die gefriergetrockneten Peptide bei-20 ° C zu speichern und in entionisiertem Wasser vor jedem Experiment auflösen. Die maximale Speicherdauer einmal in Wasser aufgelöst hängt von der Art der jedes Peptid.</li>
	<li>Bereiten Sie Aliquote zweimal die höchste Endkonzentration im Test (2 X) getestet. Im Idealfall bereiten Sie eine kleine Anzahl von aliquoten mit genügend Peptid für einmaligen Gebrauch, Frost-Tau-Zyklen zu vermeiden. Hinweis: Die Wahl der Konzentration sollte auf Literatur und die Eigenschaften des Peptids beruhen. Es wird empfohlen, die serielle Verdünnungen mit ca. 100 µM des Peptids, starten und dann verringern oder erhöhen diese Konzentrationsbereich abhängig von den erzielten Ergebnissen.</li>
</ol>(4) Referenz Antimykotika (Positivkontrolle)
<ol><li>Für diejenigen mit Wasser verdünnt: bereiten Sie eine 2 X Lösung der höchsten Konzentration der Analyse (siehe Abschnitt 5: antimykotische Assay für die Verdünnung Schritte).<ol>
<li>C. Albicans Stämme Vorbereitung einer Lösung aus 128 µg/mL von Fluconazol oder 128 µg/mL Caspofungin. Die Platte Konzentration für beide werden 64 µg/mL.</li>
		<li>Bereiten Sie für C. Neoformans Stämme eine Lösung von 32 µg/mL Amphotericin B (wasserlösliche Lösung). Die Platte Konzentration werden 16 µg/mL. Hinweis: Normalerweise wird Amphotericin B verdünnt in Dimethyl Sulfoxid (DMSO), da dieser Anti-Pilz schlecht löslich in Wasser. Allerdings gibt es wasserlösliche Amphotericin B Präparate im Handel erhältlich.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Für Antimykotika in einem organischen Lösungsmittel verdünnt: Vorbereiten einer 100 X Stammlösung in DMSO, dann bis 10 X im Wasser für den Gebrauch zu verdünnen. Hinweis: Dadurch wird im Brunnen, die Endkonzentration von DMSO 1 % nicht überschreiten. Ein Brunnen, wo der Pilz in Medien mit 1 % DMSO wächst als Kontrolle erforderlich ist, angesichts der Tatsache, dass einige Pilze diese Konzentration des Lösungsmittels nicht gut vertragen. Denken Sie daran, dass DMSO lichtempfindlich ist, also die Platte mit Folie abdecken oder legen Sie sie in eine dunkle Kammer für die Dauer der Inkubationszeit.</li>
</ol>5. antimykotische Assay
Hinweis: In-vitro- antimykotische Assays sind basierend auf der Brühe Microdilution Empfindlichkeitstest von Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) M27-A3-Richtlinien mit einigen Änderungen durchgeführt.
<ol><li>Bereiten Sie eine zweifache serielle Verdünnung jedes Peptid und Steuern Sie Antimykotika in Polystyrol 96-Well-Mikrotiterplatten zu einem Endvolumen von 50 µL.<ol>
<li>Mit einer Pipette 100 µL Antimykotika/Peptid in der 2 X-Konzentration der höchsten gewünschten Endkonzentration in Spalten 1-3, in Zeile A. hinzufügen</li>
		<li>Fügen Sie mithilfe einer Mehrkanal-Pipette 50 µL steriles Wasser in die andere Vertiefungen, in Reihen B bis H.</li>
		<li>50 µL der Brunnen mit der höchsten Konzentration (Reihe A) zu entfernen, an der nächsten gut des nächsten Concentration (Zeile B) übertragen und homogenisieren.</li>
		<li>Wiederholen Sie die Schritte bis zu den Brunnen mit der niedrigsten Konzentration und verwerfen Sie 50 µL des Brunnens (Reihe H) zu. Lassen Sie Spalten 11 und 12 (Reihen A, B, C) mit nur Wasser für Blindkontrolle oder negativ/Wachstumskontrolle.</li>
		<li>Fügen Sie 50 µL 2 X eingestellte Inokulum in RPMI-1640 Medium in jede Vertiefung (Spalten 1 bis 3 und Spalte 11 (negativ/Wachstumskontrolle)); die Endkonzentration für C. Albicans werden 2 x 103 Zellen/mL und die Endkonzentration für C. Neoformans Stämme 104 Zellen/mL werden.</li>
		<li>Bereiten Sie leere Kontrollen (50 µL Wasser + 50 µL 2 X RPMI-1640 Medium ohne Zellen) und negativ/Wachstumskontrolle (50 µL Wasser + 50 µL eingestellt Inokulum 2 X RPMI-1640 Medium ohne Antimykotika) und Last in der well-Platte wie beschrieben oben.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wiederholen Sie die Prozedur für jede Verbindung getestet werden und die gewählten antimykotische Kontrolle (Spalten 4-10). Hinweis: Die serielle Verdünnungen können vertikal durchgeführt werden, als das Experiment unten oder horizontal in der Platte (d. h. wenn die Anzahl der Verdünnungen der gegebenen Verbindung /-Extrakt, der muss getestet werden acht oder mehr).<ol>
<li>Wenn die Verbindungen verweisen Drogen oder einer seiner Komponenten sind lichtempfindlich, führen Sie den Test in reduziertes Licht, die Platten mit Folie abdecken oder legen Sie in eine dunkle Kammer während Inkubationen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Beachten Sie die folgenden optionalen Empfehlungen.<ol>
<li>Versiegeln Sie die Platte mit einer klaren Abdeckplatte, die Gasaustausch, ermöglicht, wie diese Verdunstung reduziert.</li>
		<li>Legen Sie die Platte in eine feuchte Kammer; Es hilft auch, die Verdunstung zu reduzieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inkubieren Sie die Platten bei 37 ° C für 24 h oder 48 h für alle C. Albicans -Stämme und für 48 h mit 200 u/min schütteln für C. Neoformans. Das untere Endvolumen (100 µL) sorgt dafür, dass keine Spillover auftritt. Hinweis: Kein signifikanter Unterschied wurde zwischen MIC Lesungen bei 24 h und 48 h für C. Albicans -Stämme beobachtet. Lesungen in 48 h sind jedoch einfacher zu visualisieren.</li>
	<li>Beobachten Sie alle Brunnen, mit Hilfe von einem umgekehrten optischen Mikroskop vor der Inkubationszeit und nach Änderungen in der Morphologie als auch auf Anzeichen von Kontamination zu überprüfen überprüft. Hinweis: Lesungen können visuell gemacht und fotografiert am Ende des Experiments. Vor jeder Lesung leicht homogenisieren der Plattenrandes. Das liest können auch durchgeführt werden, durch die Messung der OD bei 600 nm, wenn Zelle Klumpen oder Filamentierung nicht eingehalten werden.</li>
	<li>Durchführen Sie die Experimente, mindestens dreimal an gesonderten Terminen.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Microdilution Tests können potenzielle antimykotische Aktivität der Zielsubstanz mit kleinen Mengen der Substanz zu analysieren und gleichzeitig testen Sie es in den unterschiedlichsten Konzentrationen. Dementsprechend wird dieses Protokoll als ersten Schritt im Screening für potenzielle neue antimykotische Substanzen empfohlen. Die hier vorgestellten Protokoll basiert auf der M27-A3 Protokoll, ursprünglich entwickelt, um Hilfe bei der Auswahl der antimykotischen Therapie in Kliniken, und lässt sich eine Vielzahl neuer a...

Pilzinfektionen sind geworden ein wichtiges medizinisches Anliegen in den letzten Jahrzehnten haben erheblich zugenommen, vor allem auf einen Anstieg der Zahl von immungeschwächten Personen wie diejenigen in der Krebsbehandlung und Menschen mit HIV/AIDS oder transplantierten Organe1,2. Jedoch beitragen eine sehr begrenzte Auswahl an verfügbaren Antimykotika und die zunehmende Zahl von Berichten über Pilzresistenz dazu zu den großen Problemen bezüglich der Therapie der systemischen Mykosen3.
Eine potenzielle Quelle für neue antimykotische Substanzen sind antimikrobielle Peptide (AMPs), kleine kationischen Peptide, die von vielen Organismen als Bestandteil ihrer angeborenen Immunantwort auf eine Infektion4produziert. Die Screening-Methode, diese Verbindungen gegen Pilzerreger zu testen ist jedoch nicht standardisiert. Verschiedene Verfahren wurden zur antimykotische Aktivität des AMPs, manchmal für das gleiche Modell Mikroorganismus5,6,7zu beurteilen. Diese Unterschiede und den Mangel an Details in einigen Protokollen erschweren Vergleiche zwischen Verbindungen und behindert Reproduzierbarkeit.
Eine Möglichkeit, die Prüfung von neuen Medikamenten-Kandidaten zu standardisieren soll pilzbefallverhütende Anfälligkeit in klinischen Umgebungen, wie z. B. die klinische Definition verwendet und Laboratory Standards Institute (CLSI) M27-A3 Leitlinien folgen. Jedoch diese antimykotische Sensitivitätstests sind zu restriktiv, und nehmen nicht in Betracht-Variante im Stoffwechsel über Arten, da sie nur für wenige ausgewählte Agenten errichtet wurden. Zum Beispiel nehmen sie nicht zu berücksichtigen die metabolischen Bedürfnisse nicht gärenden Hefen.
Dieses Protokoll ermöglicht die Beurteilung der Tätigkeit des Interessenten antimykotische Substanzen und hier für die Suche nach antimykotische Peptide eingeführt. Es basiert auf der Brühe Microdilution Empfindlichkeitstest aus der CLSI M27-A3-Richtlinien mit Modifikationen, die das Screening von neuen Verbindungen8,9zu optimieren. Diese Änderungen ermöglichen den Einsatz von geringen Mengen an Substanz, Temperatur- oder erste Inokulum und verschiedene Medien für ein optimales Wachstum der Pretest, während die Ergebnisse anhand von Referenz-Antimykotika als Steuerelemente Standardisierung. Diese Methode, mit der Verwendung von Multi-gut Kultur Platten ermöglicht es schnell und zuverlässig eine große Anzahl von Verbindungen auf den Bildschirm.
Aufgrund seiner Flexibilität kann dieses Protokoll mit unterschiedlichen chemischen Klassen von Verbindungen und gegen andere Mikroorganismen, mit wenigen Anpassungen verwendet werden.

<table><tbody><tr><td>Medien und Reagenzien</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium mit L-Glutamin, ohne Natriumbicarbonat</td><td>Thermo Fisher</td><td>31800-022</td><td></td></tr><tr><td>3-(N-morpholino) Propansulfonsäure (MOPS) (o que a gente usa tem um s&oacute; dio, completa o nome dele please)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Zur Pufferung von 2X RPMI Medium</td></tr><tr><td>Natriumchlorid (NaCl)</td><td>Din&acirc; Glimmer</td><td>1528-1</td><td>137 mM für phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td></tr><tr><td>Kaliumchlorid (KCl)</td><td>J.T.Baker</td><td>3040-01</td><td>2,7 mM für phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td></tr><tr><td>Natriumphosphat zweibasisch (Na2HPO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V000129</td><td>10 mM für phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td></tr><tr><td>Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60230</td><td>2 mM für phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td></tr><tr><td>BD Difco Sabouraud Dextrosebrühe</td><td>BD</td><td>238230</td><td></td></tr><tr><td>BD Difco Sabouraud Dextrose Agar</td><td>BD</td><td>210950</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V000123</td><td>35% für (solu&ccedil; &atilde; o de estoque? Criopreserva&ccedil; &atilde; o?)</td></tr><tr><td>Steriles Wasser</td><td></td><td></td><td>Para dilui&ccedil; &atilde; o das drogas na dilui&ccedil; &atilde; o seriada</td></tr><tr><td>Antimykotika</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>Fluconazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8929</td><td></td></tr><tr><td>Caspofungin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PHR1160</td><td></td></tr><tr><td>Plastics</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL konisches Röhrchen</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>Dish Petri</td><td>J.Prolab</td><td>0304-5</td><td></td></tr><tr><td>96 Well-Platte</td><td>Corning</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Solution Reservoir</td><td>KASVI</td><td>K30-208</td><td>Zum Pippieren der Lösungen mit dem Mehrkanal-Pippet</td></tr><tr><td>Equipment und anderen Materialien</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optisches Mikroskop</td><td>Nikon</td><td>E200MV</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifugue</td><td>Thermo Fisher</td><td>MegaFuge 16R</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Ethik Technology</td><td>403-3D</td><td>Set auf 37°; C</td></tr><tr><td>Schüttler</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>Excella E25</td><td>auf 37°; C, 200 U/min</td></tr><tr><td>Zellzählkammer, Neubauer</td><td>BOECO Deutschland</td><td>BOE 13</td><td></td></tr><tr><td>Mehrkanalpipette</td><td>HTL</td><td>5123</td><td></td></tr></tbody></table>

brühe microdilution in vitro screening: eine einfache und schnelle methode, um neue antimykotika verbindungen erkennen

Broth Microdilution In Vitro Screening: An Easy and Fast Method to Detect New Antifungal Compounds

Pilzinfektionen sind in den letzten Jahrzehnten eine wichtige medizinische Voraussetzung geworden, aber die Anzahl der verfügbaren Antimykotika ist begrenzt. In diesem Szenario ist die Suche nach neuen Antimykotika notwendig. Das Protokoll berichtet hier beschreibt eine Methode, um Bildschirm Peptide für ihre antimykotischen Eigenschaften. Es basiert auf der Microdilution-Empfindlichkeitstest Brühe aus den Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) M27-A3-Richtlinien mit Modifikationen an der Erforschung der antimikrobielle Peptide als potenzielle neue Antimykotika. Dieses Protokoll beschreibt einen funktionelle Assay zur Beurteilung der Aktivität von Antimykotika Verbindungen und kann leicht geändert werden, um einer bestimmten Klasse von Molekülen unter Untersuchung zu entsprechen. Da die Assays in 96-Well-Platten mit kleinen Volumina durchgeführt werden, kann eine großangelegte Screening in kürzester Zeit abgeschlossen werden, vor allem, wenn in einer Automatisierung durchgeführt. Dieses Verfahren wird veranschaulicht, wie ein standardisierte und einstellbare klinisches Protokoll die Bank-Arbeit Verfolgung neuer Moleküle, die Therapie von Pilzerkrankungen zu verbessern helfen kann.

Das MIC ist definiert als die niedrigste antimikrobielle Compoundkonzentration, die vollständig sichtbare Pilzwachstum am Ende der Inkubationszeit hemmt. Da das Ziel dieses Protokolls ist es, eine schnelle Methode, um potentielle Antimykotika Bildschirm haben, jeder Brunnen mit klaren Medien ähnlich wie die leeren Brunnen ein positives Ergebnis gilt während jeder mit Trübung analog zu den negativen/Wachstum-Kontroll-Vertiefungen gut als negativ bewertet. Allerdings besteht ein Interesse d...

Eine einfach und anpassungsfähig Brühe Microdilution Methode für das screening von Antimykotika Verbindungen und Extrakte.

Brühe Microdilution In Vitro Screening: eine einfache und schnelle Methode, um neue Antimykotika Verbindungen erkennen

Fungal infections have become an important medical condition in the last decades, but the number of available antifungal drugs is limited. In this ...

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, die Aktivität potenzieller antimykotischer Verbindungen unter Verwendung einer Modifikation des in klinischen Laboratorien verwendeten Bouillon-Mikrodilutions-Empfindlichkeitstests zu bewerten. Diese Methode wird verwendet, um die Pilzaktivität von natürlichen oder synthetischen Verbindungen zu bewerten, einer der ersten Tests bei der Entwicklung von Antimykotika-Therapien. Wir geben Anleitungen für ein erstes Screening auf neue Antimykotika mit kleinen Volumina in kurzer Zeit, insbesondere wenn die Experimente automatisiert durchgeführt werden.Daniel Zamith-Miranda, ein Postdoktorand in meinem Labor, wird das Verfahren vorführen. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie die Pilzstämme für den Assay züchten, wie im Textprotokoll beschrieben. Am folgenden Tag werden die Zellen durch Zentrifugieren der konischen Röhrchen bei 1200 G fünf Minuten lang bei Raumtemperatur entnommen.Entsorgen Sie den Überstand, geben Sie zehn Milliliter PBS in jedes Röhrchen und resuspendieren Sie die Zellen. Erneut bei 1200 g fünf Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren. Wiederholen Sie das PBS-Waschen und zentrifugieren Sie noch zwei weitere Male.Nach der dritten Wäsche resuspendieren Sie die Zellen in fünf Millilitern RPMI 1640 Medium mit doppelter Stärke. Abhängig von der Trübung der Zellsuspension wird ein Milliliter einer Verdünnung von eins zu 100 oder von eins zu 1000 jedes Stammes in einem Mikrozentrifugenröhrchen hergestellt. Aliquat zehn Mikroliter dieser Verdünnung, legen Sie es in eine Hämozytometerkammer und zählen Sie die Gesamtzahl der Zellen in den vier Eckquadranten unter dem Mikroskop.Nachdem Sie die Dichte jeder Zellsuspension berechnet haben, bereiten Sie die Stammzellensuspensionen in doppeltem RPMI 1640-Medium vor. Bereiten Sie 4.000 Zellen pro Milliliter für C.albicans-Stämme und 20.000 Zellen pro Milliliter für C.neoformans-Stämme vor. Die lypholisierten Peptide werden in Aliquats für den einmaligen Gebrauch bei minus 20 Grad Celsius gelagert und vor jedem Experiment nur in deionisiertem Wasser gelöst.Die Peptidkonzentration sollte doppelt so hoch sein wie die höchste im Assay getestete Endkonzentration. Es werden auch Referenz-Antimykotika hergestellt. Der Antimykotika-Assay wird in dreifacher und 96-Well-Polystyrol-Mikrotiterplatten durchgeführt.Unter Verwendung einer zweifachen seriellen Verdünnung jedes Peptids und Kontrollantimykotikums und eines Endvolumens von 50 Mikrolitern pro Well. Der wichtigste Schritt im Protokoll sind die seriellen Verdünnungen, seien Sie also in den nächsten Schritten sehr vorsichtig, um Fehler zu vermeiden, die Ihre gesamte Analyse beeinträchtigen. Geben Sie mit einer Pipette 100 Mikroliter des antimykotischen Peptids in der doppelten Konzentration der höchsten gewünschten Endkonzentration in den Spalten eins bis drei in Reihe A.Geben Sie mit einer Mehrkanalpipette 50 Mikroliter steriles Wasser in die anderen Vertiefungen in den Reihen B bis H.Entnehmen Sie 50 Mikroliter der Vertiefungen mit der höchsten Konzentration.In die entsprechenden Vertiefungen der nächsten Konzentration umfüllen und durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren homogenisieren. Wiederholen Sie die serielle Verdünnung, bis die Vertiefungen mit der niedrigsten Konzentration erreicht sind, und entsorgen Sie 50 Mikroliter aus diesen Vertiefungen. Lassen Sie die Spalten 11 und 12 der Zeilen A, B und C nur Wasser für leere Kontrollen oder Kontrollen für negatives Wachstum.Geben Sie 50 Mikroliter des doppelt stark eingestellten Inokulums in RPMI 1640 Medium in jede Vertiefung der Spalten eins bis drei plus Spalte 11. Die Endkonzentration für C.albicans beträgt 2.000 Zellen pro Milliliter. Die Endkonzentration für C.neoformane beträgt 10.000 Zellen pro Milliliter.Bereiten Sie negative Wachstumskontrollen vor, indem Sie 50 Mikroliter Wasser und 50 Mikroliter angepasstes Inokulum ohne das Antimykotikum mischen. Bereiten Sie Blindkontrollen vor, indem Sie 50 Mikroliter Wasser und 50 Mikroliter Medium ohne Zellen kombinieren. Laden Sie die Steuerungen in die entsprechenden Vertiefungen.Beobachten Sie alle Vertiefungen mit einem inversen optischen Mikroskop und inkubieren Sie die Platten dann bei 37 Grad unter Schütteln bei 200 U/min. Nach der Inkubationszeit sind alle Vertiefungen erneut zu beobachten, um Veränderungen in der Morphologie sowie Anzeichen einer Kontamination zu überprüfen. Nehmen Sie ein Bild jeder Platte mit einer Digitalkamera auf.In diesem repräsentativen Assay wurden drei antimikrobielle Peptide oder AMPs mit Konzentrationen von 100 Mikromolar bis Punkt sieben acht Mikromolar auf ihre antimykotische Aktivität gegen C. neoformans untersucht. Eine Wachstumskontrolle und ein Rohling waren enthalten. Jede Vertiefung mit klaren Medien, die den Blank-Wells ähneln, wird als positives Ergebnis angesehen, während jede Bohrung mit einer Trübung, die der negativen Wachstumskontrollwelle entspricht, als negativ angesehen wird.Da die minimale Hemmkonzentration (MIC) als die niedrigste Konzentration an antimikrobiellen Verbindungen definiert ist, die das sichtbare Pilzwachstum am Ende der Inkubationszeit vollständig hemmt, gelten 25 Mikromolar als MHK für AMP1. Und, 12 Komma fünf Mikromolaren, das MIC für AMP2. AMP3 muss neu bewertet werden, da der Pilz in allen getesteten Konzentrationen gewachsen ist.Auf die gleiche Weise, drei verschiedene Peptide, die gegen C. albicans getestet wurden, ist 50 Mikromolar das MIC für AMP1. Sechs Mikromolare sind das Mikrofon für AMP2 und 25 Mikromolare sind das Mikrofon für AMP3. Ein Beispiel für ein schlechtes Ergebnis, das wahrscheinlich auf unsachgemäßes Pipettieren während des Verdünnungsschritts zurückzuführen ist, wird durch die Spalten fünf bis sieben der Reihe C in dieser Platte veranschaulicht, in denen Unterschiede im Wachstum von C. neoformans zwischen den Replikaten vorhanden sind.Einmal gemeistert, kann diese Technik in etwa zwei Stunden durchgeführt werden, zuzüglich der Zeit des Pilzwachstums, wenn sie richtig durchgeführt wird. Denken Sie daran, sich der physikalisch-chemischen Eigenschaften dieser getesteten Moleküle bewusst zu sein. Verwenden Sie dann geeignete Lösungsmittel als Kontrolle, falls sie benötigt werden, und verwenden Sie die Zellen immer in der gleichen Wachstumsphase.Im Anschluss an dieses Verfahren könnten andere Methoden durchgeführt werden, wie z. B. Time-Kill-Assays, die Verwendung von Viabilitätsfarbstoffen und ST60-Assays, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. ob die Verbindung eine fungizide oder fungistatische Wirkung hat. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der medizinischen Mikrologie, um auf der Suche nach antimykotischen Verbindungen verschiedene Quellen für natürliche oder synthetische Verbindungen zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine Pilzkultur startet, Zellen für den Assay vorbereitet, die seriellen Verdünnungen durchführt und die Ergebnisse abliest, nachdem die Pilzstämme mit unseren getesteten Verbindungen inkubiert wurden.Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit pilzlichen Krankheitserregern äußerst gefährlich sein kann. Bei der Durchführung dieses Verfahrens sollten Vorbereitungen wie das Tragen persönlicher Schutzausrüstung, das Arbeiten in einer biologischen Schutzhaube und die Anwendung geeigneter Sicherheitspraktiken getroffen werden.

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Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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Ein 96-well Mikrotiterplatte-basierten Methode zur Überwachung der Formation und antimykotische Empfindlichkeitsprüfung von Candida albicans Biofilme

Wir haben eine hohe Dichte Microarray-Plattform bestehend aus 3D-Nano-Biofilme von...

Candida albicans Biofilm Chip (Ca BChip) für das Hochdurchsatz-Screening-Antimykotikum

Quelle: Koeth, L. M., et. al., Eine Referenzbouillon-Mikrodilutionsmethode für Dalbavancin  In-vitro-Empfindlichkeitstests von Bakterien, die aerob wachsen. J. Vis. Exp. (2015).Dieses Video zeigt die Bouillon-Mikrodilutionsmethode zur Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration (MIC) eines Lipoglykopeptid-Antibiotikums gegen grampositive Bakterien. Es umfasst die Isolierung von Bakterienkolonien, die Verdünnung, die Inokulation von Mikrotiterplatten-Wells mit unterschiedlichen...

Eine Bouillon-Mikrodilutionsmethode zur Antibiotika-Empfindlichkeitsprüfung von grampositiven Bakterien

Dieses Video zeigt einen In-vitro-Assay zum Screening von Antimykotika mit einem Bouillon-Mikrodilutions-Assay. Die Testverbindungen werden seriell in einer Mikrotiterplatte verdünnt und mit einem Pilzinokulum inkubiert. Nach der Inkubation wird die Platte auf Vertiefungen ohne sichtbares Pilzwachstum untersucht, um das antimykotische Potenzial der Testverbindungen und ihre minimale inhibitorische Konzentration (MIC) zu beurteilen.

Ein in vitro Bouillon-Mikrodilutionsassay für das Screening von antimykotischen Verbindungen

Hier beschreiben wir einen phänotypischen Assay, der auf die High-Throughput/High-Content-Screens von klein-interferierender synthetischer RNA (siRNA), chemischer Verbindung und Mycobacterium tuberculosis mutierte Bibliotheken anwendbar ist. Diese Methode beruht auf dem Nachweis von fluoreszierend gekennzeichneter Mycobacterium tuberculosis in fluoreszierend markierten Wirtszellen mittels automatisierter konfokaler Mikroskopie.

Ein mikroskopischer phänotypischer Assay zur Quantifizierung intrazellulärer Mykobakterien angepasst für High-Throughput/High-Content Screening

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Bestimmung der Dalbavancin-Suszeptibilität klinisch relevanter grampositiver Bakterien unter Verwendung einer Bouillon-Mikrodilutions-Referenzmethodik.

Eine Referenz Broth Mikrodilutionsverfahren für Dalbavancin<em&gt; In-vitro-</em&gt; Empfindlichkeitsprüfung von Bakterien, die wachsen aerob

Hier präsentieren wir Protokolle zum schnellen Screening und zur Charakterisierung von Enzymen auf antimikrobielle Aktivität. Der Mikroschiebe-Diffusionsassay und der Farbstofffreisetzungsassay verwenden bakterielle Zielsubstrate für die qualitative und quantitative Bewertung der enzymatischen Aktivität.

Qualitative und quantitative Assays zur Detektion und Charakterisierung von Protein Antimikrobielle

Es wurde ein Echtzeit-Assay mit hohem Durchsatz entwickelt, um gleichzeitig (1) eukaryotische zellpenetrierende antimikrobielle Wirkstoffe zu identifizieren, die auf einen intrazellulären bakteriellen Krankheitserreger abzielen, und (2) die Zytotoxizität eukaryotischer Zellen zu bewerten. Eine Variation der gleichen Technologie wurde anschließend mit digitaler Dosiertechnologie kombiniert, um einfache, hochauflösende Dosis-Wirkungs-Studien sowie zwei- und dreidimensionale Synergiestudien zu...

Hoher Durchsatz, Echtzeit, Doppel-Ausleseprüfung intrazellulärer antimikrobieller Aktivität und eukaryotischen Zelle Zytotoxizität

Wir haben für die Entdeckung neuer Verbindungen gegen Mycobacterium tuberculosis ein modulares Hochdurchsatz - Screening - System entwickelt, und die intrazelluläre Targeting-Brühe in Bakterien sowie Zytotoxizität gegen die Säuger - Wirtszelle wächst.

System zur Wirksamkeit und Zytotoxizität Screening von Inhibitoren Targeting intrazellulärer<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Wir beschreiben eine modifizierte Agar-basierte Methode zur Quantifizierung der antimykotischen Wirkung pflanzlicher Produkte. Sowohl flüchtige als auch nichtflüchtige Beiträge zur Antimykotika-Aktivität können durch dieses Protokoll bewertet werden. Darüber hinaus kann die Wirksamkeit gegen Pilze in wichtigen Entwicklungsstadien in einem einzigen Versuchsaufbau gemessen werden.

Messung der flüchtigen und nichtflüchtigen Antimykotika-Aktivität von Biocontrol-Produkten

Ein 96-Well-Mikrotiterplatten-basiertes Protokoll unter Verwendung eines 2,3-Bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-carboxanilid-2H-tetrazolium (XTT)-Reduktionstests wird hierin beschrieben, um die Auswirkungen von Antikörpern auf Biofilme zu untersuchen, die von C. tropicalis gebildet werden. Dieses In-vitro-Protokoll kann verwendet werden, um die Wirkung potenzieller neuer antimykotischer Verbindungen auf die metabolische Aktivität von Candida-Spezies-Zellen in Biofilmen zu überprüfen.

Ein löslicher Tetrazolium-basierter Reduktionstest zur Bewertung der Wirkung von Antikörpern auf Candida tropicalis-Biofilme

Lernen Sie die Brühe-Mikroverdünnungsmethode zur schnellen Screening-Untersuchung neuer antimykotischer Verbindungen mit Candida albicans und Cryptococcus neoformans. Diese Technik ermöglicht Forschern die effiziente Bewertung von Natur- und Synthesestoffen.

Brühe Microdilution In Vitro Screening: eine einfache und schnelle Methode, um neue Antimykotika Verbindungen erkennen

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