Brühe Microdilution In Vitro Screening: eine einfache und schnelle Methode, um neue Antimykotika Verbindungen erkennen

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, die Aktivität potenzieller antimykotischer Verbindungen unter Verwendung einer Modifikation des in klinischen Laboratorien verwendeten Bouillon-Mikrodilutions-Empfindlichkeitstests zu bewerten. Diese Methode wird verwendet, um die Pilzaktivität von natürlichen oder synthetischen Verbindungen zu bewerten, einer der ersten Tests bei der Entwicklung von Antimykotika-Therapien. Wir geben Anleitungen für ein erstes Screening auf neue Antimykotika mit kleinen Volumina in kurzer Zeit, insbesondere wenn die Experimente automatisiert durchgeführt werden.

Daniel Zamith-Miranda, ein Postdoktorand in meinem Labor, wird das Verfahren vorführen. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie die Pilzstämme für den Assay züchten, wie im Textprotokoll beschrieben. Am folgenden Tag werden die Zellen durch Zentrifugieren der konischen Röhrchen bei 1200 G fünf Minuten lang bei Raumtemperatur

Entsorgen Sie den Überstand, geben Sie zehn Milliliter PBS in jedes Röhrchen und resuspendieren Sie die Zellen. Erneut bei 1200 g fünf Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren. Wiederholen Sie das PBS-Waschen und zentrifugieren Sie noch zwei weitere Male.

Nach der dritten Wäsche resuspendieren Sie die Zellen in fünf Millilitern RPMI 1640 Medium mit doppelter Stärke. Abhängig von der Trübung der Zellsuspension wird ein Milliliter einer Verdünnung von eins zu 100 oder von eins zu 1000 jedes Stammes in einem Mikrozentrifugenröhrchen hergestellt. Aliquat zehn Mikroliter dieser Verdünnung, legen Sie es in eine Hämozytometerkammer und zählen Sie die Gesamtzahl der Zellen in den vier Eckquadranten unter dem Mikroskop.

Nachdem Sie die Dichte jeder Zellsuspension berechnet haben, bereiten Sie die Stammzellensuspensionen in doppeltem RPMI 1640-Medium vor. Bereiten Sie 4.000 Zellen pro Milliliter für C.albicans-Stämme und 20.000 Zellen pro Milliliter für C.neoformans-Stämme vor. Die lypholisierten Peptide werden in Aliquats für den einmaligen Gebrauch bei minus 20 Grad Celsius gelagert und vor jedem Experiment nur in deionisiertem Wasser gelöst.

Die Peptidkonzentration sollte doppelt so hoch sein wie die höchste im Assay getestete Endkonzentration. Es werden auch Referenz-Antimykotika hergestellt. Der Antimykotika-Assay wird in dreifacher und 96-Well-Polystyrol-Mikrotiterplatten durchgeführt.

Unter Verwendung einer zweifachen seriellen Verdünnung jedes Peptids und Kontrollantimykotikums und eines Endvolumens von 50 Mikrolitern pro Well. Der wichtigste Schritt im Protokoll sind die seriellen Verdünnungen, seien Sie also in den nächsten Schritten sehr vorsichtig, um Fehler zu vermeiden, die Ihre gesamte Analyse beeinträchtigen. Geben Sie mit einer Pipette 100 Mikroliter des antimykotischen Peptids in der doppelten Konzentration der höchsten gewünschten Endkonzentration in den Spalten eins bis drei in Reihe A.Geben Sie mit einer Mehrkanalpipette 50 Mikroliter steriles Wasser in die anderen Vertiefungen in den Reihen B bis H.Entnehmen Sie 50 Mikroliter der Vertiefungen mit der höchsten Konzentration.

In die entsprechenden Vertiefungen der nächsten Konzentration umfüllen und durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren homogenisieren. Wiederholen Sie die serielle Verdünnung, bis die Vertiefungen mit der niedrigsten Konzentration erreicht sind, und entsorgen Sie 50 Mikroliter aus diesen Vertiefungen. Lassen Sie die Spalten 11 und 12 der Zeilen A, B und C nur Wasser für leere Kontrollen oder Kontrollen für negatives Wachstum.

Geben Sie 50 Mikroliter des doppelt stark eingestellten Inokulums in RPMI 1640 Medium in jede Vertiefung der Spalten eins bis drei plus Spalte 11. Die Endkonzentration für C.albicans beträgt 2.000 Zellen pro Milliliter. Die Endkonzentration für C.neoformane beträgt 10.000 Zellen pro Milliliter.

Bereiten Sie negative Wachstumskontrollen vor, indem Sie 50 Mikroliter Wasser und 50 Mikroliter angepasstes Inokulum ohne das Antimykotikum mischen. Bereiten Sie Blindkontrollen vor, indem Sie 50 Mikroliter Wasser und 50 Mikroliter Medium ohne Zellen kombinieren. Laden Sie die Steuerungen in die entsprechenden Vertiefungen.

Beobachten Sie alle Vertiefungen mit einem inversen optischen Mikroskop und inkubieren Sie die Platten dann bei 37 Grad unter Schütteln bei 200 U/min. Nach der Inkubationszeit sind alle Vertiefungen erneut zu beobachten, um Veränderungen in der Morphologie sowie Anzeichen einer Kontamination zu überprüfen. Nehmen Sie ein Bild jeder Platte mit einer Digitalkamera auf.

In diesem repräsentativen Assay wurden drei antimikrobielle Peptide oder AMPs mit Konzentrationen von 100 Mikromolar bis Punkt sieben acht Mikromolar auf ihre antimykotische Aktivität gegen C. neoformans untersucht. Eine Wachstumskontrolle und ein Rohling waren enthalten. Jede Vertiefung mit klaren Medien, die den Blank-Wells ähneln, wird als positives Ergebnis angesehen, während jede Bohrung mit einer Trübung, die der negativen Wachstumskontrollwelle entspricht, als negativ angesehen wird.

Da die minimale Hemmkonzentration (MIC) als die niedrigste Konzentration an antimikrobiellen Verbindungen definiert ist, die das sichtbare Pilzwachstum am Ende der Inkubationszeit vollständig hemmt, gelten 25 Mikromolar als MHK für AMP1. Und, 12 Komma fünf Mikromolaren, das MIC für AMP2. AMP3 muss neu bewertet werden, da der Pilz in allen getesteten Konzentrationen gewachsen ist.

Auf die gleiche Weise, drei verschiedene Peptide, die gegen C. albicans getestet wurden, ist 50 Mikromolar das MIC für AMP1. Sechs Mikromolare sind das Mikrofon für AMP2 und 25 Mikromolare sind das Mikrofon für AMP3. Ein Beispiel für ein schlechtes Ergebnis, das wahrscheinlich auf unsachgemäßes Pipettieren während des Verdünnungsschritts zurückzuführen ist, wird durch die Spalten fünf bis sieben der Reihe C in dieser Platte veranschaulicht, in denen Unterschiede im Wachstum von C. neoformans zwischen den Replikaten vorhanden sind.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in etwa zwei Stunden durchgeführt werden, zuzüglich der Zeit des Pilzwachstums, wenn sie richtig durchgeführt wird. Denken Sie daran, sich der physikalisch-chemischen Eigenschaften dieser getesteten Moleküle bewusst zu sein. Verwenden Sie dann geeignete Lösungsmittel als Kontrolle, falls sie benötigt werden, und verwenden Sie die Zellen immer in der gleichen Wachstumsphase.

Im Anschluss an dieses Verfahren könnten andere Methoden durchgeführt werden, wie z. B. Time-Kill-Assays, die Verwendung von Viabilitätsfarbstoffen und ST60-Assays, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. ob die Verbindung eine fungizide oder fungistatische Wirkung hat. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der medizinischen Mikrologie, um auf der Suche nach antimykotischen Verbindungen verschiedene Quellen für natürliche oder synthetische Verbindungen zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine Pilzkultur startet, Zellen für den Assay vorbereitet, die seriellen Verdünnungen durchführt und die Ergebnisse abliest, nachdem die Pilzstämme mit unseren getesteten Verbindungen inkubiert wurden.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit pilzlichen Krankheitserregern äußerst gefährlich sein kann. Bei der Durchführung dieses Verfahrens sollten Vorbereitungen wie das Tragen persönlicher Schutzausrüstung, das Arbeiten in einer biologischen Schutzhaube und die Anwendung geeigneter Sicherheitspraktiken getroffen werden.