Mikrofluidische Chips für In Situ Crystal-Röntgenbeugung und In Situ dynamische Lichtstreuung für serielle Kristallographie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Herstellung und der Betrieb eines mikrofluidischen Geräts zur Erfassung von Röntgenbeugungsdaten zur Proteinkristallisation bei Raumtemperatur. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Kristallisation im Inneren des Chips die mechanische Störung der Proteinkristalle minimiert. Diese röntgentransparenten Chips sind einfach herzustellen, können direkt auf Goniometer der meisten Synchrotron-Beamlines montiert werden und nutzen die verfügbaren Kristalle effizient bei der Erfassung von Röntgenbeugungsdaten.

Platzieren Sie zunächst eine Urform des Röntgenchip-Designs in einer 10 Zentimeter großen, mit Aluminiumfolie ausgelegten Petrischale. Mischen Sie insgesamt etwa 30 Gramm PDMS-Basis und Härter im Verhältnis 10 zu eins und gießen Sie das PDMS bis zu einer Höhe von vier Millimetern auf den Master. Entgasen Sie das PDMS fünf Minuten lang in einem Vakuumexsikkator und blasen Sie Luft, um verbleibende Luftblasen auf der Oberfläche des PDMS zu entfernen.

Härten Sie das PDMS eine Stunde lang in einem Ofen bei 70 Grad Celsius aus. Schälen Sie dann die ausgehärtete PDMS-Form vorsichtig vom Master. Verwenden Sie ein Skalpell, um das überschüssige PDMS abzuschneiden.

Stellen Sie vor der Herstellung von Röntgenchips sicher, dass der Arbeitsbereich so eingerichtet ist, dass er während des Epoxidformgusses einen einfachen Zugang zu allen erforderlichen Geräten und Komponenten ermöglicht. Um mit der Chipherstellung zu beginnen, verdünnen Sie die Vorläufer eines Zweikomponenten-Epoxidharzes mit Ethanol auf eine endgültige Ethanolmassenkonzentration von 40 Gew.-%. Mischen Sie mit einem Wirbelmischer Epoxidharz und Ethanol miteinander.

Entgasen Sie die PDMS-Form 30 Minuten lang in einem Vakuumexsikkator, um sicherzustellen, dass das PDMS später kleine Luftblasen aus dem Epoxidharz aufnehmen kann. Schneiden Sie ein 70 Millimeter x 70 Millimeter großes Stück 7,5 Mikrometer dicke Polyimidfolie zu und wickeln Sie die Folie um einen 75 Millimeter x 50 Millimeter großen Glasobjektträger. Klebe die Kanten der Folie auf die Rückseite des Objektträgers, um eine flache, starre Polyimid-Oberfläche zu bilden.

Behandeln Sie die gleitende Polyimidfolie 20 Sekunden lang mit Sauerstoffplasma. Inkubieren Sie die Folie dann fünf Minuten lang bei 20 Grad Celsius in einer wässrigen Lösung von APTS oder GPTS. Während der Silanisierung die Epoxidharz-Vorläuferlösungen mit einem kleinen Spatel gründlich vermischen.

Übertragen Sie die entgaste PDMS-Form aus dem Vakuumexsikkator auf eine ebene Fläche. Trocknen Sie die silanisierte Polyimidfolie mit Druckluft oder Stickstoffgas. Tragen Sie schnell ein Tröpfchen der Harzmischung auf jede Mikrostruktur auf der Form auf.

Legen Sie die Polyimidfolie mit dem Objektträger mit der bedruckten Seite nach unten auf das Epoxidharz und drücken Sie den Objektträger fest an. Decken Sie die Baugruppe mit einer Plastikfolie und einem Blech ab. Platzieren Sie Gewichte auf dem Blech, um einen Druck von bis zu 1,4 Newton pro Quadratzentimeter auf die Baugruppe auszuüben.

Trennen Sie nach 15 Minuten den Objektträger vorsichtig von der Polyimidfolie mit Epoxidmuster und wischen Sie die Polyimidfolie ab, bis sie trocken ist. Legen Sie Plastikfolie, Blech und Gewichte wieder darauf. Lassen Sie das Epoxidharz eine Stunde lang bei Raumtemperatur aushärten.

Entfernen Sie anschließend die Gewichte, das Blech und die Plastikfolie. Ziehen Sie die gemusterte Polyimidfolie vorsichtig aus der PDMS-Form. Behandeln Sie die gemusterte Folie 20 Sekunden lang mit Plasma und silanisieren Sie die gemusterte Folie entweder mit APTS oder GPTS, wie zuvor beschrieben.

Silanisieren Sie eine makellose Polyimidfolie mit der anderen Silanlösung unter den gleichen Bedingungen. Trocknen Sie beide Folien mit Druckluft. Tragen Sie dann einen Tropfen deionisiertes Wasser auf eine saubere, trockene, ebene Oberfläche auf.

Schneiden Sie einzelne Chipstrukturen auf Polyimidfolie und legen Sie die gemusterte Polyimidfolie mit der Epoxidseite nach oben auf den Wassertropfen und glätten Sie die Folie vorsichtig, bis sie vollständig flach ist. Legen Sie die zweite Polyimidfolie mit der silanisierten Vorderseite nach unten auf die gemusterte Folie. Glätten Sie die zweite Folie vorsichtig von der Ecke in die gegenüberliegende Ecke, um Luftblasen auszustoßen und die Polyimidplatten miteinander zu verbinden.

Um mit der Herstellung der Zugangsöffnungen zu beginnen, schneiden Sie aus einer ausgehärteten, vier Millimeter großen PDMS-Platte einen Block von ausreichender Größe, um alle Anschlüsse im Polyimid-Röntgenchip abzudecken, ohne das Kristallisationsfach zu bedecken. Behandeln, silanisieren und trocknen Sie den Polyimid-Chip und den PDMS-Block im Plasma. Drücken Sie den behandelten Block auf den Chip über den Anschlüssen.

Decken Sie den Chip mit einer Plastikfolie, einem sauberen Glasobjektträger und einem Blech ab. Üben Sie eine Stunde lang einen Druck von 1,4 Newton pro Quadratzentimeter aus. Verwenden Sie anschließend einen 0,75-Millimeter-Biopsiestanzer, um Einlass- und Auslasslöcher zu stanzen, die im Chipdesign markiert sind.

Versiegeln Sie die Rückseite des Chips mit elektrischem Isolierband aus Polyimidfolie. Verdünnen Sie dann eine 9 Gew.-% Stammlösung aus transparentem Fluorpolymer-Beschichtungsmaterial auf 0,45 Gew.-% mit einem fluorierten Lösungsmittel. Verbinden Sie eine 27-Gauge-Nadel mit einem Durchmesser von 5/8 Zoll mit der Spritze.

Stecken Sie einen Schlauch aus Polytetrafluorethylen über das Ende der Nadel. Laden Sie die Fluorpolymerlösung in eine Ein-Milliliter-Luer-Lock-Spritze. Verbinden Sie das andere Ende des Schlauchs mit dem Röntgenchipauslass.

Injizieren Sie die Fluorpolymerlösung in den Chip, bis alle Kanäle gefüllt sind, und entfernen Sie überschüssige Fluorpolymerlösung mit einer mit Luft gefüllten Spritze. Legen Sie den gefüllten Chip mit der flachen Seite nach unten auf eine Herdplatte bei 190 Grad Celsius. Erhitzen Sie den Chip fünf Minuten lang, um das Lösungsmittel zu verdampfen, wodurch die Kanäle mit dem Fluorpolymer beschichtet werden.

Vor dem Kristallisationsverfahren filtrieren Sie die gewählte Proteinlösung mit einem 0,2-Mikron-Filter. Die Lösung wird 15 Minuten lang bei 16, 100 g und 20 Grad Celsius zentrifugiert und der Überstand für die Kristallisationsexperimente zurückgewonnen. Um den Kristallisationsprozess zu starten, kombinieren Sie gleiche Volumina einer Proteinlösung und ihres Fällungsmittels.

Ziehen Sie etwa 20 Mikroliter dieser Mischung in eine Spritze. Verwenden Sie eine 27-Gauge-Nadel mit 5/8 Zoll und PTFE-Schlauch, um die Spritze mit dem Einlass des Röntgenchips zu verbinden. Schließen Sie eine Spritze mit fluoriertem Öl auf die gleiche Weise an den Auslass an.

Während Sie den Chip unter einem Mikroskop überwachen, füllen Sie die Kristallisationslösung durch den Einlass in den Chip mit dem parallelen Layout. Injizieren Sie ausreichend fluoriertes Öl, um die Kristallisationskammern im Chip zu trennen. Blockieren Sie dann sowohl die Einlass- als auch die Auslassöffnungen mit Büroklammern oder anderen schmalen Steckern.

Lagern Sie den Chip unter den entsprechenden Kristallisationsbedingungen. Die Kristallbildung kann nun unter dem Mikroskop oder durch dynamische Lichtstreumessungen beobachtet werden. Wenn Sie für die Datenerfassung bereit sind, befestigen Sie den Röntgenchip mit doppelseitigem Klebeband an einem 3D-gedruckten Adapter für das Plattengoniometer.

Montieren Sie den Chip-Adapter am Plattengoniometer an der Synchrotron-Beamline. Sammeln und analysieren Sie die Beugungsdaten. Mit Hilfe der Hellfeldmikroskopie wurde die Verdampfungsrate von Wasser aus den Kristallisationskammern des Polyimid-Folienchips quantifiziert.

Dynamische Lichtstreuung konnte die anfängliche Keimbildung von Thaumatin-Kristallen in einem PDMS-Chip auf einem Objektträger mit gleichwertiger Geometrie nachweisen, wodurch die Kristallisationsbedingungen optimiert werden konnten. 10 Beugungsmuster wurden von jedem der 83 Thaumatin-Kristalle gesammelt, die in einem Polyimid-Chip mit einer Drehung von einem Grad während jedes Frames gezüchtet wurden. Der Datensatz wurde in fünf Unterdatensätze pro Frame aufgeteilt, und der Intensitätsabfall der normierten Beugungsleistung über die Zeit wurde dann ausgewertet.

Im vierten Datensatz war die Beugungsleistung auf unter 50 % gesunken. Die R-Faktor-Messwerte der Teildatensätze stiegen im Laufe der Zeit an, was darauf hindeutet, dass die Kristalle während der Datenerfassung Strahlenschäden erlitten haben. Dies wurde darauf zurückgeführt, dass freie Radikale, die während der Röntgenstrahlung gebildet wurden und benachbarte Kristalle im selben Kompartiment abbauen. Die bipyramidalen Thaumatin-Kristalle wiesen eine breite Verteilung der Orientierungen im Röntgenchip auf.

Orthorhombische Glukose-Isomerase-Kristalle zeigten ebenfalls eine breite Verteilung der Orientierungen, wenn sie in einem Polyimid-Chip gezüchtet wurden. Thioredoxinkristalle wiesen jedoch überwiegend Orientierungen in den Ebenen xy, xz und yz auf, möglicherweise aufgrund ihrer länglichen Form. Generell sind diese Chips sehr robust und haben einen geringen Röntgenhintergrund.

Damit eignet sich diese Herstellungsmethode auch für andere Röntgenbildgebungsverfahren, wie z. B. die Kleinwinkel-Röntgenstreuung. Dieses Verfahren kann leicht an Ihre experimentellen Anforderungen angepasst werden. So kann beispielsweise das Chip-Design modifiziert werden, indem die Abmessungen der einzelnen Kammern oder die Gesamtzahl der Kammern pro Chip angepasst werden.

Ein besonderes Augenmerk lag für uns darauf, einen Arbeitsablauf zu entwickeln, der keine kostenintensiven Geräte wie Spezialwerkzeuge oder Mikrofluidikpumpen erfordert. Nachdem Sie dieses Video angesehen und das Manuskript gelesen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man im Chip kristallisiert, den Kristallisationsprozess überwacht und Beugungsdaten mit dem Chip-Ansatz aufzeichnet und analysiert. Einmal gemeistert, ermöglicht diese Technik die Serienfertigung von mikrofluidischen Chips von einem PDMS-Master in etwa drei Stunden, ohne dass ein spezieller Reinraum erforderlich ist.