Name: Mikrofluidische Chips für In Situ Crystal-Röntgenbeugung und In Situ dynamische Lichtstreuung für serielle Kristallographie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: Lernen Sie die Herstellung mikrofluidischer Chips für Protein-Kristallisation und Röntgenbeugung bei Raumtemperatur. Diese Methode minimiert mechanische Störungen und ermöglicht effiziente Datenerfassung an Synchrotron-Strahllinien.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Diese Arbeit wurde unterstützt vom PIER Seed Fonds PIF-2015-46, das BMBF gewährt, 05K16GUA und 05K12GU3 und des Exzellenzclusters "The Hamburg Zentrum für ultraschnelle Imaging – Struktur, Dynamik und Kontrolle der Materie auf atomarer Skala" der deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG). Die Arbeit der Autoren verbunden mit dem Center for Free-Electron Laser Science wurde von der Helmholtz-Gemeinschaft durch orientierte Fördermittel finanziert. Die Synchrotron MX Daten wurden am Strahlrohr P14 betrieben von EMBL Hamburg bei PETRA III-Speicherring (DESY, Hamburg, Deutschland).

<ol><li>Rasmussen, B. F., Stock, A. M., Ringe, D., Petsko, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystalline+ribonuclease+A+loses+function+below+the+dynamical+transition+at+220+K%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystalline ribonuclease A loses function below the dynamical transition at 220 K.</a> Nature. 357 (6377), 423-424 (1992).</li>
<li>Tilton, R. F. J. R., Dewan, J. C., Petsko, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+temperature+on+protein+structure+and+dynamics%3A+X-ray+crystallographic+studies+of+the+protein+ribonuclease-A+at+nine+different+temperatures+from+98+to+320+K%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Effects of temperature on protein structure and dynamics: X-ray crystallographic studies of the protein ribonuclease-A at nine different temperatures from 98 to 320 K.</a> Biochemistry. 31 (9), 2469-2481 (1992).</li>
<li>Fraser, J. S., Clarkson, M. W., Degnan, S. C., Erion, R., Kern, D., Alber, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hidden+alternative+structures+of+proline+isomerase+essential+for+catalysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Hidden alternative structures of proline isomerase essential for catalysis.</a> Nature. 462 (7273), 669-673 (2009).</li>
<li>Juers, D. H., Matthews, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+solvent+transport+in+cryo-annealing+of+macromolecular+crystals%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+D%22%5BJournal%5D)">The role of solvent transport in cryo-annealing of macromolecular crystals.</a> Acta Crystallogr. D. 60 (Pt 3), 412-421 (2004).</li>
<li>Huang, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+meso+in+situ+serial+X-ray+crystallography+of+soluble+and+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+D%22%5BJournal%5D)">In meso in situ serial X-ray crystallography of soluble and membrane proteins.</a> Acta Crystallogr. D. 71 (Pt 6), 1238-1256 (2015).</li>
<li>Gati, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+structure+of+granulin+determined+from+native+nanocrystalline+granulovirus+using+an+X-ray+free-electron+laser%5BTitle%5D)+AND+%22P.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Atomic structure of granulin determined from native nanocrystalline granulovirus using an X-ray free-electron laser.</a> P. Natl. Acad. Sci. USA. 114 (9), 2247-2252 (2017).</li>
<li>Gati, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+crystallography+on+in+vivo+grown+microcrystals+using+synchrotron+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">Serial crystallography on in vivo grown microcrystals using synchrotron radiation.</a> IUCrJ. 1 (Pt 2), 87-94 (2014).</li>
<li>von Dreele, R. B. <a target="_blank" href="http://scripts.iucr.org/cgi-bin/paper?S0021889806045493">Multipattern Rietveld refinement of protein powder data.</a> J. Appl. Crystallogr. 40 (1), 133-143 (2007).</li>
<li>Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipidic+cubic+phase+technologies+for+membrane+protein+structural+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Lipidic cubic phase technologies for membrane protein structural studies.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 21 (4), 559-566 (2011).</li>
<li>Gati, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGati%2C+C+%22Data+processing+and+analysis+in+serial+crystallography+at+advanced+X-ray+sources%22">Data processing and analysis in serial crystallography at advanced X-ray sources</a>. , Dissertation, Hamburg (2015).</li>
<li>Stellato, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Room-temperature+macromolecular+serial+crystallography+using+synchrotron+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">Room-temperature macromolecular serial crystallography using synchrotron radiation.</a> IUCrJ. 1 (Pt 4), 204-212 (2014).</li>
<li>Botha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Room-temperature+serial+crystallography+at+synchrotron+X-ray+sources+using+slowly+flowing+free-standing+high-viscosity+microstreams%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+D%22%5BJournal%5D)">Room-temperature serial crystallography at synchrotron X-ray sources using slowly flowing free-standing high-viscosity microstreams.</a> Acta Crystallogr. D. 71 (Pt 2), 387-397 (2015).</li>
<li>Nogly, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipidic+cubic+phase+serial+millisecond+crystallography+using+synchrotron+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">Lipidic cubic phase serial millisecond crystallography using synchrotron radiation.</a> IUCrJ. 2 (Pt 2), 168-176 (2015).</li>
<li>Martin-Garcia, J. M., Conrad, C. E., Coe, J., Roy-Chowdhury, S., Fromme, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4909539/">Review: Serial femtosecond crystallography: A revolution in structural biology.</a> Arch. Biochem. Biophys. 602, 32-47 (2016).</li>
<li>White, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://scripts.iucr.org/cgi-bin/paper?db5097">CrystFEL: A software suite for snapshot serial crystallography.</a> J Appl Crystallogr. 45 (2), 335-341 (2012).</li>
<li>Perry, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+approach+for+protein+structure+determination+at+room+temperature+via+on-chip+anomalous+diffraction%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A microfluidic approach for protein structure determination at room temperature via on-chip anomalous diffraction.</a> Lab Chip. 13 (16), 3183-3187 (2013).</li>
<li>Schlichting, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+femtosecond+crystallography%3A+the+first+five+years%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">Serial femtosecond crystallography: the first five years.</a> IUCrJ. 2 (Pt 2), 246-255 (2015).</li>
<li>Sui, S., Perry, S. L. <a target="_blank" href="http://aca.scitation.org/doi/abs/10.1063/1.4979640">Microfluidics: From crystallization to serial time-resolved crystallography.</a> Struct. Dynam.-US. 4 (3), (2017).</li>
<li>Ghazal, A., Lafleur, J. P., Mortensen, K., Kutter, J. P., Arleth, L., Jensen, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+X-ray+compatible+microfluidics+for+applications+in+soft+materials+and+life+sciences%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Recent advances in X-ray compatible microfluidics for applications in soft materials and life sciences.</a> Lab Chip. 16 (22), 4263-4295 (2016).</li>
<li>Heymann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Room-temperature+serial+crystallography+using+a+kinetically+optimized+microfluidic+device+for+protein+crystallization+and+on-chip+X-ray+diffraction%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">Room-temperature serial crystallography using a kinetically optimized microfluidic device for protein crystallization and on-chip X-ray diffraction.</a> IUCrJ. 1 (Pt 5), 349-360 (2014).</li>
<li>Schubert, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multicrystal+diffraction+data-collection+approach+for+studying+structural+dynamics+with+millisecond+temporal+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">A multicrystal diffraction data-collection approach for studying structural dynamics with millisecond temporal resolution.</a> IUCrJ. 3 (Pt 6), 393-401 (2016).</li>
<li>Weierstall, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipidic+cubic+phase+injector+facilitates+membrane+protein+serial+femtosecond+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Lipidic cubic phase injector facilitates membrane protein serial femtosecond crystallography.</a> Nat. Commun. 5, 3309(2014).</li>
<li>Conrad, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+inert+crystal+delivery+medium+for+serial+femtosecond+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">A novel inert crystal delivery medium for serial femtosecond crystallography.</a> IUCrJ. 2 (Pt 4), 421-430 (2015).</li>
<li>Cohen, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Goniometer-based+femtosecond+crystallography+with+X-ray+free+electron+lasers%5BTitle%5D)+AND+%22P.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Goniometer-based femtosecond crystallography with X-ray free electron lasers.</a> P. Natl. Acad. Sci. USA. 111 (48), 17122-17127 (2014).</li>
<li>Erskine, D., YU, P. Y., Freilich, S. C. <a target="_blank" href="http://www.spectralfringe.org/EDI/MyOlderPubs/PolyImide1988.pdf">High-Pressure Visible Spectroscopy of Polyimide Film.</a> J. Polym. Sci. Pol. Lett. 26 (11), 465-468 (1988).</li>
<li>Tsai, C. -L., Yen, H. -J., Chen, W. -C., Liou, G. -S. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2012/jm/c2jm32480f">Novel solution-processable optically isotropic colorless polyimidothioethers-TiO2 hybrids with tunable refractive index.</a> J. Mater. Chem. 22 (33), 17236-17244 (2012).</li>
<li>Destremaut, F., Salmon, J. -B., Qi, L., Chapel, J. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+with+on-line+dynamic+light+scattering+for+size+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidics with on-line dynamic light scattering for size measurements.</a> Lab Chip. 9 (22), 3289-3296 (2009).</li>
<li>Chastek, T. Q., Iida, K., Amis, E. J., Fasolka, M. J., Beers, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+platform+for+integrated+synthesis+and+dynamic+light+scattering+measurement+of+block+copolymer+micelles%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A microfluidic platform for integrated synthesis and dynamic light scattering measurement of block copolymer micelles.</a> Lab Chip. 8 (6), 950-957 (2008).</li>
<li>Heymann, M., Fraden, S., Kim, D. <a target="_blank" href="http://ieeexplore.ieee.org/document/6589983/">Multi-Height Precision Alignment With Selectively Developed Alignment Marks.</a> J. Microelectromech. S. 23 (2), 424-427 (2014).</li>
<li>Schubert, R., et al. <a target="_blank" href="http://scripts.iucr.org/cgi-bin/paper?jo5012">Reliably distinguishing protein nanocrystals from amorphous precipitate by means of depolarized dynamic light scattering.</a> J Appl Crystallogr. 48 (5), 1476-1484 (2015).</li>
<li>Aghvami, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0925400517304318">Rapid prototyping of cyclic olefin copolymer (COC) microfluidic devices.</a> Sensor Actuat. B-Chem. 247, 940-949 (2017).</li>
<li>Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWalker%2C+JM+%22The+Proteomics+Protocols+Handbook%22">The Proteomics Protocols Handbook</a>. , Humana Press Inc. Totowa, NJ. (2005).</li>
<li>Kabsch, W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2815665/">XDS.</a> Acta Crystallogr D. 66 (Pt 2), 125-132 (2010).</li>
<li>Vagin, A., Teplyakov, A. <a target="_blank" href="http://scripts.iucr.org/cgi-bin/paper?dz5175">Molecular replacement with MOLREP.</a> Acta Crystallogr. D. 66 (Pt 1), 22-25 (2010).</li>
<li>Winn, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+the+CCP4+suite+and+current+developments%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+D%22%5BJournal%5D)">Overview of the CCP4 suite and current developments.</a> Acta Crystallogr. D. 67, 235-242 (2011).</li>
<li>Murshudov, G. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((REFMAC5+for+the+refinement+of+macromolecular+crystal+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+D%22%5BJournal%5D)">REFMAC5 for the refinement of macromolecular crystal structures.</a> Acta Crystallogr. D. 67 (Pt 4), 355-367 (2011).</li>
<li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+and+development+of+Coot%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+D%22%5BJournal%5D)">Features and development of Coot.</a> Acta Crystallogr. D. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).</li>
<li>Owen, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploiting+fast+detectors+to+enter+a+new+dimension+in+room-temperature+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+D%22%5BJournal%5D)">Exploiting fast detectors to enter a new dimension in room-temperature crystallography.</a> Acta Crystallogr. D. 70 (Pt 5), 1248-1256 (2014).</li>
<li>Kabsch, W. <a target="_blank" href="http://scripts.iucr.org/cgi-bin/paper?wi0022">Automatic-Indexing of Rotation Diffraction Patterns.</a> J. Appl. Crystallogr. 21, 67-71 (1988).</li>
<li>Zarrine-Afsar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallography+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+D%22%5BJournal%5D)">Crystallography on a chip.</a> Acta Crystallogr. D. 68 (Pt 3), 321-323 (2012).</li>
<li>Boukellal, H., Selimović, S., Jia, Y., Cristobal, G., Fraden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple%2C+robust+storage+of+drops+and+fluids+in+a+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Simple, robust storage of drops and fluids in a microfluidic device.</a> Lab Chip. 9 (2), 331-338 (2009).</li>
<li>Aghvami, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+prototyping+of+cyclic+olefin+copolymer+%28COC%29+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Sens.+Actuator+B+Chem%22%5BJournal%5D)">Rapid prototyping of cyclic olefin copolymer (COC) microfluidic devices.</a> Sens. Actuator B Chem. 247, 940-949 (2017).</li>
<li>Shemesh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stationary+nanoliter+droplet+array+with+a+substrate+of+choice+for+single+adherent%2Fnonadherent+cell+incubation+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Stationary nanoliter droplet array with a substrate of choice for single adherent/nonadherent cell incubation and analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 111 (31), 11293-11298 (2014).</li>
<li>Sun, M., Bithi, S. S., Vanapalli, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+static+droplet+arrays+with+tuneable+gradients+in+material+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic static droplet arrays with tuneable gradients in material composition.</a> Lab Chip. 11 (23), 3949-3952 (2011).</li>
<li>Shim, J. -U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+and+measurement+of+the+phase+behavior+of+aqueous+solutions+using+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Control and measurement of the phase behavior of aqueous solutions using microfluidics.</a> J. Am. Chem. Soc. 129 (28), 8825-8835 (2007).</li>
<li>Schubert, R., Meyer, A., Baitan, D., Dierks, K., Perbandt, M., Betzel, C. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acs.cgd.6b01826">Real-Time Observation of Protein Dense Liquid Cluster Evolution during Nucleation in Protein Crystallization.</a> Cryst. Growth Des. 17 (6), 3579(2017).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Wir fertigen mikrofluidischen Geräten für in Situ Röntgenbeugung von Epoxidharz als Füllung Material und Polyimid-Folie als Fenstermaterial Musterung. Unser Verfahren optimiert verschiedene Schritte von der Fertigung über früheren Röntgen-Chip-Designs16,21. Wir reduziert die Fensterdicke und damit gleichzeitig auch Herstellung Streuung Hintergrund so weniger Prozessschritte erforderlich sind. in Situ Kristallisation über das beschriebene Protokoll hat erhebliche Vorteile. Es ermöglicht die Beugung Datenerhebung bei Raumtemperatur und damit schließt die Notwendigkeit der Cryo-Schutz, die in einigen Fällen das Risiko der Einschleppung von Artefakten in der Proteinstruktur enthält. Darüber hinaus unterliegen die Kristalle nicht körperliche Belastung, weil die Übertragung der Kristalle aus ihrer natürlichen Umgebung vermieden werden kann. Durch dieses Verfahren die Kristalle behalten ihre höchste Qualität und eine Behandlung nicht leiden.
Nach unserer Erfahrung umkreisen die kritischsten Schritte innerhalb des Protokolls der Kristallisation zu kontrollieren. Die Parameter x-ray geeignet Kristalle mit entsprechenden Dimensionen zu erhalten müssen empirisch ermittelt werden und können nicht auf einer Dampf-Diffusion-Experimente direkt entnommen werden. Mit identischen Konzentrationen des Proteins und Fällungsmittel ergaben nicht immer Kristalle in verschiedenen Chips, oder zeitweise in verschiedenen Brunnen innerhalb der gleichen Chip. Dies bedeutet, dass alle Faktoren, die die Kristall Keimbildung und Wachstum sorgfältig, wie Mutter Alkohol Zusammensetzung oder Kristallisation Kinetik (durch die Verdunstung Flugbahn) berücksichtigt werden sollte. Da größere Kristalle zu höheren Auflösung beugen, sind entsprechend große Kristalle im Idealfall gewachsen. Der Prozess der Kristall Kernbildung und Wachstum kann mit DLS Messungen folgen. Anpassung der Laserfokus innerhalb der ~ 50 µm dünnen Kristallisation Fächer des Chips können eine Herausforderung sein und erfordern sorgfältige manuelle Ausrichtung. Mithilfe von Brunnen tiefer als 100 µm war Laserausrichtung Auto machbar und verlässlich, so dass mehrere Brunnen durch automatisierte Übernahme Systeme überwacht werden können.
Polyimid-basierte x-ray Chips produzieren nur einen geringe Hintergrund und wir zeigen die Eignung dieser Geräte für Routine-x-ray Diffraction Datenerhebung durch das Lösen von Strukturen für drei Modell-Proteine. Die beste Auflösung erzielt in Chip unterschieden, im Vergleich zu vorher erreichten Auflösungen von deutlich größeren Proteinkristallen und konventionelle Röntgen-Datenerfassung. Dies kann durch mehrere Faktoren bedingt sein und weitere Kristallisation Zustand Optimierung kann weiter verbessern die Beugung. Es war möglich, Daten in Situ Beugung bis zu 1,8 Å Auflösung Anwendung Kristall mit Abmessungen kleiner als 30 µm. Die detaillierte Analyse der Thaumatin Beugung Daten lieferte Einblicke über Strahlenschäden. Um das Ausmaß der Schäden zu begrenzen, sollte nur ein einziger Kristall pro Fach in das Gerät mikrofluidischen ausgesetzt werden, da die Diffusion von radikalen und in benachbarten Kristalle auftreten kann. Um die Geschwindigkeit der Datenerfassung zu verbessern, sollte dies in Zukunft automatisiert werden.
Kristall-Morphologie kann in einigen Fällen eine bevorzugte Ausrichtung auftreten. Dies war z. B. der Fall mit dem Dataset Thioredoxin wo hatte die Kristalle eine stark bevorzugte Ausrichtung bezogen auf die Chip-Fenster. Auch hier konnten wir eine vollständige Beugung Dataset sammeln. Wenn Kristalle eine bevorzugte Orientierung im Chip weisen und vor allem wenn die entsprechende Raumgruppe auch eine niedrige Symmetrie hat, dann die Vollständigkeit des Datasets werden während der Sammlung überwacht sollten so dass genügend Beugung Muster Zuckerrohr gesammelt.
Zeitaufgelöste Untersuchungen mit diesen Chips sind direkt möglich, wenn mit Hilfe von Licht Reaktionen mit einem Pumpe-Sonde-Ansatz induzierten. Polyimid-Folie-Lichtdurchlässigkeit für die Pumpe Laser muss aufgeklärt werden und alternativ optisch klar Polyimid oder COC genutzt werden. Die aktuellen mikrofluidischen Geometrien erlauben keine Substrat mischen Experimente, nachdem die Kristalle gewachsen sind. Wir erwarten jedoch, dass die beschriebenen Röntgen Chip Herstellung Protokoll auch für solche Entwürfe für beide Zeitaufgelöste Röntgenbeugung mischen sowie Streuung Ansätze19geeignet.

Zu wissen, die 3D-Struktur eines Proteins ist wichtig zu verstehen, seine Funktionalität. In der Nähe von atomarer Auflösung Strukturen ergeben sich bisher am häufigsten durch Röntgen-Kristallographie. Diese Technik setzt Proteinkristallen, Röntgenstrahlung und die daraus resultierende Beugungsmuster werden dann für die Strukturaufklärung und Verfeinerung analysiert. In herkömmlichen Röntgen-Kristallographie wird eine vollständige Beugung Dataset aus einem einzigen, im Idealfall großen Kristall bei kryogenen Temperaturen aufgezeichnet. Solche Kristalle sind jedoch meist nicht trivial zu wachsen, und geeignete Kryokonservierung Bedingungen identifizieren zu können werden selbst anspruchsvolle und kann manchmal auch dazu führen, dass Abweichungen von der native Protein-Struktur-5.
Jüngsten technologischen Fortschritte in der Röntgen-freie-Elektronen-Laser (FEL) und Synchrotron Beamlines konnten Strukturen aus kleinere Kristalle zu lösen, als neue Mikro-Fokussierung Beamlines, erhöhte Röntgen Strahlen Brillanz und verbesserte Röntgendetektoren wurde verfügbar6,7. Kleine Kristalle sind in der Regel einfacher zu wachsen als große und freie Kristalle8,9defekt. Allerdings leiden kleine Kristalle von x-ray Strahlenschäden viel schneller als große Kristalle. Dies liegt daran, im Vergleich zu einem großen Kristall, eine höhere Strahlendosis muss in ein kleineres Kristall-Volumen zu beugen, vergleichbare Auflösung projiziert werden. Deshalb sogar kryogenen Schutz oft nicht ausreichend, um eine vollständige Beugung Datensatz aus einem einzigen weiteren aufnehmen.
Um diese Hürde zu überwinden, ist die serielle Kristallographie geworden die Methode der Wahl zum Sammeln und Zusammenführen von Beugungsmuster aus vielen zufällig orientierte Mikrokristalle, ein komplettes Dataset zu erhalten. Strahlung induzierte Kristall Schaden minimiert wird durch die Verbreitung der gesamten Strahlendosis verwendet, um eine Protein-Struktur über eine hohe Anzahl von Kristallen5,10zu lösen. In einem "beugen zuvor zerstören" FEL experimentieren, jeder Kristall wird nur für eine Belichtung mit Femto-Sekunden-röntgenpulse verwendet. Mikro-Fokus Beamlines an Dritte Generation Synchrotron Quellen können wiederum serielle Kristallographie mit ein paar Millisekunden kurzen Röntgen Aufnahmen11,12,13,14durchführen. Ohne eine Kristall-Oszillation oder Drehung während der Datenerfassung, jedoch nur teilweise Bragg Reflexionen können aufgezeichnet werden und damit Zehntausende oder mehr Beugungsmuster sind in der Regel für die Bestimmung der Struktur15erforderlich. Bisher wurde für serielle Kristallographie, eine vielfältige Reihe von Beispielmethoden Lieferung als vor kurzem überprüft14,16,17,18,19. Unter denen Basis mehrere feste Ziel musterlieferung, die Strategien erfolgreich mit Kristall Drehung während der Röntgen-Aufnahmen kombiniert wurden, so dass deutlich weniger Beugungsmuster ebenso komplette Datensätze bereitstellen können, und auch verbrauchen weniger Probe im Vergleich zu klassischen seriellen Kristallographie aufgezeichnet Experimente wo Standbilder sind7,16,20,21,22,23 , 24.
Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll zur mikrofluidischen Geräte mit niedrigen röntgenhintergrund fabrizieren. Die Geräte sind aus 5-min Epoxy-Kleber mit weichen Lithographie gemustert und eignen sich für in-Situ- Röntgenbeugung Experimente bei Raumtemperatur, die von der Integration der Probenvorbereitung direkt in die Röntgen-Einrichtung, wie des Fall mit profitieren Zeitaufgelöste Untersuchungen, die mischen-induzierte Kinetik18,19folgen. Mikrofluidische Kanäle sind auf beiden Seiten mit Polymeren Polyimid-Folie, was x-ray Windows mit einer kombinierten Dicke von etwa 16 µm, die niedrige Röntgenbildgebung Hintergrund ermöglichen Lidern. Alle verwendete Materialien bieten gute Lösemittelbeständigkeit. Dieses Herstellungsverfahren ist vergleichsweise einfach und kostengünstig. Nach der Beschaffung von SU-8 master Wafer kann alle Herstellung außerhalb ein Reinraum Labor inmitten der typischen Forschung abgeschlossen werden.
Ein Anwendungsbeispiel beschreibt Chips für Goniometer feste Vorgabe serielle Kristallographie basiert. Erstens sind die Konstruktion und Fertigung Überlegungen für die Verwendung von Kapillar Ventiltechnik, Microfluidically aufteilen eine wässrige Reaktion in eine ausgewählte Anzahl von Nanoliter große Tröpfchen diskutiert. Diese Lademechanismus vermeidet Probenverlust von Toten-Lautstärke des Kanals und Aufteilung kann leicht manuell durchgeführt werden ohne Verwendung von Pumpen oder andere Ausrüstung für flüssige Betätigung. Solche isolierten Nanoliter Größe Tropfen Proteinlösung sind überwachte in Situ mit dynamische Lichtstreuung (DLS) zur Kontrolle Protein Crystal Kernbildung und Wachstum. Es wurde bereits nachgewiesen, dass in mikrofluidischen Geräte bestehend aus einem Polydimethylsiloxan (PDMS) Struktur gebunden an ein Glas Folie25,26DLS Messungen durchgeführt werden können. Denn die polyimidschicht eine hohe Transmission für Wellenlängen mehr als 550 hat nm, der Ansatz kann auf verlängert werden Messungen in x-ray transparente Chips als auch bei der Verwendung einer geeigneten Laser Wellenlänge27,28. Basierend auf den Ergebnissen der DLS, anfängliche Keimbildung kann beobachtet werden, und weitere Tropfen verdampfen kann gestoppt werden, um weniger, aber größeren Proteinkristallen zu erhalten.
Nachdem genügend Kristalle gezüchtet werden, können komplette x-ray Diffraction Datasets dann mit Goniometer basiert in Situ korrigiert Ziel serielle Röntgenkristallographie bei Raumtemperatur gesammelt werden. Beugung Datasets werden mit einer Suite von Software-Tools und Skripte um zu lösen die Proteinstruktur Kristall verarbeitet. Diese Technik vermeidet Artefakte oft induzierte während der Kryokonservierung in konventionellen Kristallographie Experimente verwendet.
Wir vergleichen drei Protein Zielstrukturen, die gelöst wurden mit etwa 10-20 µm kleinen Kristalle im Chip besser als 2 Å Auflösung gewachsen. Durch Kristallisation und interferenzgitters in Situ, Handling und somit mechanische Störungen des fragilen Kristalle wird minimiert. Dieses Protokoll kann für Proteinkristallen die beugen auf hoher Auflösung als auch niedriger Auflösung (1.7 Å bis 3.0 Å) angewendet werden. Wie fast jeder Kristall für Beugung verwendet werden kann, wird wenig Probe verschwendet, so dass dies eine sehr effiziente Kristall Übermittlungsmethode.
Dieses Protokoll enthält eine detaillierte Anleitung zum Röntgen transparent mikrofluidischen Chips für in Situ Protein Kristallisation und Beugung Datenerfassung vorbereiten. Das Verfahren wurde sorgfältig von mikrofluidischen Präzision profitieren ohne hoch entwickelte Ausrüstung im Labor entwickelt. Auch kann Datenerhebung auf das Synchrotron-Strahlrohr durchgeführt werden ohne spezielle Goniometer oder Luftbefeuchter zu erleichtern, die Ergebnisse zu reproduzieren von nicht-Experten. Die vorgestellte Technik kann serielle Millisekunde Kristallographie Datenerhebung bei Raumtemperatur unter Beibehaltung der Strahlenschäden minimal und ohne Stress zu den Kristallen nach Wachstum Cryo-Schutz oder Kristall Behandlung beantragt werden. Daher eignet sich das beschriebene Verfahren für jedes Protein-Kristallisation-Projekt.

<table><tbody><tr><td>SU-8 3000 Serie</td><td>MicroChem Corp.</td><td>SU-8 3000</td><td>Fotolack</td></tr><tr><td>PGMEA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>484431</td><td>Entwickler</td></tr><tr><td>Isopropylalkohol</td><td></td><td></td><td>Lösungsmittel</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td></td><td></td><td>Lösungsmittel</td></tr><tr><td>Epoxidkleber</td><td>UHU</td><td>Plus Schnellfest 5 min</td><td>Epoxidkleber</td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184</td><td>Silikon</td></tr><tr><td>Kapton Folie</td><td>Dupont/ Amerikanische Durafilm</td><td>HN-Güte, Feinheit 30 (7,5 &mu; m)</td><td>Polyimidfolie</td></tr><tr><td>APTS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440140</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>GPTS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440167</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Cytop CTX-109AE</td><td>Asahi Glass Co. Ltd</td><td>Cytop CTX-109AE</td><td>Cytop Fluorpolymer-Beschichtung</td></tr><tr><td>CT-Solv 100E</td><td>Asahi Glass Co. Ltd</td><td>CT-Solv 100E</td><td>Cytop Fluorlösungsmittel</td></tr><tr><td>HFE-7500</td><td>3M</td><td>Novec 7500</td><td>Fluoriertes Öl</td></tr><tr><td>AutoCAD</td><td>AutoDesk Inc.</td><td>AutoCAD</td><td>CAD-Software</td></tr><tr><td>Biopsie-Stanze</td><td>Harris</td><td>Uni-core 0,75 mm</td><td></td></tr><tr><td>Fotomaske</td><td>JD Photo Data</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-Zoll-Wafer</td><td>Universitätswafer</td><td></td><td>Siliziumwafer</td></tr><tr><td>Masken-Aligner S</td><td>&Uuml; SS MicroTec</td><td>MJB4</td><td>Mask Aligner</td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Mixer Thinky</td><td>ARE-250</td><td></td></tr><tr><td>Plasmamaschine</td><td>Diener electronic</td><td>Zepto</td><td></td></tr><tr><td>Thaumatin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T7638</td><td>Protein</td></tr><tr><td>Glukose Isomerase</td><td>Hamton Research</td><td>HR7-102</td><td>Protein</td></tr><tr><td>Bis-Tris</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B9754</td><td>Chemisch</td></tr><tr><td>Natriumtartrat</td><td>Merck</td><td>106664</td><td>Chemikalie</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10812846001</td><td>Chemikalie</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth</td><td>6763.2</td><td>Chemikalie</td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>208337</td><td>Chemikalie</td></tr><tr><td>Ammoniumsulfat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4418</td><td>Chemikalie</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E6758</td><td>Chemisches</td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1064060250</td><td>Chemisches</td></tr><tr><td>PEG1500</td><td>Molekulare Abmessungen</td><td>MD2-100-6</td><td>Chemisches</td></tr><tr><td>SPG-Puffer</td><td>Jena Bioscience</td><td>CSS-389</td><td>Chemisches</td></tr><tr><td>SpectroLight600</td><td>XtalConcepts</td><td></td><td>DLS Instrument</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Spektralphotometer</td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultimaker2</td><td>Ultimaker</td><td></td><td>3D-Drucker</td></tr><tr><td>Form2</td><td>Formlabs</td><td></td><td>3D-Drucker</td></tr><tr><td>Amicon Filter</td><td>Sartorius Stedim</td><td></td><td>0.2 &micro; m filter</td></tr><tr><td>Schlauch</td><td>Adtech Polymer Engineering Ltd</td><td>Bioblock/05</td><td>PTFE-Schlauch 0,3 mm Innendurchmesser x 0,76 mm Außendurchmesser</td></tr><tr><td>Spritzen&nbsp;</td><td>BD</td><td>309628</td><td>1ml Luer-Lock-Nadel</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Terumo Agani Nadel</td><td>AN*2716R1</td><td>27Gx5/8"</td></tr></tbody></table>

mikrofluidische chips für in situ crystal-röntgenbeugung und in situ dynamische lichtstreuung für serielle kristallographie

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

Dieses Protokoll beschreibt Herstellung mikrofluidischen Geräte mit niedrigen röntgenhintergrund optimiert für Goniometer feste Vorgabe serielle Kristallographie basiert. Die Geräte sind aus Epoxy-Kleber mit weichen Lithographie gemustert und eignen sich für in Situ Röntgenbeugung Experimente bei Raumtemperatur. Die Probe-Brunnen sind auf beiden Seiten mit Polymeren Polyimid-Folie Windows Lidern, die Beugung Datenerfassung mit niedrigen röntgenhintergrund ermöglichen. Dieses Herstellungsverfahren ist anspruchslos und preiswert. Nach der Beschaffung eines SU-8 master Wafers kann alle außerhalb ein Reinraum in einer typischen Research Lab-Umgebung abgeschlossen werden. Das Chip-Design und Fertigung-Protokoll nutzen Kapillare Ventiltechnik, Microfluidically eine wässrige Reaktion in definierten Nanoliter große Tröpfchen aufgeteilt. Diese Lademechanismus vermeidet Probenverlust aus Kanal tot-Volumen und kann leicht manuell ohne Verwendung von Pumpen oder andere Ausrüstung für flüssige Betätigung durchgeführt werden. Wir beschreiben, wie isolierte Nanoliter Größe Tropfen Proteinlösung überwachten in Situ durch dynamisches Licht Kontrolle Protein Crystal Kernbildung und Wachstum Streuung kann. Nach geeigneten Kristalle gezüchtet werden, können komplette x-ray Diffraction Datasets mit Goniometer basiert in Situ korrigiert Ziel serielle Röntgenkristallographie bei Raumtemperatur gesammelt werden. Das Protokoll enthält benutzerdefinierte Skripts um Beugung Datasets mit einer Suite von Software-Tools zu lösen und verfeinern die Proteinstruktur Kristall zu verarbeiten. Dieser Ansatz vermeidet die Artefakte, die möglicherweise während der Kryokonservierung oder manuelle Handhabung in konventionellen Kristallographie Experimente Kristall induziert. Wir zeigen und vergleichen Sie drei Proteinstrukturen, die gelöst wurden mit kleinen Kristallen mit Abmessungen von ca. 10-20 µm in Chip gewachsen. Durch Kristallisation und interferenzgitters in Situ, Handling und somit mechanische Störungen des fragilen Kristalle wird minimiert. Das Protokoll beschreibt, wie Sie einen benutzerdefinierten Röntgen transparent mikrofluidischen Chip geeignet für in Situ serielle Kristallographie zu fabrizieren. Da fast jeder Kristall zur Beugung Datenerfassung eingesetzt werden kann, sind diese mikrofluidischen Chips eine sehr effiziente Kristall Übermittlungsmethode.

Dieses Protokoll beschreibt im Detail wie fabrizieren und mikrofluidischen Geräte zur Röntgenbeugung Datenerfassung bei Raumtemperatur betrieben. Darüber hinaus beschreibt die Kristallisation von Proteinen durch dynamische Lichtstreuung zu überwachen und Informationen zum Verarbeiten und analysieren erhalten Beugung Daten.

Mikrofluidische Chips für In Situ Crystal-Röntgenbeugung und In Situ dynamische Lichtstreuung für serielle Kristallographie

This protocol describes fabricating microfluidic devices with low X-ray background optimized for goniometer based fixed target serial crystallography. The ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Herstellung und der Betrieb eines mikrofluidischen Geräts zur Erfassung von Röntgenbeugungsdaten zur Proteinkristallisation bei Raumtemperatur. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Kristallisation im Inneren des Chips die mechanische Störung der Proteinkristalle minimiert. Diese röntgentransparenten Chips sind einfach herzustellen, können direkt auf Goniometer der meisten Synchrotron-Beamlines montiert werden und nutzen die verfügbaren Kristalle effizient bei der Erfassung von Röntgenbeugungsdaten.Platzieren Sie zunächst eine Urform des Röntgenchip-Designs in einer 10 Zentimeter großen, mit Aluminiumfolie ausgelegten Petrischale. Mischen Sie insgesamt etwa 30 Gramm PDMS-Basis und Härter im Verhältnis 10 zu eins und gießen Sie das PDMS bis zu einer Höhe von vier Millimetern auf den Master. Entgasen Sie das PDMS fünf Minuten lang in einem Vakuumexsikkator und blasen Sie Luft, um verbleibende Luftblasen auf der Oberfläche des PDMS zu entfernen.Härten Sie das PDMS eine Stunde lang in einem Ofen bei 70 Grad Celsius aus. Schälen Sie dann die ausgehärtete PDMS-Form vorsichtig vom Master. Verwenden Sie ein Skalpell, um das überschüssige PDMS abzuschneiden.Stellen Sie vor der Herstellung von Röntgenchips sicher, dass der Arbeitsbereich so eingerichtet ist, dass er während des Epoxidformgusses einen einfachen Zugang zu allen erforderlichen Geräten und Komponenten ermöglicht. Um mit der Chipherstellung zu beginnen, verdünnen Sie die Vorläufer eines Zweikomponenten-Epoxidharzes mit Ethanol auf eine endgültige Ethanolmassenkonzentration von 40 Gew.-%. Mischen Sie mit einem Wirbelmischer Epoxidharz und Ethanol miteinander.Entgasen Sie die PDMS-Form 30 Minuten lang in einem Vakuumexsikkator, um sicherzustellen, dass das PDMS später kleine Luftblasen aus dem Epoxidharz aufnehmen kann. Schneiden Sie ein 70 Millimeter x 70 Millimeter großes Stück 7,5 Mikrometer dicke Polyimidfolie zu und wickeln Sie die Folie um einen 75 Millimeter x 50 Millimeter großen Glasobjektträger. Klebe die Kanten der Folie auf die Rückseite des Objektträgers, um eine flache, starre Polyimid-Oberfläche zu bilden.Behandeln Sie die gleitende Polyimidfolie 20 Sekunden lang mit Sauerstoffplasma. Inkubieren Sie die Folie dann fünf Minuten lang bei 20 Grad Celsius in einer wässrigen Lösung von APTS oder GPTS. Während der Silanisierung die Epoxidharz-Vorläuferlösungen mit einem kleinen Spatel gründlich vermischen.Übertragen Sie die entgaste PDMS-Form aus dem Vakuumexsikkator auf eine ebene Fläche. Trocknen Sie die silanisierte Polyimidfolie mit Druckluft oder Stickstoffgas. Tragen Sie schnell ein Tröpfchen der Harzmischung auf jede Mikrostruktur auf der Form auf.Legen Sie die Polyimidfolie mit dem Objektträger mit der bedruckten Seite nach unten auf das Epoxidharz und drücken Sie den Objektträger fest an. Decken Sie die Baugruppe mit einer Plastikfolie und einem Blech ab. Platzieren Sie Gewichte auf dem Blech, um einen Druck von bis zu 1,4 Newton pro Quadratzentimeter auf die Baugruppe auszuüben.Trennen Sie nach 15 Minuten den Objektträger vorsichtig von der Polyimidfolie mit Epoxidmuster und wischen Sie die Polyimidfolie ab, bis sie trocken ist. Legen Sie Plastikfolie, Blech und Gewichte wieder darauf. Lassen Sie das Epoxidharz eine Stunde lang bei Raumtemperatur aushärten.Entfernen Sie anschließend die Gewichte, das Blech und die Plastikfolie. Ziehen Sie die gemusterte Polyimidfolie vorsichtig aus der PDMS-Form. Behandeln Sie die gemusterte Folie 20 Sekunden lang mit Plasma und silanisieren Sie die gemusterte Folie entweder mit APTS oder GPTS, wie zuvor beschrieben.Silanisieren Sie eine makellose Polyimidfolie mit der anderen Silanlösung unter den gleichen Bedingungen. Trocknen Sie beide Folien mit Druckluft. Tragen Sie dann einen Tropfen deionisiertes Wasser auf eine saubere, trockene, ebene Oberfläche auf.Schneiden Sie einzelne Chipstrukturen auf Polyimidfolie und legen Sie die gemusterte Polyimidfolie mit der Epoxidseite nach oben auf den Wassertropfen und glätten Sie die Folie vorsichtig, bis sie vollständig flach ist. Legen Sie die zweite Polyimidfolie mit der silanisierten Vorderseite nach unten auf die gemusterte Folie. Glätten Sie die zweite Folie vorsichtig von der Ecke in die gegenüberliegende Ecke, um Luftblasen auszustoßen und die Polyimidplatten miteinander zu verbinden.Um mit der Herstellung der Zugangsöffnungen zu beginnen, schneiden Sie aus einer ausgehärteten, vier Millimeter großen PDMS-Platte einen Block von ausreichender Größe, um alle Anschlüsse im Polyimid-Röntgenchip abzudecken, ohne das Kristallisationsfach zu bedecken. Behandeln, silanisieren und trocknen Sie den Polyimid-Chip und den PDMS-Block im Plasma. Drücken Sie den behandelten Block auf den Chip über den Anschlüssen.Decken Sie den Chip mit einer Plastikfolie, einem sauberen Glasobjektträger und einem Blech ab. Üben Sie eine Stunde lang einen Druck von 1,4 Newton pro Quadratzentimeter aus. Verwenden Sie anschließend einen 0,75-Millimeter-Biopsiestanzer, um Einlass- und Auslasslöcher zu stanzen, die im Chipdesign markiert sind.Versiegeln Sie die Rückseite des Chips mit elektrischem Isolierband aus Polyimidfolie. Verdünnen Sie dann eine 9 Gew.-% Stammlösung aus transparentem Fluorpolymer-Beschichtungsmaterial auf 0,45 Gew.-% mit einem fluorierten Lösungsmittel. Verbinden Sie eine 27-Gauge-Nadel mit einem Durchmesser von 5/8 Zoll mit der Spritze.Stecken Sie einen Schlauch aus Polytetrafluorethylen über das Ende der Nadel. Laden Sie die Fluorpolymerlösung in eine Ein-Milliliter-Luer-Lock-Spritze. Verbinden Sie das andere Ende des Schlauchs mit dem Röntgenchipauslass.Injizieren Sie die Fluorpolymerlösung in den Chip, bis alle Kanäle gefüllt sind, und entfernen Sie überschüssige Fluorpolymerlösung mit einer mit Luft gefüllten Spritze. Legen Sie den gefüllten Chip mit der flachen Seite nach unten auf eine Herdplatte bei 190 Grad Celsius. Erhitzen Sie den Chip fünf Minuten lang, um das Lösungsmittel zu verdampfen, wodurch die Kanäle mit dem Fluorpolymer beschichtet werden.Vor dem Kristallisationsverfahren filtrieren Sie die gewählte Proteinlösung mit einem 0,2-Mikron-Filter. Die Lösung wird 15 Minuten lang bei 16, 100 g und 20 Grad Celsius zentrifugiert und der Überstand für die Kristallisationsexperimente zurückgewonnen. Um den Kristallisationsprozess zu starten, kombinieren Sie gleiche Volumina einer Proteinlösung und ihres Fällungsmittels.Ziehen Sie etwa 20 Mikroliter dieser Mischung in eine Spritze. Verwenden Sie eine 27-Gauge-Nadel mit 5/8 Zoll und PTFE-Schlauch, um die Spritze mit dem Einlass des Röntgenchips zu verbinden. Schließen Sie eine Spritze mit fluoriertem Öl auf die gleiche Weise an den Auslass an.Während Sie den Chip unter einem Mikroskop überwachen, füllen Sie die Kristallisationslösung durch den Einlass in den Chip mit dem parallelen Layout. Injizieren Sie ausreichend fluoriertes Öl, um die Kristallisationskammern im Chip zu trennen. Blockieren Sie dann sowohl die Einlass- als auch die Auslassöffnungen mit Büroklammern oder anderen schmalen Steckern.Lagern Sie den Chip unter den entsprechenden Kristallisationsbedingungen. Die Kristallbildung kann nun unter dem Mikroskop oder durch dynamische Lichtstreumessungen beobachtet werden. Wenn Sie für die Datenerfassung bereit sind, befestigen Sie den Röntgenchip mit doppelseitigem Klebeband an einem 3D-gedruckten Adapter für das Plattengoniometer.Montieren Sie den Chip-Adapter am Plattengoniometer an der Synchrotron-Beamline. Sammeln und analysieren Sie die Beugungsdaten. Mit Hilfe der Hellfeldmikroskopie wurde die Verdampfungsrate von Wasser aus den Kristallisationskammern des Polyimid-Folienchips quantifiziert.Dynamische Lichtstreuung konnte die anfängliche Keimbildung von Thaumatin-Kristallen in einem PDMS-Chip auf einem Objektträger mit gleichwertiger Geometrie nachweisen, wodurch die Kristallisationsbedingungen optimiert werden konnten. 10 Beugungsmuster wurden von jedem der 83 Thaumatin-Kristalle gesammelt, die in einem Polyimid-Chip mit einer Drehung von einem Grad während jedes Frames gezüchtet wurden. Der Datensatz wurde in fünf Unterdatensätze pro Frame aufgeteilt, und der Intensitätsabfall der normierten Beugungsleistung über die Zeit wurde dann ausgewertet.Im vierten Datensatz war die Beugungsleistung auf unter 50 % gesunken. Die R-Faktor-Messwerte der Teildatensätze stiegen im Laufe der Zeit an, was darauf hindeutet, dass die Kristalle während der Datenerfassung Strahlenschäden erlitten haben. Dies wurde darauf zurückgeführt, dass freie Radikale, die während der Röntgenstrahlung gebildet wurden und benachbarte Kristalle im selben Kompartiment abbauen. Die bipyramidalen Thaumatin-Kristalle wiesen eine breite Verteilung der Orientierungen im Röntgenchip auf.Orthorhombische Glukose-Isomerase-Kristalle zeigten ebenfalls eine breite Verteilung der Orientierungen, wenn sie in einem Polyimid-Chip gezüchtet wurden. Thioredoxinkristalle wiesen jedoch überwiegend Orientierungen in den Ebenen xy, xz und yz auf, möglicherweise aufgrund ihrer länglichen Form. Generell sind diese Chips sehr robust und haben einen geringen Röntgenhintergrund.Damit eignet sich diese Herstellungsmethode auch für andere Röntgenbildgebungsverfahren, wie z. B. die Kleinwinkel-Röntgenstreuung. Dieses Verfahren kann leicht an Ihre experimentellen Anforderungen angepasst werden. So kann beispielsweise das Chip-Design modifiziert werden, indem die Abmessungen der einzelnen Kammern oder die Gesamtzahl der Kammern pro Chip angepasst werden.Ein besonderes Augenmerk lag für uns darauf, einen Arbeitsablauf zu entwickeln, der keine kostenintensiven Geräte wie Spezialwerkzeuge oder Mikrofluidikpumpen erfordert. Nachdem Sie dieses Video angesehen und das Manuskript gelesen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man im Chip kristallisiert, den Kristallisationsprozess überwacht und Beugungsdaten mit dem Chip-Ansatz aufzeichnet und analysiert. Einmal gemeistert, ermöglicht diese Technik die Serienfertigung von mikrofluidischen Chips von einem PDMS-Master in etwa drei Stunden, ohne dass ein spezieller Reinraum erforderlich ist.

microfluidic-chips-for-situ-crystal-x-ray-diffraction-situ-dynamic

Research

Forschung

JoVE Journal

Chemistry

Chemie

Die Verwendung von Elektronenkanal-Kontrastbildgebung in einem Rasterelektronenmikroskop zur Charakterisierung von Defekten in III-V/Si-heteroexpitaxialen Dünnschichten wird beschrieben. Diese Methode liefert ähnliche Ergebnisse wie die Draufsicht-Transmissionselektronenmikroskopie, jedoch in deutlich kürzerer Zeit, da keine Probenvorbereitung erforderlich ist.

Electron Channeling Contrast Imaging Rapid III-V heteroepitaktischen Charakterisierung

Wir beschreiben eine Strahlrohr Setup soll schnelle zweidimensionale Röntgen Fluoreszenz und x-ray Microdiffraction Zuordnung von Einzelproben Kristall oder Pulver mit Laue (polychromatische Strahlung) oder Pulver (monochromatische Strahlung) Beugung durchzuführen. Die resultierenden Karten geben Auskunft über die Belastung, Orientierung und Phasenverteilung plastische Verformung.

Synchrotron Röntgenstrahl Microdiffraction und Fluoreszenz-Bildgebung von Mineral- und Gesteinsproben

In diesem Papier wird das Herstellungsprotokoll von mikrofluidischen Chips erläutert, das für die Proteinkristallisation auf dem Chip mit der Dialysemethode und in situ Röntgenbeugungsexperimenten entwickelt wurde. Der Mikroherstellungsprozess ermöglicht es, eine semipermeable regenerierte Zellulosedialysemembran mit einem beliebigen Molekulargewichts-Cut-off zwischen zwei Schichten des Chips zu integrieren.

Kristallisation von Proteinen auf Chip durch Mikrodialyse für In Situ-Röntgenbeugungsstudien

Es wird ein vielseitiges mikrofluidisches Gerät beschrieben, das die Kristallisation eines Enzyms mittels der Gegendiffusionsmethode, das Einbringen eines Substrats in die Kristalle durch Einweichen und die 3D-Strukturbestimmung des Enzyms:Substrat-Komplex durch eine serielle Analyse von Kristallen im Inneren des Chips bei Raumtemperatur ermöglicht.

Kristallisation und strukturelle Bestimmung eines Enzyms: Substratkomplex durch serielle Kristallisation in einem vielseitigen mikrofluidischen Chip

Das hier vorgestellte Protokoll beschreibt die Verwendung von Spotiton, einem neuartigen Robotersystem, um zwei interessante Proben auf ein selbstableitendes Nanodrahtgitter zu liefern, das sich vor der Vitrifikation in flüssigem Kryogen mindestens 90 ms vermischt.

Kryo-elektronenmikroskopische Gittervorbereitung für zeitaufgelöste Studien mit einem neuartigen Robotersystem, Spotiton

Das Signal-Rausch-Verhältnis von Daten ist eine der wichtigsten Überlegungen bei der Durchführung von Röntgenbeugungsmessungen an Mikrokristallen. Die VMXm-Beamline bietet eine geräuscharme Umgebung und mikrostrahlend für solche Experimente. Hier beschreiben wir Probenvorbereitungsmethoden zur Montage und Kühlung von Mikrokristallen für VMXm und andere makromolekulare Kristallographie-Beamlines mit Mikrofokus.

Eine Probenvorbereitungspipeline für Mikrokristalle an der VMXm-Beamline

Hier beschreiben wir die in unserem Labor entwickelten Verfahren zur Herstellung von Pulvern aus niedermolekularen Kristallen für Mikrokristall-Elektronenbeugungsexperimente (MicroED).

Mikrokristall-Elektronenbeugung kleiner Moleküle

Hier beschreiben wir, wie die automatisierten makromolekularen Kristallographie-Pipelines für Protein-zu-Struktur, schnelle Liganden-Protein-Komplex-Analyse und großflächiges Fragment-Screening basierend auf der CrystalDirect-Technologie im HTX-Labor in EMBL Grenoble verwendet werden können.

Die automatisierten Kristallographie-Pipelines in der EMBL HTX-Anlage in Grenoble

Dieser Beitrag beschreibt, wie man die Proteinkristallisation auf Crystal-on-Crystal-Geräten einrichtet und wie man eine automatisierte serielle Datenerfassung bei Raumtemperatur mit der On-Chip-Kristallisationsplattform durchführt.

On-Chip-Kristallisation und großflächige serielle Beugung bei Raumtemperatur

Hier werden Protokolle beschrieben, um Virusanordnungen herzustellen, die für die Flüssig-EM- und Kryo-EM-Analyse auf der Nanoskala mittels Transmissionselektronenmikroskopie geeignet sind.

Weiterentwicklung der hochauflösenden Bildgebung von Virusanordnungen in Flüssigkeit und Eis

Lernen Sie die Herstellung mikrofluidischer Chips für Protein-Kristallisation und Röntgenbeugung bei Raumtemperatur. Diese Methode minimiert mechanische Störungen und ermöglicht effiziente Datenerfassung an Synchrotron-Strahllinien.

Mikrofluidische Chips für In Situ Crystal-Röntgenbeugung und In Situ dynamische Lichtstreuung für serielle Kristallographie

Weitere Videos entdecken