Anpassung der Hybridisierung erfassen der Chromatin-assoziierte Proteine für Proteomics für Säugerzellen

Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen in unserem Verständnis der Genomregulation zu beantworten, z. B. wie krankheitsassoziierte Sequenzvarianten in nicht-kodierenden Regionen die Genexpression und -regulation beeinflussen, indem sie die Proteinbindung verändern, und sie kann helfen, diese Proteine zu identifizieren. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie keine genetische Manipulation von Zellen oder Geweben oder Antikörpern erfordert und keine Vorkenntnisse über DNA-bindende Proteine erfordert, die an diesem Ort mit der DNA interagieren könnten. Dieses Verfahren wird von Danu Perumalla, einem Techniker aus meinem Labor, vorgeführt.

Nach dem Design von Oligonukleotiden gemäß dem Textprotokoll werden 2 bis 5 mal 10 bis 5 Lymphoblastoidzellen oder andere Zelllinien in einen T25-Kolben mit 6 Millilitern RPMI 1640 Medium, ergänzt mit 1 %Pen Strep, 2 mil oder mehr L-Glutamin und 5 %FBS, gefilzt. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Verwenden Sie ein Hämozytometer oder einen automatisierten Zellzähler, um die Zelldichte zu messen.

Bevor die Zellen 1 mal 10 bis 6 Zellen pro Milliliter erreichen, drehen Sie sie fünf Minuten lang bei 100 mal G herunter und geben Sie sie in einen T75-Kolben mit 25 Millilitern des Mediums RPMI 1640, das zuvor in diesem Video vorbereitet wurde. Die Zellen werden gezüchtet, bis sie eine Zelldichte von 1 mal 10 auf 6 Zellen pro Milliliter erreichen, dann werden die Zellen in einen T150-Kolben in 38 Millilitern desselben Mediums überführt und für weitere zwei Tage gezüchtet. Als nächstes drehen Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 100 mal G herunter und resuspendieren sie in 10 Millilitern RPMI 1640 Medium.

Gießen Sie dann die Suspension in eine 1850 Quadratzentimeter große Rollflasche mit 500 Millilitern Medium und inkubieren Sie die Zellen unter den gleichen Bedingungen wie zuvor, nur mit ständiger Rotation. Sobald die gewünschte Zellzahl erreicht ist, schleudern Sie die Kultur fünf Minuten lang bei 100-fachem G herunter und resuspendieren Sie die Zellen in 36 Millilitern RPMI 1640 Medium. Übertragen Sie dann die Zellsuspension in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen und entfernen Sie kleine Aliquote für die Zellzählung und DNA-Extraktion.

Um die Zellen zu vernetzen, fügen Sie 1 Milliliter 37%Formaldehyd hinzu, um eine Endkonzentration von 1% zu erreichenDann inkubieren Sie die Zellen bei 10 bis 30 U/min bei Raumtemperatur für 10 Minuten. Die Vernetzungsreaktion wird durch Zugabe von 2 Millilitern einer 2,5 molaren Glycinlösung auf eine Endkonzentration von 125 Millimolar abgebrochen. Inkubieren Sie dann die Zellen fünf Minuten lang mit Rotation.

Nachdem Sie die Zellen durch Zentrifugation pelletiert haben, verwenden Sie eiskaltes 1X PBS, um die Zellen zweimal zu waschen. Fahren Sie mit der Lyse und dem Scheren der Zellen fort oder resuspendieren Sie das Pellet in 5 Millilitern Zelllysepuffer und frieren Sie die Suspension tropfenweise in flüssigem Stickstoff ein. Anschließend lagern Sie die Proben bei minus 80 Grad Celsius.

Um die Lyse und das Scheren durchzuführen, resuspendieren Sie das Pellet in 20 Millilitern Zelllysepuffer. Dann zentrifugieren Sie die Zellen bei 400 mal G, bei 4 Grad Celsius für fünf Minuten. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 6 Millilitern Kernlysepuffer mit Proteaseinhibitoren.

Zur Vorbereitung der Beschallung teilen Sie die Probe gleichmäßig in sechs bis acht Mikrofugenröhrchen auf. Legen Sie die Proben auf Eis oder ein kaltes Gestell und verwenden Sie ein Ultraschallgerät mit Mikrospitze, um sie bei einer Amplitude von 65 % mit fünf konstanten 20-Sekunden-Stößen zu beschallen, so dass die Suspension zwischen den Impulsen mindestens 40 Sekunden lang abkühlen kann. Zentrifugieren Sie die Zellen 10 Minuten lang bei 12.000 G und 4 Grad Celsius, übertragen Sie dann den Überstand in ein neues Röhrchen und entsorgen Sie die Pellets.

Nach der Schätzung der Gesamtwiederfindung mittels Fluorometrie frieren Sie die Proben ein. Nach der Herstellung von Hybridisierungs- und Waschpuffern gemäß dem Textprotokoll verwenden Sie 1.200 Mikroliter 1X-Hybridisierungspuffer, um 600 Mikroliter Kügelchen dreimal zu waschen. Verwenden Sie dann 1.200 Mikroliter 2X-Hybridisierungspuffer, um die Kügelchen zu resuspendieren.

In 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen werden 600 Mikroliter Probe, 120 Mikroliter gewaschene Kügelchen, die in 2X-Hybridisierungspuffer suspendiert sind, und 480 Mikroliter 2X-Hybridisierungspuffer gegeben. Inkubieren Sie die Röhrchen bei 31 Grad Celsius und 30 bis 60 U/min für 10 Minuten. Legen Sie dann die Röhrchen auf einen Magneten, bis die Kügelchen immobilisiert sind, und übertragen Sie die Proben in neue Röhrchen, bevor Sie die Kügelchen entsorgen.

Resuspendieren Sie die Einfang-Oligonukleotide zu einer Arbeitslösung von 10 Pikosolen pro Mikroliter und geben Sie 4 Mikroliter dieser Lösung in jedes Röhrchen. Inkubieren Sie die Röhrchen bei 42 Grad Celsius bei 30 bis 60 U/min für 40 Minuten. Legen Sie während der Inkubation die benötigten Kügelchen beiseite, waschen Sie die Kügelchen dreimal wie zuvor, aber verwenden Sie diesmal 1X Hybridisierungspuffer, um sie wieder zu resuspendieren.

Geben Sie die gewaschenen Kügelchen in die Röhrchen und inkubieren Sie die Proben bei 30 bis 60 U/min bei Raumtemperatur für 30 Minuten. Setzen Sie die Röhrchen auf den Magneten und entfernen Sie den Überstand, sobald die Kügelchen immobilisiert sind. Nachdem Sie die Kügelchen gewaschen haben, eluieren Sie die Probe durch Zugabe von 40 Mikrolitern Wasser in molekularer Qualität und inkubieren Sie die Röhrchen fünf Minuten lang bei 94 Grad Celsius.

Lege die Röhrchen auf den Magneten und warte ein paar Minuten, bis die Lösung klar ist, dann übertrage den Überstand in ein neues Röhrchen und entsorge die Kügelchen. Lagern Sie die Probe bei minus 80 Grad Celsius oder fahren Sie mit der Proteomanalyse gemäß dem Textprotokoll fort. Um die Abscheideausbeute zu bewerten, verwenden Sie Wasser in molekularer Qualität, um ein Aliquot des Eluats zu verdünnen, eins bis zehn.

Nachdem Sie die DNA aus einem Aliquot extrahiert haben, das weiter oben im Video entnommen wurde, verwenden Sie die DNA-Probe und Wasser in molekularer Qualität, um eine Standardkurve mit fünf seriellen Verdünnungen von eins bis zehn herzustellen. Bereiten Sie einen qPCR-Mastermix vor, fügen Sie Primer und Sonden hinzu und geben Sie die entsprechende Menge in jede Vertiefung der Reaktion. Geben Sie in jede Vertiefung 5 Mikroliter entweder der verdünnten Probe, der Standardkurve oder Wasser in molekularer Qualität, um keine Schablonenkontrolle zu verwenden.

Die Platte verschließen und eine Minute lang mit dem 100-fachen G drehen. Führen Sie dann die Proben in einem qPCR-System mit den im Textprotokoll gefundenen Parametern durch. Verwenden Sie schließlich die Standardkurve, um die Erträge zu bewerten, und die verschlüsselte Erfassung, um die Fangspezifität zu bewerten.

Hier sind Hybridisierungsfänge mit einer Titration von Oligonukleotiden dargestellt. Die Anzahl der Oligonukleotide wird schrittweise erhöht, während die Gesamtkonzentration konstant gehalten wird. Dieses Experiment hilft zu bestimmen, wie viele verschiedene Oligonukleotide benötigt werden, um eine optimale Hybridisierungseffizienz zu erreichen.

Es zeigt auch offensichtliche nachteilige Hybridisierungswechselwirkungen zwischen einem bestimmten Satz von Oligonukleotiden und ob es Oligos mit schlechter Spezifität gibt, was zu einem hohen Hintergrund führt. Ein großer Teil der Fragmente im vernetzten Chromatin ist nicht für die Hybridisierungserfassung geeignet. Wenn der Hybridisierungs-Capture erfolgreich durchgeführt wird, wird ein nachfolgendes Capture-Experiment desselben Chromatinmaterials unter Verwendung eines anderen Satzes von Capture-Oligonukleotiden zu vergleichbaren Ausbeuten führen wie bei der Verwendung von frischem Chromatin.

In einem zweiten Fangexperiment mit den ursprünglichen Oligos und dem übrig gebliebenen Chromatin aus dem ersten Experiment wird die Ausbeute jedoch um etwa 90 % abnehmen, wenn der größte Teil des für die Hybridisierung zugänglichen Materials im ersten Experiment eingefangen worden wäre. Diese Abbildung zeigt die Hybridisierungserfassung verschiedener chromosomaler Zielregionen, wobei jede Region als Negativkontrolle für die andere dient. Eine verschlüsselte Sequenz dient auch als echte Negativkontrolle.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in zwei Tagen durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, zuerst die Einfang-Oligonukleotide zu testen, um sicherzustellen, dass die gewünschte Region für die Hybridisierungs-Einfangung geeignet ist. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden, wie die Chromatin-Immunpräzipitation, durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. wo sonst im Genom die identifizierten DNA-interagierenden Proteine binden.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie HyCCAPP durchführen, um genomische Regionen von Interesse mit dem Ziel der De-novo-Identifizierung lokaler Proteininteraktionen anzureichern.