Bestimmen, ob DNA mit einem Cyanin Farbstoff kann nicht verdaut werden mit Restriktionsenzymen gebeizt

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, fluoreszenzmarkierte DNA-Moleküle mit methylierungs- und nicht-methylierungsempfindlichen Restriktionsenzymen zu verdauen und die Verdauungsrate des Experiments zu bestimmen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen in den Bereichen Chemie oder Biologie, wie z. B. der Genomik, zu beantworten. Der Vorteil dieser Methode besteht darin, dass ein Wissenschaftler vorgefärbte DNA mit einem Enzym verdauen kann, um festzustellen, ob die DNA nach Abschluss eines anderen Experiments in voller Länge vorliegt.

Das Verfahren wird von Drew Thompson, einem Studenten aus meinem Labor, demonstriert. Um ein 0,7%iges Agarose-Gel herzustellen, wiegen Sie 1,4 Gramm Agarose mit hoher Geliertemperatur in einem Erlenmeyerkolben ab. Geben Sie dann 200 Milliliter 1x TAE-Puffer hinzu und setzen Sie ein umgedrehtes Becherglas auf den Kolben.

Die Lösung auf einer heißen Platte erhitzen, bis sich Blasen auf dem Boden des Kolbens bilden und nach oben schwimmen. Nehmen Sie die Lösung von der Herdplatte und lassen Sie sie abkühlen, bis der Kolben mit bloßer Hand berührt werden kann. Gießen Sie dann das Gel mit einem Gelkamm in eine 24,5 Zentimeter x 21,8 Zentimeter große Gelform, um Vertiefungen zu erzeugen.

Verwenden Sie eine Pipettenspitze, um die Blasen in der Nähe des Kamms oder auf der Oberfläche des Gels zu platzieren, und lassen Sie das Gel mindestens 15 Minuten lang festigen. Um Lambda-DNA in sechs verschiedenen Farbstoffkonzentrationen zu färben, beginnen Sie mit 1x TE, um 300 Mikroliter 100 Nanogramm pro Mikroliter Lambda-DNA herzustellen. Lagern Sie die Lösung bei vier Grad Celsius.

Bei der Vorbereitung einer Probe für jede der folgenden Farbstoffkonzentrationen für jede Bande, die in einem Restriktionsverdau erwartet wird, färben Sie 75 bis 100 Nanogramm unmethylierte Lambda-DNA. Inkubieren Sie die Proben über Nacht bei vier Grad Celsius. Um festzustellen, ob ein Restriktionsenzym die gefärbte DNA verdauen kann, fügen Sie am nächsten Tag 20 Einheiten des Restriktionsenzyms, drei Mikroliter des entsprechenden Puffers mit der höchsten Schneideffizienz und destilliertes autoklaviertes und gefiltertes Wasser für eine 30-Mikroliter-Reaktion hinzu.

Legen Sie die Reaktionen bei optimaler enzymatischer Aktivität in ein Wasserbad und inkubieren Sie sie zwei bis vier Stunden lang. Stoppen Sie dann die Reaktionen, indem Sie zwei Mikroliter 0,5 molare EDTA pH 8,0 hinzufügen. Entfernen Sie die Seiten von der zuvor vorbereiteten Gelform und geben Sie das Gel in die Gelelektrophoresebox.

Gießen Sie 2,5 Liter 1x TAE-Puffer in die Box. Entfernen Sie dann vorsichtig den Gelkamm aus dem Gel, so dass die Vertiefungen zugänglich sind. Pipettieren Sie die Restriktionsenzymreaktionen auf eine Kunststofffolie und fügen Sie für jede Reaktionslösung einen Mikroliter 6x Ladefarbstoff pro fünf bis sechs Mikroliter DNA-Lösung hinzu.

Pipettieren Sie dann die Reaktionen in die Vertiefungen. Mischen Sie einen Mikroliter einer Kilobase-Leiter, neun Mikroliter 1x TE und zwei Mikroliter 6x Ladefarbstoff. Laden Sie dann die Lösung in die Vertiefungen, die die anderen Lösungen flankieren.

Decken Sie die Gelbox mit einem dunkelblauen oder schwarzen Papier oder Stoff ab und schließen Sie die Gelbox dann an eine Stromversorgung an. Stellen Sie das Netzteil auf 30 Volt ein und lassen Sie es über Nacht laufen. Schalten Sie das Licht aus, während das Gel läuft, um eine Photospaltung der markierten DNA zu verhindern.

Am nächsten Morgen überträgst du das Gel in der Schale in einen Behälter mit 45 Mikrolitern Ethidiumbromid und einem Liter 1x TAE-Puffer. Lagern Sie den Behälter bei Raumtemperatur im Dunkeln oder decken Sie ihn mit Folie ab, um Lichteinwirkung zu vermeiden. Lassen Sie das Gel mindestens 45 Minuten bei Raumtemperatur einwirken.

Um das Gel abzubilden, legen Sie das Gel auf einen Blaulicht-Transilluminator, der eine maximale Lichtleistung zwischen 400 und 500 Nanometern emittiert. Nehmen Sie Bilder mit einer Kamera auf, die an der Station befestigt ist. Bestimmen Sie die Aufschlussrate für das Experiment gemäß dem Textprotokoll.

Die Enzymeffizienz wird bestimmt, indem die Gesamtzahl der erwarteten Banden durch die Anzahl der sichtbaren Banden dividiert wird. Darüber hinaus ist zur Bestimmung der ungefähren Größe der Banden eine Kontrolle erforderlich, um zu wissen, wo die nativen DNA-Moleküle im Vergleich zur gefärbten DNA erwartet werden. Die Beweglichkeit der Bänder in den Fahrspuren drei und vier hat abgenommen, wodurch sich die Bänder näher an die Bohrlöcher verschoben haben.

In diesen Lanes wirkt sich die Farbmenge nicht merklich auf die Beweglichkeit aus, so dass die Bänder mit der Steuerung übereinstimmen. Die Spuren fünf und sechs weisen mehr Banden auf als die Kontrolle, was auf eine partielle Verdauung hinweist, was darauf hindeutet, dass die Farbstoffe die Spaltung an den Erkennungsstellen beeinflusst haben. In diesem Experiment sind alle erwarteten Banden für alle Farbstoffkonzentrationen zu sehen, so dass die Würfel die Verdauung der DNA nicht beeinträchtigt haben.

Um zu sehen, wie sich die Beweglichkeit mit zunehmender Konzentration des YOYO-1-Farbstoffs verschiebte, wurden neben jeder Bande farbige Sternchen eingefügt. Zum Beispiel sind die 3,5-Kilobasen-Bänder in jeder YOYO-1-Konzentration mit roten Sternchen versehen. Die unerwarteten Bänder auf den Bahnen fünf und sechs haben kein Sternchen neben den Bändern.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, das Gel mit einem dunklen Blatt Papier abzudecken und das Gel in einem dunklen Raum laufen zu lassen. Achte auch darauf, dunkle Röhren für deine Reaktionen zu verwenden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man fluoreszenzgefärbte DNA-Moleküle mit Restriktionsenzymen verdaut und die Verdauungsgeschwindigkeit der Reaktion bestimmt.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Ethidiumbromid äußerst gefährlich sein kann, daher sollten bei der Durchführung des Eingriffs Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen und einer Schutzbrille getroffen werden. Achten Sie auch darauf, eine geeignete Schutzbrille zu tragen, wenn Sie einen Transilluminator verwenden.