Histologischen Quantifizierung Lunge Pilz Belastung in experimentellen Aspergillose bestimmen

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, die pulmonale Pilzlast bei Mäusen mit invasiver Aspergillose durch histologische Analyse zu quantifizieren. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Pilzpathogenese über schützende und schädliche Wirtsreaktionsmechanismen und wichtige Virulenzfaktoren von Pilzen zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass vorhandene histologische Proben verwendet werden können, um eine Pilzbelastung mit vergleichbaren Ergebnissen wie bei der quantitativen PCR-Anwendung von Lungenpilz-DNA zu erhalten.

Obwohl diese Methode Aufschluss über die invasive Aspergillose geben kann, kann sie auch auf andere Krankheitsstudien angewendet werden, in denen Erreger innerhalb von Wirtsgeweben unterschiedlich gefärbt werden können. Die Idee zu dieser Methode kam uns, als wir anfingen, über alternative Methoden zur Quantifizierung der Lungenpilzbelastung nachzudenken, die weniger variabel sind als quantitative DNA-Methoden. Die Infektion und die Ernteverfahren wird von Angar Tsoggeral, einem Forschungstechniker, vorgeführt.

24 Stunden vor der Infektion depletieren Sie die Neutrophilen in jeder experimentellen sieben bis 10 Wochen alten Maus mit 0,5 Milligramm Anti-Maus-Ly-6G-Antikörper in steriler Kochsalzlösung, die intraperitoneal in einem 45-Grad-Winkel in den lateralen unteren rechten Quadranten jedes Tieres verabreicht werden, und bringen Sie die Mäuse in ihre Käfige zurück. Gießen Sie am nächsten Morgen 1,5 Gramm 0,5 Millimeter große Glasperlen auf eine Kulturplatte von A. fumigatus conidia und kippen Sie die Platte vorsichtig hin und her, bis die Kügelchen mit dem Pilz bedeckt sind. Sammeln Sie die konidienbeschichtete Perlenmischung in einem konischen 15-Milliliter-Röhrchen und suspendieren Sie die Kügelchen in fünf Millilitern DPBS.

Wirbeln Sie die Kügelchen ein, um sie vom Pilz zu lösen, und zählen Sie die Konidien in einer 50-fachen Verdünnung des Überstands auf einem Hämozytometer. Verdünnen Sie die Konidien auf einmalig 10 bis 8 Konidien pro Milliliter DPBS-Konzentration und laden Sie 50 Mikroliter Konidienlösung pro Maus in einzelne Mikropipetten. Nachdem Sie sich vergewissert haben, dass Sie nicht auf das Einklemmen der Zehen reagieren, legen Sie die erste betäubte Maus in Rückenlage auf ein schräges Brett und halten Sie die oberen Schneidezähne vorsichtig mit einem Gummiband und die unteren Schneidezähne mit einem Metalldraht fest.

Halten Sie dann mit einer kleinen Pinzette die Zunge vorsichtig in voller Streckung und geben Sie 50 Mikroliter der Konidienlösung an den Zungengrund ab. Halten Sie die Zunge voll ausgestreckt und achten Sie 20 Sekunden lang auf eine schnelle Atmung und das deutliche Klickgeräusch der Aspiration oder bis die Federung vollständig abgesaugt ist. Bringen Sie dann die Maus vorsichtig in ihren Käfig mit Überwachung zurück, bis sie vollständig liegt, und infizieren Sie das nächste Tier.

Wenn alle Mäuse infiziert sind, injizieren Sie einer Untergruppe der Tiere ein Antimykotikum und wiederholen Sie die Erschöpfung der Neutrophilen bei allen Tieren 24 Stunden nach der Infektion. Drei Tage nach der Verabreichung des Pilzes legen Sie die erste Maus in Rückenlage auf eine Schaumstoffplatte, die mit einem saugfähigen Pad bedeckt ist. Stellen Sie sicher, dass die Maus mit einem Zehenkneifen eingeschläfert wird, und desinfizieren Sie das Haar mit 70 % Ethanol.

Nachdem Sie die Gliedmaßen gesichert haben, öffnen Sie vorsichtig mit einer Schere die obere Brusthöhle und schneiden Sie den Brustkorb weg, um die Lunge und das Herz freizulegen. Schneiden Sie die untere Hohlvene, die vom Herzen absteigt, und achten Sie darauf, dass andere Blutgefäße nicht durchtrennt oder Organe durchstochen werden, und verwenden Sie eine Fünf-Milliliter-Spritze, die mit einer 25-Gauge-Nadel ausgestattet ist, die in einem 45-Grad-Winkel gehalten wird, um langsam fünf Milliliter kaltes DPBS in den rechten Ventrikel des Herzens zu perfundieren. Nach der Perfusion mit fünf Millilitern 10%igem Formalin auf die gleiche Weise die Luftröhre vorsichtig freilegen und die umgebenden Fettpolster lösen, wobei darauf zu achten ist, dass die Luftröhre nicht durchstochen wird.

Heben Sie die freiliegende Luftröhre mit einer Pinzette an und stechen Sie mit einer 25-Gauge-Nadel ein Loch in die obere Luftröhre. Führen Sie vorsichtig eine Kanüle durch das Loch in Richtung Lunge ein und binden Sie einen chirurgischen Faden locker um die Luftröhre, um die Kanüle zu sichern. Verwenden Sie eine Ein-Milliliter-Spritze, um die Lunge mit einem Milliliter 10%iger Formalinpuffer durch die Kanüle aufzublasen und entfernen Sie die Kanüle schnell, aber vorsichtig.

Ziehen Sie den chirurgischen Faden fest, um die Luftröhre abzudichten, und ziehen Sie vorsichtig am Faden, um das Bindegewebe zu lösen, damit die Lunge und die Luftröhre entnommen werden können. Legen Sie das Gewebe in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen mit 15 Millilitern 10%igem Formalinpuffer, wobei ein Ende des Fadens außerhalb des Röhrchens liegt. Verschließen Sie dann die Kappe und drehen Sie das Röhrchen um, um die Probe und das Fixiermittel mindestens 24 Stunden lang vollständig einzutauchen.

Um das entnommene Gewebe abzubilden, öffnen Sie zunächst ein geeignetes bildgebendes Quantifizierungsprogramm und verwenden Sie ein Lichtmikroskop, um mindestens vier verschiedene Felder jedes Gomori-modifizierten Methanamin-, Silber- oder GMS-gefärbten Objektträgers unter dem 10X-Objektiv zu erhalten. Stellen Sie sicher, dass die Bilder repräsentativ für die infizierten Atemwege in der Lunge sind und dass sie eine ähnliche Gewebedichte aufweisen. Um den Bildern Maßstabsleisten hinzuzufügen, wählen Sie im Menü Bearbeiten die Option Kalibrierungsmarkierungen hinzufügen/bearbeiten und wählen Sie die Linienstärke, die Farbe und die Größe der Maßstabsleiste aus.

Klicken Sie auf das Bild, in dem die Maßstabsleiste platziert werden soll, öffnen Sie dann das Menü Bearbeiten und wählen Sie Zusammenführen und Kalibrierungsmarkierungen zusammenführen, um jedem Bild eine Maßstabsleiste hinzuzufügen und die Bilder in den entsprechenden Experimentiergruppenordnern zu speichern. Um die Pilzbelastung bei jedem Tier zu berechnen, öffnen Sie ein entsprechendes Bildbearbeitungsprogramm und öffnen Sie den ersten Ordner mit Bildern. Wählen Sie im Menü Bild die Option Typ und RGB-Stapel aus, um die Bilder zu konvertieren.

Wählen Sie mit der Pfeiltaste nach rechts das zweite der drei Bilder aus und drücken Sie Strg-Umschalt-T, um die Einstellung der Schwellenwert-Menüeinstellungen zu öffnen. Suchen Sie das ursprüngliche TIFF- oder JPG-Bild als Referenz und öffnen Sie das Bild mit einem Bildbetrachtungsprogramm. Bei der Auswahl des Schwellenwerts ist es entscheidend, das Originalbild anzeigen zu können, damit der ausgewählte Bereich repräsentativ für die Pilzhyphen ist und die Konsistenz zwischen den Proben gewährleistet ist.

Schieben Sie den oberen Schieberegler ganz nach links und passen Sie den unteren Schieberegler an, bis der ausgewählte rote Bereich repräsentativ für das Mikroskopiebild ist. Klicken Sie auf Festlegen und OK und wählen Sie Messwerte analysieren und festlegen aus, um den Bereich zu überprüfen, den Flächenanteil, den Grenzwert auf Schwellenwert zu begrenzen, die Beschriftung anzuzeigen und die unteren Einstellungen als Standard beizubehalten. Klicken Sie auf OK und wählen Sie Analysieren und Messen aus.

Die Ergebnisse sollten angezeigt werden. Exportieren Sie dann die Daten in ein Datenanalyseprogramm, um sie grafisch darzustellen und statistisch zu analysieren, und geben Sie den Mittelwert der vier oder mehr Flächenprozentsätze für jede Lungenprobe ein. Wie diese repräsentative Überlebensgrafik zeigt, weisen eosinophil-defiziente Mäuse mit invasiver Aspergillose, die nach der Infektion mit einem Antimykotikum behandelt wurden, ein erhöhtes Überleben im Vergleich zu Wildtyp-Tieren auf.

Repräsentative GMS-Färbungen von neutropenischen Wildtyp- und Eosinophilen-defizienten Mäusen mit invasiver Aspergillose zeigen eine nahezu vollständige Pilz-Clearance bei antimykotisch behandelten Knockout-Mäusen, die bei Wildtyp-Tieren mit oder ohne antimykotische Behandlung nicht reziprok ist. Darüber hinaus bestätigen sowohl die quantitative PCR als auch die manuelle Lichtmikroskopie-GMS-Quantifizierung, wie gerade gezeigt wurde, dass die Behandlung mit Antimykotika zu der signifikantesten Verringerung der Pilzlast zwischen Wildtyp- und Eosinophilen-defizienten Mäusen führt. Bei unbehandelten Mäusen wurde jedoch nur durch die GMS-Quantifizierung ein signifikanter Rückgang der Eosinophilen-defizienten Mäuse in diesem Experiment festgestellt.

Wenn die mittleren Flächen von GMS-gefärbten Schnitten der gesamten Lunge unter vierfacher Vergrößerung berechnet werden, sind die Unterschiede ähnlich wie bei den Ergebnissen, die mit vier repräsentativen 10X-Feldern erzielt wurden, wenn auch mit geringerer statistischer Signifikanz. Ähnliche Überlebens-, Pilzbelastungs- und Pilzbeseitigungsergebnisse wurden auch bei Mäusen mit Gamma-Delta-T-Zell-defizienten Zellen beobachtet, die mit demselben Antimykotikum behandelt wurden. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, bei der Aufnahme der histologischen Schnitte und bei der Anpassung des Schwellenwerts konsistent zu bleiben, um vergleichbare Ergebnisse zu erhalten.

Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden durchgeführt werden, die die histologische Analyse von Proben mit deutlichen Unterschieden zwischen Ziel- und Hintergrundfärbung beinhalten, um zusätzliche Fragen zur Krankheitspathologie in der Lunge und anderen Geweben zu beantworten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Mäuse durch unwillkürliche Aspiration mit Pilzkonidien infiziert und wie man das Pilzwachstum in Lungengewebeschnitten mit einer Bildverarbeitungssoftware misst. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Aspergillus fumigatus und dem modifizierten Methanaminsilberfleck von Gomori gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen persönlicher Schutzausrüstung und das Arbeiten unter einer gut belüfteten Haube getroffen werden sollten.