Name: Histologischen Quantifizierung Lunge Pilz Belastung in experimentellen Aspergillose bestimmen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Lernen Sie die histologische Quantifizierung der Pilzbelastung in der Lunge bei invasiver Aspergillose in Mäusen. Diese Methode nutzt Gomori-Färbung und liefert vergleichbare Ergebnisse wie quantitative PCR.

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Diese Studie wurde zum Teil durch eine Indiana Universität Schule von Medizin Enhancement-Forschungsstipendium und vom NIH-NIAID 1R03AI122127-01 unterstützt. N.V. wurde teilweise in diesem Zeitraum durch eine Karriere in der Immunologie Gemeinschaft von der American Association Immunologen unterstützt.

Alle tierische Verfahren wurden genehmigt durch das Animal Care und Nutzung Ausschuss der Indiana State University, die Host-Campus der Indiana University School of Medicine – Terre Haute.
1. Vorbereitung von A. Fumigatus Konidien auf Infektion
<ol><li>Während der Arbeit in einem gut gelüfteten Abzug, fügen Sie 125 µL der Stammlösung A. Fumigatus 293 900 µL Kultur Grade Zellwasser (CCGW hinzu). Übertragen Sie dann die Lösung Malz-Extrakt (MEA) Nährbodenplatte per Pipette und gleichmäßig mit einer Impfkeimen Schleife.</li>
	<li>Speichern Sie die Pilze Platte im Dunkeln bei 24 ° C für mindestens 14 Tage und nicht mehr als 28 Tage.</li>
	<li>Ernten Sie mit Glasperlen als zuvor beschriebenen9Konidien.</li>
	<li>Gießen Sie 1,5 g 0,5 mm Glasperlen auf den Teller und neigen Sie ihn sanft hin und her bis die Perlen beschichtet sind, um Konidien zu extrahieren. Die Perle/Konidien Mischung in einem 15 mL konische Röhrchen zu sammeln. Aussetzen Sie in 5 mL Dulbecco Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (DPBS) und Wirbel.</li>
	<li>Zählen Sie die Konidien in ein 50 X Verdünnung der Überstand in DPBS mit einer Hemocytometer. Die Anzahl der Konidien im Bereich in Abbildung 1 dargestellte und Gleichung 1 verwenden, um die Konzentration zu berechnen. #Conidia × Verdünnung Faktor 10 ×4= Konidien/mL (Gleichung 1) Hinweis: Zusätzliche 4 x 4 Quadrat Eckbereichen können, mit dem Mittelwert dieser Bereiche als #Conidia in Gleichung 1angerechnet werden.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57155/57155fig1.jpg"> Abbildung 1: Hemocytometer repräsentativen Bereichs verwendet für Konidien zählen (Box, Pfeil).
<ol start="6"><li>Verdünnen Sie die Konidien Aussetzung mit steriler Kochsalzlösung (DPBS) um die gewünschte Konzentration, 1.0 x 108 Konidien/mL für eine Infektion mit 5 x 106 Konidien/50 µL. bereiten 50 µL Konidien Lösung zu erhalten pro 'n + 2' Mäuse entfallen Pipettieren ansteckungsverdächtigen Fehler. Hinweis: Standard Pilz Ernte und Vorbereitung/Filtration können alternativ verwendeten10sein. Die Glas-Wulst-Methode eignet sich besonders dazu bei, dass Konidien Proben mit minimal kleinen/löslichen Bodenaggregaten Antigene für Aspiration gewonnen werden.</li>
</ol>(2) Immunsuppression und Infektion von Mausmodell
<ol><li>7-10-Wochen alten Mäusen zu verwenden. Hinweis: BALB/c, C57BL/6 (B6), Eosinophilen-defizienten (ΔdblGATA, BALB/c-Hintergrund) und γδ T-Zell-Mangel (TCRδ-/-, B6-Hintergrund) Mäuse wurden für diese Studie verwendet. Für jedes experiment, Alter und Geschlecht angepasst wurden (Männchen und Weibchen) Mäuse für jede Gruppe verwendet.</li>
	<li>Neutrophilen Granulozyten über intraperitoneale (IP) Injektion von 0,1 mL (0,5 mg) anti-mouse-Ly - 6G Antikörper in steriler Kochsalzlösung bei 45° in den seitlichen unteren rechten Quadranten zu einem Abbau (für einen experimentellen Terminplan, siehe Abbildung 2).</li>
	<li>24 h später, infizieren Mäuse durch Absaugen mit 5,0 x 106A. Fumigatus Konidien ausgesetzt in 50 µL steriler Salzlösung (siehe Schritte 2.4-2.10) wie oben beschrieben11. Nach Infektion, eine Teilmenge von Tieren mit Antimykotikum z. B. 5 mg/kg Caspofungin Diacetat in DPBS in dieser Studie verwendeten injizieren (täglich, siehe Abbildung 2).</li>
	<li>Mäuse mit 99,9 % Isofluran Verwendung eine tierärztliche Anästhesiegerät zu betäuben.<ol>
<li>Legen Sie ein Papiertuch auf den Boden der Kammer Induktion, Kot und Urin zu fangen.</li>
		<li>Platzieren Sie den Mauszeiger in der Induktion-Kammer, sichern den Deckel und legen Sie den Verdampfer auf 5 % Isofluran für 2 min und 30 s. Hinweis: Vet-Salbe wird nicht verwendet, weil die Gesamtzeit unter Narkose weniger als 5 Minuten ist.</li>
		<li>Reduzieren den Vaporizer auf die Hälfte der maximalen Einstellung für 30 s.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bestätigen, dass die Maus durch die Beobachtung richtig betäubt wird verlangsamt, Atmung, Mangel an Bewegung und mangelnde Reaktion auf Zehe-Prise Reiz.</li>
	<li>Entfernen Sie die Maus aus der Induktion Kammer und auf einem Brett schräg. Platzieren Sie die Maus mit dem Rücken gegen das Brett. Stellen Sie sicher, dass die oberen Schneidezähne sanft mit einem Gummiband gesichert sind und die unteren Schneidezähne sind mit einem Metallgitter vorsichtig verhalten.</li>
	<li>Halten Sie sorgfältig die Zunge bei voller Streckung mit kleinen Zangen und 50 µL Pipette Konidien/PBS-Aufhängung an der Basis der Zunge.</li>
	<li>Halten Sie die Zunge bei voller Streckung; schnelle Atmung und die ausgeprägte klickendes Geräusch der Aspiration hören. Halten Sie für 20 s oder bis Aussetzung vollständig abgesaugt wird.</li>
	<li>Entfernen Sie die Maus vom Brett schräg und sanft in einen Käfig für die Beobachtung.</li>
	<li>Nach Aspiration sollte die Maus wieder zu Bewusstsein innerhalb 1 min. Monitor die Maus bis voll bewusst und in der Lage, um den Käfig zu gehen kommen. Die Tiere sollten bei 21 ° C untergebracht und zweimal täglich überwacht, bis die Lunge geerntet werden.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Erschöpfung der Neutrophilen (Schritt 2.2) 24 Stunden nach der Infektion (Abbildung 2).</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57155/57155fig2.jpg"> Abbildung 2: experimentelle Zeitplan. Diese Zahl wurde von einer früheren Veröffentlichung8geändert.
3. die Ernte und die Erhaltung der Maus Lungen für histologische Analyse
<ol><li>Das Tier mit einer tödlichen Dosis von 0,1 ml 390 mg/ml Natrium Pentobarbital Lösung IP tief zu betäuben.</li>
	<li>Bestätigen Sie Euthanasie durch die fehlende Spontanatmung und keine Antwort erhalten, Leib Stimulierung mit einer Pinzette Beobachtung. Sobald eingeschläfert, sprühen Sie die Karkasse mit 70 % Ethanol zu sterilisieren.</li>
	<li>Legen Sie den Kadaver auf eine Dämmplatte mit einem Saugkissen bedeckt. Hinweis: Die Karkasse sollte auf dem Rücken mit Stecknadeln sichern alle vier Gliedmaßen zu Dämmplatte platziert werden.</li>
	<li>Öffnen Sie den oberen Brustraum mit einer Schere vorsichtig. Um die Lunge und das Herz aussetzen schneiden Sie des Brustkorbs Weg. Schneiden der minderwertigen Vena Cava, um Durchblutung zu ermöglichen. Schneiden die Blutgefäße und Punktion der Organe zu vermeiden.</li>
	<li>Durchspülen Sie langsam mit 5 mL kalte DPBS in den rechten Ventrikel des Herzens in einem Winkel von 45° mit einer 25-G-Nadel. Wiederholen Sie die Perfusion mit 5 mL der 10 % Formalin.</li>
	<li>Vorsichtig aussetzen der Luftröhre und der umgebenden Fettpolster zu lösen. Seien Sie vorsichtig und vermeiden Sie Punktion der Trachea. Stellen Sie sicher, dass überschüssige Bindegewebe entfernt wird, um die Luftröhre, bevor Sie fortfahren vollständig sichtbar zu machen. Sobald die Luftröhre ausgesetzt ist, legen Sie Zange unter der Luftröhre, es zu erheben.</li>
	<li>Stechen Sie ein kleines Loch in der oberen Luftröhre mit einer 25-G-Nadel. Hinweis: Das Loch sollte positioniert werden, so dass die gesamte Kanüle in der Luftröhre passt. Seien Sie vorsichtig, um zu vermeiden, bersten die Luftröhre.</li>
	<li>Legen Sie eine Kanüle durch das Loch und in Richtung der Lungen. Sichern Sie die Kanüle mit einem chirurgischen Faden locker um die Luftröhre gebunden. Hinweis: Wenn die Luftröhre gerissen ist, kann die Kanüle vorbei an der Luftröhre so weit wie möglich in die Atemwege eingeführt.</li>
	<li>Mit einer Spritze, Aufblasen der Lunge mit 1 mL 10 % Formalin Puffer durch die Kanüle. Stellen Sie sicher, dass die Inflation der Lunge sichtbar ist. Wenn dies nicht der Fall ist, passen Sie den Katheter und wiederholen. Sobald die Lungen aufgeblasen sind, schnell entfernen der Kanüle mit Vorsicht und ziehen Sie den Faden fest an der Luftröhre abzuriegeln. Hinweis: Wenn die Luftröhre gebrochen ist und die Lunge können nicht aufgepumpt werden, die Lunge können noch geerntet werden, aber dies kann verhindern, dass die ordnungsgemäße Fixierung.</li>
	<li>Entfernen Sie vorsichtig die Luftröhre und Lunge von der Brust durch sorgfältig trennen das Bindegewebe der Trachea mit der Pinzette während sanft auf dem Thread hochziehen. Legen Sie die Lunge und Luftröhre in ein 50 mL konische Röhrchen mit 15 mL 10 % Formalin Puffer. Platzieren Sie ein Ende des Fadens außerhalb der Röhre und verschließen Sie die Kappe. Invertieren Sie das Rohr um völlig eintauchen die Probe in Fixiermittel.</li>
	<li>Speichern Sie die Proben bei Raumtemperatur für mindestens 24 h oder bis Weiterverarbeitung. Vorsicht: Formalin ist gefährlich. Geeignete persönliche Schutzausrüstung einschließlich Schutzbrille und Mundschutz zu tragen. Arbeiten Sie unter einer chemischen Haube bei der Verarbeitung von Proben.</li>
</ol>4. Ernte und Erhaltung der Maus Lungen für DNA-Pilz-Belastung
<ol><li>Führen Sie die Schritte 3.1-3.5, wie oben beschrieben, auf eine separate Maus.</li>
	<li>Durchspülen Sie langsam mit 10 mL kalte DPBS in den rechten Ventrikel des Herzens in einem Winkel von 45° mit einer 25-G-Nadel.</li>
	<li>Verbrauchssteuern Sie der Lunge mit einer Schere und in beschrifteten 1,5 mL Röhrchen.</li>
	<li>Bis zur Weiterverarbeitung lagern Sie der Lunge bei-80 ° C.</li>
	<li>Verwenden Sie standard-Techniken, wie beschrieben (Einbettung und schneiden) und nach Hersteller Protokolle (siehe Tabelle der Materialien).</li>
</ol>(5) Mikroskopie und Imaging
<ol><li>Öffnen Sie das Bildbearbeitungsprogramm Quantifizierung (siehe Tabelle der Materialien).</li>
	<li>Mit einem Lichtmikroskop, erhalten Sie mindestens 4 verschiedene Felder der GMS gefärbten Folien (10 X Objektiv). Sicherstellen Sie, dass die Bilder für die infizierten Luftwege in der Lunge mit ähnlicher Dichte Gewebe repräsentativ sind. Hinweis: Wenn die Dichte und die Verteilung von Bodenaggregaten Brennpunkte zwischen Steuerung und experimentellen Gruppen deutlich anders aussehen, Zusatzfelder ergriffen werden oder die GMS-Bereich des ganzen Lunge kann abgebildet werden (4 X Objektiv). Erhalten Sie die gleichen Bereiche der Lunge (gekennzeichnet durch gleichwertige Gewebe Morphologie) auf einem seriellen Lunge Abschnitt gefärbt mit Hämatoxylin und Eosin, falls gewünscht.</li>
	<li>Fügen Sie Maßstabsleisten zu den Bildern hinzu, wenn nötig und speichern Sie die Bilder quantifiziert werden. Auswählen, Bearbeiten &gt; hinzufügen/bearbeiten Kalibrierungsmarkierungen &gt; Menü: Wählen Sie dicke, Farbe und Größe der Bar Nennweite &gt; Klicken Sie auf das Bild für an die Maßstabsleiste platziert werden soll. Schließen Sie das Menü und wählen Sie, Bearbeiten &gt; Zusammenführen &gt; Zusammenführen Kalibrierungsmarkierungen &gt; Datei speichern unter Wählen &gt; benennen Sie die Datei und klicken Sie auf speichern.</li>
</ol>6. verwenden ein Bildbearbeitungsprogramm um den Pilz Belastung (Abbildung 3) zu berechnen
<ol><li>Öffnen Sie ein Bildbearbeitungsprogramm. Wählen Sie Datei &gt; Ordner mit Proben zu quantifizieren &gt; Bild (Abbildung 3A). Wählen Sie Bild &gt; Art &gt; "RGB-Stack" (Abb. 3 b) umwandeln.</li>
	<li>Verwenden Sie die Rechte Pfeiltaste, um die zweite von den drei gegebenen Bilder (Abb. 3 b) auszuwählen. Drücken Sie "STRG + UMSCHALT + T" zu bringen, die "Schwelle" Menü Einstellungen Einsteller (Abbildung 3). Suchen Sie das original TIFF oder JPG Bild als Referenz und öffnen mit einer Bildanzeige-Programm (Abbildung 3).</li>
	<li>Ziehen Sie den oberen Schieberegler ganz nach links und den unteren Schieberegler, bis der Bereich ausgewählt (in rot) repräsentativ für die Mikroskopie-Bild (in der Regel im Bereich von 130-160 wie angegeben auf der rechten Seite des Schiebereglers (Abbildung 3).</li>
	<li>Einmal ausgewählt, drücken Sie die Taste "Set" &gt; "OK" (Abbildung 3D). Wählen Sie "Analyse" &gt; "Messungen festlegen" &gt; "Gebiet, Bereich Bruchteil, Grenze, Schwelle, Beschriftung anzeigen" prüfen und lassen Sie die unteren Einstellungen (Drop-Down-Menü und stellen nach dem Komma) als Standard &gt; "OK" (Abbildung 3D).</li>
	<li>Wichtige Bereiche der Leerraum oder Hintergrundfärbung können durch Auswahl des entsprechenden Gewebes mit einem Bereich oder Polygon Tool ausgeschlossen werden.</li>
	<li>Schließlich wählen Sie "Analyse" &gt; "Measure" (ein Fenster mit Daten sollte angezeigt werden, oder eine Registerkarte auf der Windows-Taskleiste erscheint mit der Bezeichnung, "Ergebnisse") (Abbildung 3E). Übertragen Sie die Daten auf eine Daten-Analyse-Programm für die grafische Darstellung und statistische Analyse.</li>
	<li>Geben Sie den Mittelwert aus den vier Bereich Prozentsätze für jede Lunge Probe. 5-8 Proben sind in der Regel ausreichend, um signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen erkennen. Wenn zwei Versuchsgruppen vergleichen, führen Sie ein ungepaartes Student t-Test, um die Bedeutung zu bestimmen.</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57155/57155fig3.jpg"> Abbildung 3: Vertreter Screenshots für jeden Schritt des GMS histologischen Feld Quantifizierung. (A) wählen Sie Datei &gt; Ordner mit Proben zu quantifizieren &gt; Bild auswählen. (B) wählen Sie Bild &gt; Art &gt; "RGB-Stack" umwandeln. Verwenden Sie die Rechte Pfeiltaste, um die zweite von den drei gegebenen Bilder auszuwählen. (C) Hit "STRG + UMSCHALT + T", um die "Schwelle" Menü-Einstellungen-Einsteller aufzurufen. Suchen Sie das original TIFF oder JPG Bild als Referenz und mit Foto-Viewer-Programm zu öffnen. Ziehen Sie den oberen Schieberegler ganz nach links und den unteren Schieberegler, bis der Bereich ausgewählt (in rot) repräsentativ für die Mikroskopie-Bild (in der Regel im Bereich von 130-160 wie angegeben auf der rechten Seite des Schiebereglers. (D) nach ausgewählten drücken Sie "Set" &gt; "OK". Wählen Sie "Analyse" &gt; "Messungen festlegen" &gt; "Gebiet, Bereich Bruchteil, Grenze, Schwelle, Beschriftung anzeigen" prüfen und lassen Sie die unteren Einstellungen (Drop-Down-Menü und stellen nach dem Komma) als Standard &gt; "OK". (E) Schließlich wählen Sie "Analyse" &gt; "Measure" (ein Fenster mit Daten sollte angezeigt werden, oder eine Registerkarte auf der Windows-Taskleiste erscheint mit der Bezeichnung "Ergebnisse"). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57155/57155fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
(7) DNA Pilz Belastung
<ol><li>Entfernen Sie die Lungen von-80 ° C und lyophilize für mindestens 4 Stunden (über Nacht ist optimal) oder bis vollständig durch ein Einfrieren Trockensystem getrocknet.</li>
	<li>Während die Lunge trocknen, bereiten Sie DNA Extraktionspuffer (0,1 M NaCl, 10 mM EDTA pH 8.0, 10 mM Tris HCl pH 8.0, und 0,5 % SDS zu).</li>
	<li>Ort der vorbereiteten DNA Extraktionspuffer im Wasserbad 60 ° C Vorwärmen. Legen Sie auch Phenol: Chloroform: Isoamyl Alkohol (25:24:1) in einem 50 mL konische Röhrchen und Trennung zu ermöglichen.</li>
	<li>Legen Sie die lyophilisierten Lungen in einem 2-mL-Schraubverschluss Rohr mit 0,2 mL Glasperlen. Mit einem Wulst-Schläger, Mahlen Sie trocken Lungengewebe für 15-30 s, bis ein feines Pulver entsteht.</li>
	<li>Hinzu kommen 0,8 mL warmen DNA Extraktionspuffer jedes Rohr und Wirbel gut. Inkubieren Sie jedes Rohr für 15 min bei 65 ° C Perle Badewanne und dann Wirbel vor der Inkubation für eine zusätzliche 15 min. Nach der Inkubation, Wirbel und dann Zentrifuge Röhren bei 25.000 x g für 10 Minuten.</li>
	<li>3 Sätze von 1,5 mL Röhrchen für jede der Proben beschriften und die oberste Schicht des Überstands in einer Reihe von Röhren zu übertragen. Seien Sie vorsichtig beim Pipettieren, wässrigen Deckschicht, um nicht zu stören, die mittlere Schicht.</li>
	<li>Gleiches Volumen an Phenol: Chloroform: Isoamyl Alkohol hinzufügen und gut verrühren. Anschließend Zentrifugieren Sie bei 25.000 x g für 15 min vor, die obere Schicht in die zweite Reihe von Röhrchen pipettieren.</li>
	<li>Gleiches Volumen an Chloroform: Isoamyl Chloroform hinzufügen, gut mischen und Zentrifugieren bei 25.000 x g für 10 min. sorgfältig Pipette aus der oberen Schicht in die dritte Reihe von Röhren.</li>
	<li>Hinzufügen von 500 µL Isopropanol und 50 µL NaoAc (pH 5,2), gut mischen und Proben bei Raumtemperatur für 10 min inkubieren. Dann bei 25.000 x g für 30 min Zentrifugieren Sie und dekantieren Sie des Überstandes.</li>
	<li>Waschen Sie das DNA-Pellet mit 750 µL aus Eis kalt 70 % Ethanol und Zentrifuge für 5 min bei 25.000 x g. Dekantieren das Ethanol und lassen Sie die Pellets in die Luft in den Rohren in einem Rauch-Hauben für 40 min trocknen.</li>
	<li>Die trockene Pellets in 300 µL TE-Puffer aufzuwirbeln. Hinweis: Die DNA kann bei-20 ° C bis quantifiziert gelagert werden.</li>
	<li>DNA mit einem Spektralphotometer zu quantifizieren und 100 µL 0,2 µg/µL jeder DNA-Probe für qPCR Analyse vorzubereiten.</li>
	<li>Ein standard qPCR in dreifacher Ausführung mit 1 µg DNA-Probe, Pilz 18 s rDNA Grundierung, wie zuvor beschrieben durchführen und Sonde setzt mit einer modifizierten Sonde Quencher (5'- / 56-FAM/AGC CAG CGG/ZEN/CCC GCA AAT G/3IABkFQ/3 ")12,13.</li>
	<li>Bereiten Sie eine Standardkurve aus genomischer DNA A. Fumigatus und berechnen Sie die Konzentration der Pilz DNA in Pg in jeder Probe unter Verwendung der durchschnittlichen Reporters färben Ct-Werte.</li>
	<li>Zeichnen Sie die Pg/µg Pilz DNA mit Standardfehler des Mittelwerts. Führen Sie ein Student t-test Analyse Bedeutung zu bestimmen. Hinweis: als eine weniger giftige Alternative zu den hierin verwendeten Phenol-Chloroform-DNA-Extraktion, Spalte basierend DNA-Extraktion Kits verwendet werden.</li>
</ol>

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<li>Cowley, A. C., Thornton, D. J., Denning, D. W., Horsley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspergillosis+and+the+role+of+mucins+in+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Pulmonol%22%5BJournal%5D)">Aspergillosis and the role of mucins in cystic fibrosis.</a> Pediatr Pulmonol. 52 (4), 548-555 (2017).</li>
<li>Taylor, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+fungal+organisms+in+eosinophilic+mucin+using+a+fluorescein-labeled+chitin-specific+binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Otolaryngol+Head+Neck+Surg%22%5BJournal%5D)">Detection of fungal organisms in eosinophilic mucin using a fluorescein-labeled chitin-specific binding protein.</a> Otolaryngol Head Neck Surg. 127 (5), 377-383 (2002).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Der Zweck dieses Artikels war es, eine Methode zur Bestimmung der Lunge Pilz Belastung bei Mäusen mit IA einzuführen, durch die Verwendung von GMS-gefärbten Lunge histologischen Abschnitte zur Bildanalyse und Quantifizierung. In dieser Studie, Behandlung mit der β-Glucan-Synthese-targeting pilzbefallverhütende Droge Caspofungin14 verbesserte nicht überleben oder Pilzinfektionen Belastung bei neutropenisch Wildtyp Mäusen mit IA-8. Jedoch in Ermangelung von Eosinophilen oder γδ T Zellen überleben und Pilzinfektionen Belastung verbessert. Die Ergebnisse unserer Studie zeigte auch, dass vergleichbare Ergebnisse von GMS Pilz Belastung im Vergleich zu den weit verbreiteten Pilz DNA qPCR Methode6bezogen werden können.
Es gibt mehrere Vorteile für die Verwendung von GMS Pilz Belastung Quantifizierung. Erstens kann der Prozess bestehenden histologische Proben, wodurch möglicherweise die Anzahl der Experimente erforderlich, um signifikante Unterschiede bestimmen nutzen. Zweitens wurden in dieser Studie weniger Tiere für GMS Pilz Belastung Quantifizierung, signifikante Unterschiede im Vergleich zu qPCR Pilz DNA (Bild 6, Bild 7) zu erreichen. Drittens: Vergleich der Pilz Belastung in verschiedenen Isolaten von qPCR Isolat-abhängige Unterschiede in der ribosomalen DNA-Kopie Nummer15betroffen sein kann. Im Gegensatz dazu ist GMS Quantifizierung Exemplarzahl, nicht betroffen, da Pilz Belastung durch relativen Pegel der Lunge Pilzwachstum bestimmt wird. So, die Verwendung von GMS Quantifizierung für Pilzinfektionen Belastung reduziert den Einsatz von Wirbeltieren und erfordert keine Pre-Bestimmung der rDNA Exemplarzahl. Zu guter Letzt neben der Änderung Pilz Morphologie, Caspofungin Therapie Pilz Fragmentierung erhöht und dadurch kann künstlich erhöhen Pilz Belastung gemessen durch Isolierung der Kolonie bildende Einheiten von Lunge Homogenates12,16 ,17. So vermeidet GMS Quantifizierung der Pilz Belastung mehrere Einschränkungen mit anderen häufig verwendeten Methoden.
Allerdings sind die Grenzen der GMS Quantifizierung und/oder dieser Studie darauf hingewiesen. Zuerst die Autoren eine vergleichbare Verteilung von Bodenaggregaten Wachstum der gesamten Lunge jede Versuchsgruppe angenommen und so zur Quantifizierung von 4 Vertreter 10 x Objektive Felder als eine repräsentative Messung der Pilz Belastung in der gesamten Lunge (Abb. 6 b). Es ist möglich, dass in einigen Fällen die relative Verteilung, Größe und Dichte von Bodenaggregaten Brennpunkte hinreichend unterscheiden würde, dass die Pilze Belastung durch die qPCR-Methode anders mit dieser Methode und gleichwertig erscheinen würde. Unsere zusätzliche Ergebnisse mit ganze Lunge Abschnitt Quantifizierung mit Hilfe der 4 X Objektive Felder zeigten jedoch ähnlich, wenn auch weniger statistisch signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen (Abbildung 6). Der Standardfehler des diese Quantifizierung wurde mit dieser Strategie, wahrscheinlich aufgrund der verringerten Bodenaggregaten Auflösung mit dem 4 X Objektive und erhöhte Hintergrund in suboptimalen Bereichen erhöht. Daher wird eine repräsentative Quantifizierung der weniger Felder bei höherer Vergrößerung bevorzugt. Zweitens wurde nur ein einzigen, zentralen Bereich für jede Probe verwendet. Ist es möglich, basierend auf den Pilz Isolate oder Mäuse-Stämme verwendet, dass einige Studien zu einer ungleichmäßigen Verteilung von Bodenaggregaten Wachstum führen können. In diesen Fällen sollten weitere Abschnitte in jedem Paraffinblock quantifiziert werden, um eine repräsentativere Belastung zu erhalten. Drittens: in Experimenten, die umfangreiche Produktion von Schleimstoffe (d. h.Quantifizierung Atemwege Pilzwachstum in allergische bronchopulmonale Aspergillose (ABPA)18 oder zystische Fibrose (CF)18), GMS Reaktivität mit induzieren Polysaccharid-reiche Schleimstoffe19 könnte unspezifische GMS + Ergebnissen führen und so neigen einige Proben zu Gunsten der höheren Belastung Pilz. Da nur das neutropenisch Modell der IA in dieser Studie verwendet wurde, ist es möglich, dass die Verwendung von anderen immun zuständigen oder unterdrückenden Modellen führt zu weniger vergleichbare Ergebnisse könnten. Trotz dieser Vorbehalte GMS Quantifizierung bietet eine vergleichbare Technik um Pilzinfektionen Belastung zu bestimmen und die weitere Verwendung in weiteren Studien kann weiter bestätigen den Nutzen dieser Methode als konsistente, zuverlässige und kostengünstige.

IA ist eine opportunistische Infektion, die bei empfindlichen Personen mit angeborenen oder erworbenen Immunschwäche aufgrund suppressive Immuntherapie oder chronische Infektion1,2entwickeln kann. Primäre Infektion oft tritt in der Lunge, obwohl in einigen Fällen Verbreitung von Aspergillus Fumigatus , Leber, Nieren, Herz und Gehirn auftreten, was zu umfangreichen Gewebe Invasion von Hyphen, begleitet von schweren Krankheiten und hohe Rate von Sterblichkeit1,2. Darüber hinaus die Wirksamkeit der bestehenden Pharmakotherapien ist begrenzt und kann durch das Aufkommen von Antimykotika-resistente Stämme in der Umgebung3weiter geschwächt werden. Es ist daher wichtig, die Mechanismen der Pilz Virulenz und Host-Pathologie, die Förderung der Entwicklung oder Verschlimmerung der invasiven pilzartige Krankheit zu verstehen.
Murine Modelle bleiben für mechanistische IA Studien wichtig, da sie Forschern erlauben zu beurteilen, die Rollen der Pilz Virulenz Gene und host immun Effektoren für die Gründung und das Wachstum von A. Fumigatus in-vivo-4,-5. Infolgedessen wurden mehrere Strategien erarbeitet, um effektiv zu quantifizieren oder Pilzinfektionen Belastung in Gruppen von Versuchstieren6,7zu vergleichen. Diese Strategien beinhalten kulturbasierte, biochemische, Immunoassay oder qPCR Methoden, jeweils mit unterschiedlichen vor- und Nachteilen. Darüber hinaus jede dieser Methoden beinhalten die Widmung einer Teilmenge der Tiere zusätzlich zu den für die Beurteilung der immun-Effektor-Funktion, Ausdruck Genanalyse und vergleichende Histopathologie7geopfert. So erfordern umfassende IA Studien oft erhebliche Anzahl von Versuchstieren zu erheblichen Kosten. Wirksame Strategien, die experimentelle Zeit, Tier Kosten und ethische Überlegungen zu reduzieren, durch die Verwendung von tierischem Gewebe für mehrere Analysen sind daher äußerst wertvoll7.
In diesem Bericht wird eine Methode beschreibt die Quantifizierung der GMS Färbung in histologischen Abschnitte zum Vergleich der relativen Pilz Belastung zwischen experimentellen Gruppen von Mäusen mit IA eingeführt. Jeder Schritt vom Pilz Kultur, Infektion, Gewebe-Ernte und Verarbeitung, und Bildaufnahme, Datenanalyse, ist im Detail beschrieben. Pilze Belastungen durch GMS Quantifizierung gewonnen wurden mit qPCR neutropenisch Modelle der IA und Caspofungin behandelt Wildtyp oder Eosinophilen-defizienten Mäusen mit IA8verglichen. Die Ergebnisse zeigen Ähnlichkeit mit GMS Quantifizierung und qPCR Pilz DNA. Dies deutet darauf hin, dass GMS Quantifizierung nützlich, um Forscher in histologischen Analysen als eine ergänzende oder alternative Methode des Vergleichs der relative Pilz Belastung bei Mäusen mit IA engagiert sein kann und letztlich die Kosten und die Verwendung von Versuchstieren in reduzieren kann komplexe, mechanistische Studien.

<table><tbody><tr><td>Aspergillus fumigatus 293 Stammlösung</td><td>Pilzgenetik Stock Center</td><td>FGSC #A1100</td><td></td></tr><tr><td>HyPure Wasser in Zellkulturqualität</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH30529.03</td><td></td></tr><tr><td>Malzextrakt</td><td>MP Biomedicals</td><td>2155315</td><td>weißes Pulver</td></tr><tr><td>BD&nbsp; BBL Acidicase Dehydrierte Nährmedien: Pepton</td><td>Fisher Scientific</td><td>L11843</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose (D-Glukose) wasserfrei (körniges Pulver/zertifiziertes ACS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-3</td><td></td></tr><tr><td>Fisher BioReagents Agar, Pulver / Flocken, Fisher BioReagents</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1423-500</td><td></td></tr><tr><td>Auto Dry Cabinet</td><td>Shanghai Hasuc Instrument Manufacture Co., Ltd</td><td>HSFC160FD</td><td></td></tr><tr><td>Serie 1300 Klasse II, Typ A2 Biologische Sicherheitswerkbank</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1375</td><td></td></tr><tr><td>0,5 mm Glasperlen</td><td>BioSpec Products</td><td>11079105</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Konische Röhrchen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>Hämazytometer</td><td>Fisher Scientific</td><td># 0267110</td><td></td></tr><tr><td>Leica Modell DME Mikroskop</td><td>Leica</td><td>13595XXX</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8662-500 ml</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml</td><td>Tuben Fisher Scientific</td><td># 05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>BD Precisionglide&nbsp; Spritzennadeln, Feinheit 27, L 1/2 Zoll</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z192384</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus-Ly-6G-Antikörper</td><td>BioXCell</td><td>BP0075-1</td><td>Klon 1A8</td></tr><tr><td>Caspofungin-Diacetat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0425</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Henry Schein Tiergesundheit</td><td>1169567762</td><td></td></tr><tr><td>nicht rebreathing Tabletop-Veterinäranästhesiegerät</td><td>Supera Anästhesieinnovationen</td><td>M3000</td><td></td></tr><tr><td>Pureline Sauerstoffkonzentrator</td><td>Supera Anesthesia Innovations</td><td>OC8000</td><td></td></tr><tr><td>Slant Board Restraint</td><td>Indiana State University Facility Management</td><td>Sonderanfertigung</td><td></td></tr><tr><td>Gilson PIPETMAN Classic 200 ml Pipets</td><td>Fisher Scientific</td><td>F123601G</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital-Natrium (Tödlich-Plus)</td><td>Vortech Pharmaceuticals</td><td>0298-9373-68</td><td></td></tr><tr><td>Allzweck-Pinzette mit breiter Spitze</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-300</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp; Standard-Präparierschere</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-951-20</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Gebogene Allzweckzange</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-275</td><td></td></tr><tr><td>Ethylalkohol-200 Proof</td><td>PHARMCO-AAPER</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Absorbierende Unterlagen</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-206-63</td><td></td></tr><tr><td>BD Precisionglide&nbsp; Spritzennadeln, Feinheit 25, L 1 Zoll</td><td>Fisher Scientific</td><td>Z192406</td><td></td></tr><tr><td>Vollkunststoff-Normspritzen</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-817-30</td><td></td></tr><tr><td>IV CATH ANGIOCATH 22GX1GIN 50B</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9742754</td><td></td></tr><tr><td>Formalinlösung, neutral gepuffert, 10%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>50 ml konische Röhrchen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Shandon Einbettkassetten II in Schlauchpackungen</td><td>Fisher Scientific</td><td>B1000729</td><td></td></tr><tr><td>Fisherfinest&nbsp; Histoplast Paraffinwachs</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-900-700</td><td></td></tr><tr><td>Einweg-Basisformen</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-554</td><td></td></tr><tr><td>Reichert Jung Histocut 820 Mikrotom</td><td>Labequip.com</td><td>31930</td><td></td></tr><tr><td>Wasserbad</td><td>Precision Scientific</td><td>66630-23</td><td></td></tr><tr><td>CO2-Inkubator</td><td>Fisher Scientific</td><td>116875H</td><td></td></tr><tr><td>Silberfleck ( Modified GMS) Kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT100A-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green FCF</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC410530250</td><td></td></tr><tr><td>Frosted Mikroskop Objektträger</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-343</td><td></td></tr><tr><td>Fisherfinest Superslip Cover Glas</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-89</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal XYL</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-050-262</td><td></td></tr><tr><td>Olympus Provis AX70 Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>OLYMPUS-AX70</td><td></td></tr><tr><td>U-PHOTO Universal-Fotosystem</td><td>Olympus</td><td>OLYMPUS-U-PHOTO</td><td></td></tr><tr><td>U-MCB-2 MULTI CONTROL BOX</td><td>Olympus</td><td>OLYMPUS-U-MCB-2</td><td></td></tr><tr><td>U-PS NETZTEIL</td><td>Olympus</td><td>OLYMPUS-U-PS</td><td></td></tr><tr><td>FreeZone 1 Liter Tischgerät Freeze Dry System</td><td>LABCONCO</td><td>7740020</td><td></td></tr><tr><td>Maxima C&nbsp; Plus&nbsp; Vakuumpumpe</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-257-80</td><td>Verdrängung - 6,1 cfm</td></tr><tr><td>1-Butanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A383-4</td><td></td></tr><tr><td>AMRESCO&nbsp; PHENOL-CHLORFORM-OSOAMYL 100ML&nbsp; DFS</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9573988</td><td></td></tr><tr><td>Freistehende Mikrozentrifugenröhrchen mit Schraubverschlüssen</td><td>Fisher Scientific</td><td># 02-682-557</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Beadbeater-24</td><td>BioSpec Produkte</td><td>112011</td><td></td></tr><tr><td>BioSpec ProductsLieferantenvielfalt Partner 2,3 MM ZIRKONOXIDKÜGELCHEN</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0451999</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base (weiße Kristalle oder kristallines Pulver/ Molekularbiologie)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>Salzsäure, zertifiziert ACS Plus</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144S</td><td></td></tr><tr><td>Ethylendiamintetraessigsäure, Dinatriumsalzdihydrat</td><td>Fisher Scientific</td><td>S311</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfat (SDS), weißes Pulver, Elektrophorese</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP166</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform/Isoamylalkohol 24:1</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC327155000</td><td></td></tr><tr><td>Biotek Epoch Mikroplatten-Spektralphotometer</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-120-570</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific&trade; &nbsp; ABsolute Blue qPCR mischt Fisher</td><td>Scientific</td><td>AB4137A</td><td></td></tr><tr><td>Hybridisierungssonde, 5&prime;-FAM-AGCCAGCGGCCCGCAAATG-TAMRA-3&prime;</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Sense Amplification Primer, 5&prime;-GGCCCTTAAATAGCCCGGT-3&prime;</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Antisense Amplification Primer, 5&prime;-TGAGCCGATAGTCCCCCTAA-3&prime;</td><td>Integrierte DNA-Technologien</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Angewandte Biosysteme & Handel MikroAmp&Handel; Optischer 8-Röhrchen-Streifen, 0,2 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>43-165-67</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Gewölbte und flache PCR-Kappenstreifen</td><td>Fisher Scientific</td><td>AB-0386</td><td></td></tr><tr><td>Mx3005P QPCR-System, 110 Volt</td><td>Agilent</td><td>401443</td><td>Stratagene ist jetzt im Besitz von Agilent</td></tr><tr><td>BALB/c-Mäusen</td><td>Das Jackson Laboratory</td><td>000651</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 (B6) Mäuse</td><td>Das Jackson Laboratory</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>Eosinophil-defizient (&Delta; dblGATA, BALB/c Hintergrund) Mäuse</td><td>Das Jackson Laboratory</td><td>005653</td><td></td></tr><tr><td>&gamma; &Delta; T-Zell-defiziente (TCR&delta;-/-, B6 Hintergrund) Mäuse</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>002120</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ Software</td><td>National Institutes of Health</td><td>N/A</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td></tr> <tr><td>Spot Advanced Software</td><td>Spot Imaging</td><td>SPOT53A</td><td>http://www.spotimaging.com/software/spot-advanced/</td></tr> <tr><td>GraphPad Prism 6</td><td>GraphPad Software</td><td>N/A</td><td>https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/</td></tr> <tr><td>Fisherbrand Saugeinlagen</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-206-62</td><td></td></tr><tr><td>Stufe 4.5</td><td></td><td></td><td>http://www.bdbiosciences.com/sg/resources/protocols/paraffin_sections.jsp ; http://www.jove.com/science-education/5039 ; http://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/General_Information/1/ht100.pdf</td></tr></tbody></table>

histologischen quantifizierung lunge pilz belastung in experimentellen aspergillose bestimmen

Histological Quantification to Determine Lung Fungal Burden in Experimental Aspergillosis

Die Quantifizierung der Lunge Pilz Belastung ist entscheidend für die Bestimmung der relativen Pegel der Immunschutz und Pilz Virulenz in Mausmodellen der pulmonalen Pilzinfektion. Obwohl mehrere Methoden verwendet werden, um Pilz Belastung zu beurteilen, hat quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) Pilz DNA eine Technik mit mehreren Vorteilen gegenüber früheren Kultur-basierte Methoden entwickelt. Derzeit erfordert eine umfassende Bewertung der Lunge Pathologie, Rekrutierung von Leukozyten, Pilzinfektionen Belastung und Genexpression bei Mäusen mit invasiver Aspergillose (IA) den Einsatz zahlreicher experimenteller und Kontrolltieren. Hier war die Quantifizierung der Lunge histologische Färbung bestimmen pilzartige Belastung mit einer reduzierten Anzahl von Tieren im Detail untersucht. Lunge Abschnitte waren voller Flecken, um Pilz Strukturen mit Gomoris modifizierten Methanamine Silber (GMS) Färbung zu erkennen. Bilder stammen aus der GMS-gefärbten Abschnitte von 4 diskrete Felder jedes Formalin fixierten Paraffin-eingebetteten Lunge. Die GMS gefärbten Bereiche in jedem Bild wurden quantifiziert mit einem Bild-Analyse-Programm, und aus dieser Quantifizierung wurde der mittlere Anteil der verschmutzten Bereich für jede Probe bestimmt. Mit dieser Strategie, verringert die Eosinophilen-defizienten Mäusen ausgestellt Pilz Belastung und Krankheit mit Caspofungin Therapie, während Wildtyp Mäusen mit IA nicht mit Caspofungin verbessern. Ebenso Pilz Belastung bei Mäusen fehlt γδ T-Zellen wurden auch verbessert durch Caspofungin, gemessen mittels qPCR und GMS Quantifizierung. GMS Quantifizierung ist daher als eine Methode zur Bestimmung der relativen Lunge Pilz Belastung eingeführt, die letztlich die Anzahl der Versuchstiere erforderlich für umfassende Studien über invasive Aspergillose reduzieren kann.

Abbildung 4 enthält ein Diagramm des Überlebens der Wildtyp oder Eosinophilen-defizienten Mäusen mit IA mit Caspofungin behandelt. Die Ergebnisse zeigen, dass Eosinophilen-defizienten Mäusen verlängertes Überleben im Vergleich zu Wildtyp Mäusen ausgestellt (50 % Mortalität im Vergleich zu 100 % Mortalität, beziehungsweise). Abbildung 5 zeigt Vertreter GMS Färbung von neutropenisch Wildtyp und Eosinophilen-defizienten Mäusen mit IA behandelt oder unbehandelt mit Caspofungin. Caspofungin Behandlung führte in der relativen Pilz Abfertigung in Eosinophilen-mangelhaft, aber nicht Wildtyp-Mäusen (richtigen Platten), während beide Gruppen, die nicht erhalten haben waren Caspofungin ähnliche (linken Panels). Abbildung 6 zeigt den Vergleich der Pilz Belastung in Caspofungin behandelt und unbehandelte Wildtyp oder Eosinophilen-defizienten Mäusen zu steuern, verwenden beide qPCR Pilz DNA (Abbildung 6A) und Vertreter GMS Quantifizierung von 4 (10 X Objektiv) Felder) Abbildung 6 b). Die Ergebnisse der beiden Techniken zeigen, dass Caspofungin Behandlungsergebnisse der bedeutendste pilzliche Belastung zwischen Wildtyp und Eosinophilen-defizienten Mäusen (Abb. 6A) zu verringern. Bei unbehandelten Mäusen führte nur GMS Quantifizierung eine signifikante Abnahme der Mäuse fehlen Eosinophile (Abb. 6 b). Als mittlere Bereich der gesamten Lunge GMS-gefärbten Abschnitte wurden berechnet (4 X Objektiv), die Unterschiede waren ähnlich wie die erzielten Ergebnisse mit 4 Vertreter 10 X Felder, wenn auch mit weniger statistische Signifikanz (Abbildung 6). Abbildung 7 zeigt überleben, Vertreter GMS Färbung (4 10 X Felder) und Quantifizierung der Pilz Belastung durch beide Methoden in γδ T-Zell-Mangel (TCRδKO)-Mäuse, die behandelt wurden mit Caspofungin im Vergleich zur Kontrolle, unbehandelten Mäusen. Caspofungin Behandlung verbessert überleben (Abb. 7A) und Pilzinfektionen Belastung (Abb. 7 b-D) bei TCRδKO Mäusen. Ähnlich wie die Ergebnisse der Abbildung 6, waren die Ergebnisse der Pilz Belastung gemessen mittels qPCR (Abb. 7 b) und Vertreter GMS Quantifizierung (Abbildung 7) vergleichbar.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57155/57155fig4.jpg"> Abbildung 4: erhöhte Überlebensrate bei Eosinophilen-defizienten (ΔdblGATA) Mäuse mit IA nach Behandlung mit Caspofungin. 15-30 Mäuse/Gruppe. Zusammenfassung von 3-6 Experimente. p &lt; 0,0001. Diese Zahl wurde von einer früheren Veröffentlichung8geändert. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57155/57155fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57155/57155fig5.jpg"> Abbildung 5: repräsentative Bilder von GMS-gefärbten Lungen-Abschnitte aus Wildtyp, Eosinophilen mangelhaft und Caspofungin behandelt oder Kontrolle unbehandelt Mäuse mit IA Vertreter der 3-4 Mäuse/Gruppe. Maßstabsbalken entspricht 100 µm. Diese Zahl wurde von einer früheren Veröffentlichung8geändert. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57155/57155fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57155/57155fig6.jpg"> Abbildung 6: Pilz in Wildtyp Belastung und Eosinophilen-defizienten Mäusen mit IA behandelt oder Kontrolle mit Caspofungin behandelt. (A) qPCR Pilz DNA. 15-30 Mäuse/Gruppe, Zusammenfassung von 3-6 Experimente. (B) GMS Quantifizierung der histologischen Abschnitte bedeuten % der GMS Färbung von 4 Felder (10 X-Objektiv). (C) GMS Quantifizierung, mittlere % der gesamten Lunge Sektion (4 X Objektiv). B und C sind eine Zusammenfassung der 5 Mäuse/Gruppe. p &lt; 0,05. p &lt; 0,001. p &lt; 0,0001. Diese Zahl wurde Daten generiert, die in einer früheren Publikation8gemeldet wurden. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57155/57155fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57155/57155fig7.jpg"> Abbildung 7: Schweregrad der IA γδ T-Zell-defizienten Mäusen nach Caspofungin Behandlung abgenommen. (A) überleben. (B) qPCR Pilz DNA. (C) GMS Quantifizierung der Histologie. (D) repräsentative Bilder von GMS-gefärbten Abschnitte aus γδ T-Zellen mit IA, behandelt oder unbehandelt mit Caspofungin. A und B sind zwei Experimente mit 7-10 Mäuse/Gruppe im Überblick. C und D sind 4 Mäuse/Gruppe im Überblick. p &lt; 0,05. p &lt; 0,01. p &lt; 0,001. Diese Zahl wurde von einer früheren Veröffentlichung8geändert. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57155/57155fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur pulmonalen Pilz Belastung bei Mäusen mit invasiver Aspergillose durch Quantifizierung der Gomoris modifizierten Methanamine Silber Färbung in histologischen Abschnitte bestimmen. Verwendung dieser Methode führte zu vergleichbaren Ergebnissen mit weniger Tiere im Vergleich zu Bewertung der Pilzinfektionen Belastung durch quantitative PCR der Lunge Pilz DNA.

Histologischen Quantifizierung Lunge Pilz Belastung in experimentellen Aspergillose bestimmen

The quantification of lung fungal burden is critical for the determination of the relative levels of immune protection and fungal virulence in mouse ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, die pulmonale Pilzlast bei Mäusen mit invasiver Aspergillose durch histologische Analyse zu quantifizieren. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Pilzpathogenese über schützende und schädliche Wirtsreaktionsmechanismen und wichtige Virulenzfaktoren von Pilzen zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass vorhandene histologische Proben verwendet werden können, um eine Pilzbelastung mit vergleichbaren Ergebnissen wie bei der quantitativen PCR-Anwendung von Lungenpilz-DNA zu erhalten.Obwohl diese Methode Aufschluss über die invasive Aspergillose geben kann, kann sie auch auf andere Krankheitsstudien angewendet werden, in denen Erreger innerhalb von Wirtsgeweben unterschiedlich gefärbt werden können. Die Idee zu dieser Methode kam uns, als wir anfingen, über alternative Methoden zur Quantifizierung der Lungenpilzbelastung nachzudenken, die weniger variabel sind als quantitative DNA-Methoden. Die Infektion und die Ernteverfahren wird von Angar Tsoggeral, einem Forschungstechniker, vorgeführt.24 Stunden vor der Infektion depletieren Sie die Neutrophilen in jeder experimentellen sieben bis 10 Wochen alten Maus mit 0,5 Milligramm Anti-Maus-Ly-6G-Antikörper in steriler Kochsalzlösung, die intraperitoneal in einem 45-Grad-Winkel in den lateralen unteren rechten Quadranten jedes Tieres verabreicht werden, und bringen Sie die Mäuse in ihre Käfige zurück. Gießen Sie am nächsten Morgen 1,5 Gramm 0,5 Millimeter große Glasperlen auf eine Kulturplatte von A. fumigatus conidia und kippen Sie die Platte vorsichtig hin und her, bis die Kügelchen mit dem Pilz bedeckt sind. Sammeln Sie die konidienbeschichtete Perlenmischung in einem konischen 15-Milliliter-Röhrchen und suspendieren Sie die Kügelchen in fünf Millilitern DPBS.Wirbeln Sie die Kügelchen ein, um sie vom Pilz zu lösen, und zählen Sie die Konidien in einer 50-fachen Verdünnung des Überstands auf einem Hämozytometer. Verdünnen Sie die Konidien auf einmalig 10 bis 8 Konidien pro Milliliter DPBS-Konzentration und laden Sie 50 Mikroliter Konidienlösung pro Maus in einzelne Mikropipetten. Nachdem Sie sich vergewissert haben, dass Sie nicht auf das Einklemmen der Zehen reagieren, legen Sie die erste betäubte Maus in Rückenlage auf ein schräges Brett und halten Sie die oberen Schneidezähne vorsichtig mit einem Gummiband und die unteren Schneidezähne mit einem Metalldraht fest.Halten Sie dann mit einer kleinen Pinzette die Zunge vorsichtig in voller Streckung und geben Sie 50 Mikroliter der Konidienlösung an den Zungengrund ab. Halten Sie die Zunge voll ausgestreckt und achten Sie 20 Sekunden lang auf eine schnelle Atmung und das deutliche Klickgeräusch der Aspiration oder bis die Federung vollständig abgesaugt ist. Bringen Sie dann die Maus vorsichtig in ihren Käfig mit Überwachung zurück, bis sie vollständig liegt, und infizieren Sie das nächste Tier.Wenn alle Mäuse infiziert sind, injizieren Sie einer Untergruppe der Tiere ein Antimykotikum und wiederholen Sie die Erschöpfung der Neutrophilen bei allen Tieren 24 Stunden nach der Infektion. Drei Tage nach der Verabreichung des Pilzes legen Sie die erste Maus in Rückenlage auf eine Schaumstoffplatte, die mit einem saugfähigen Pad bedeckt ist. Stellen Sie sicher, dass die Maus mit einem Zehenkneifen eingeschläfert wird, und desinfizieren Sie das Haar mit 70 % Ethanol.Nachdem Sie die Gliedmaßen gesichert haben, öffnen Sie vorsichtig mit einer Schere die obere Brusthöhle und schneiden Sie den Brustkorb weg, um die Lunge und das Herz freizulegen. Schneiden Sie die untere Hohlvene, die vom Herzen absteigt, und achten Sie darauf, dass andere Blutgefäße nicht durchtrennt oder Organe durchstochen werden, und verwenden Sie eine Fünf-Milliliter-Spritze, die mit einer 25-Gauge-Nadel ausgestattet ist, die in einem 45-Grad-Winkel gehalten wird, um langsam fünf Milliliter kaltes DPBS in den rechten Ventrikel des Herzens zu perfundieren. Nach der Perfusion mit fünf Millilitern 10%igem Formalin auf die gleiche Weise die Luftröhre vorsichtig freilegen und die umgebenden Fettpolster lösen, wobei darauf zu achten ist, dass die Luftröhre nicht durchstochen wird.Heben Sie die freiliegende Luftröhre mit einer Pinzette an und stechen Sie mit einer 25-Gauge-Nadel ein Loch in die obere Luftröhre. Führen Sie vorsichtig eine Kanüle durch das Loch in Richtung Lunge ein und binden Sie einen chirurgischen Faden locker um die Luftröhre, um die Kanüle zu sichern. Verwenden Sie eine Ein-Milliliter-Spritze, um die Lunge mit einem Milliliter 10%iger Formalinpuffer durch die Kanüle aufzublasen und entfernen Sie die Kanüle schnell, aber vorsichtig.Ziehen Sie den chirurgischen Faden fest, um die Luftröhre abzudichten, und ziehen Sie vorsichtig am Faden, um das Bindegewebe zu lösen, damit die Lunge und die Luftröhre entnommen werden können. Legen Sie das Gewebe in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen mit 15 Millilitern 10%igem Formalinpuffer, wobei ein Ende des Fadens außerhalb des Röhrchens liegt. Verschließen Sie dann die Kappe und drehen Sie das Röhrchen um, um die Probe und das Fixiermittel mindestens 24 Stunden lang vollständig einzutauchen.Um das entnommene Gewebe abzubilden, öffnen Sie zunächst ein geeignetes bildgebendes Quantifizierungsprogramm und verwenden Sie ein Lichtmikroskop, um mindestens vier verschiedene Felder jedes Gomori-modifizierten Methanamin-, Silber- oder GMS-gefärbten Objektträgers unter dem 10X-Objektiv zu erhalten. Stellen Sie sicher, dass die Bilder repräsentativ für die infizierten Atemwege in der Lunge sind und dass sie eine ähnliche Gewebedichte aufweisen. Um den Bildern Maßstabsleisten hinzuzufügen, wählen Sie im Menü Bearbeiten die Option Kalibrierungsmarkierungen hinzufügen/bearbeiten und wählen Sie die Linienstärke, die Farbe und die Größe der Maßstabsleiste aus.Klicken Sie auf das Bild, in dem die Maßstabsleiste platziert werden soll, öffnen Sie dann das Menü Bearbeiten und wählen Sie Zusammenführen und Kalibrierungsmarkierungen zusammenführen, um jedem Bild eine Maßstabsleiste hinzuzufügen und die Bilder in den entsprechenden Experimentiergruppenordnern zu speichern. Um die Pilzbelastung bei jedem Tier zu berechnen, öffnen Sie ein entsprechendes Bildbearbeitungsprogramm und öffnen Sie den ersten Ordner mit Bildern. Wählen Sie im Menü Bild die Option Typ und RGB-Stapel aus, um die Bilder zu konvertieren.Wählen Sie mit der Pfeiltaste nach rechts das zweite der drei Bilder aus und drücken Sie Strg-Umschalt-T, um die Einstellung der Schwellenwert-Menüeinstellungen zu öffnen. Suchen Sie das ursprüngliche TIFF- oder JPG-Bild als Referenz und öffnen Sie das Bild mit einem Bildbetrachtungsprogramm. Bei der Auswahl des Schwellenwerts ist es entscheidend, das Originalbild anzeigen zu können, damit der ausgewählte Bereich repräsentativ für die Pilzhyphen ist und die Konsistenz zwischen den Proben gewährleistet ist.Schieben Sie den oberen Schieberegler ganz nach links und passen Sie den unteren Schieberegler an, bis der ausgewählte rote Bereich repräsentativ für das Mikroskopiebild ist. Klicken Sie auf Festlegen und OK und wählen Sie Messwerte analysieren und festlegen aus, um den Bereich zu überprüfen, den Flächenanteil, den Grenzwert auf Schwellenwert zu begrenzen, die Beschriftung anzuzeigen und die unteren Einstellungen als Standard beizubehalten. Klicken Sie auf OK und wählen Sie Analysieren und Messen aus.Die Ergebnisse sollten angezeigt werden. Exportieren Sie dann die Daten in ein Datenanalyseprogramm, um sie grafisch darzustellen und statistisch zu analysieren, und geben Sie den Mittelwert der vier oder mehr Flächenprozentsätze für jede Lungenprobe ein. Wie diese repräsentative Überlebensgrafik zeigt, weisen eosinophil-defiziente Mäuse mit invasiver Aspergillose, die nach der Infektion mit einem Antimykotikum behandelt wurden, ein erhöhtes Überleben im Vergleich zu Wildtyp-Tieren auf.Repräsentative GMS-Färbungen von neutropenischen Wildtyp- und Eosinophilen-defizienten Mäusen mit invasiver Aspergillose zeigen eine nahezu vollständige Pilz-Clearance bei antimykotisch behandelten Knockout-Mäusen, die bei Wildtyp-Tieren mit oder ohne antimykotische Behandlung nicht reziprok ist. Darüber hinaus bestätigen sowohl die quantitative PCR als auch die manuelle Lichtmikroskopie-GMS-Quantifizierung, wie gerade gezeigt wurde, dass die Behandlung mit Antimykotika zu der signifikantesten Verringerung der Pilzlast zwischen Wildtyp- und Eosinophilen-defizienten Mäusen führt. Bei unbehandelten Mäusen wurde jedoch nur durch die GMS-Quantifizierung ein signifikanter Rückgang der Eosinophilen-defizienten Mäuse in diesem Experiment festgestellt.Wenn die mittleren Flächen von GMS-gefärbten Schnitten der gesamten Lunge unter vierfacher Vergrößerung berechnet werden, sind die Unterschiede ähnlich wie bei den Ergebnissen, die mit vier repräsentativen 10X-Feldern erzielt wurden, wenn auch mit geringerer statistischer Signifikanz. Ähnliche Überlebens-, Pilzbelastungs- und Pilzbeseitigungsergebnisse wurden auch bei Mäusen mit Gamma-Delta-T-Zell-defizienten Zellen beobachtet, die mit demselben Antimykotikum behandelt wurden. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, bei der Aufnahme der histologischen Schnitte und bei der Anpassung des Schwellenwerts konsistent zu bleiben, um vergleichbare Ergebnisse zu erhalten.Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden durchgeführt werden, die die histologische Analyse von Proben mit deutlichen Unterschieden zwischen Ziel- und Hintergrundfärbung beinhalten, um zusätzliche Fragen zur Krankheitspathologie in der Lunge und anderen Geweben zu beantworten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Mäuse durch unwillkürliche Aspiration mit Pilzkonidien infiziert und wie man das Pilzwachstum in Lungengewebeschnitten mit einer Bildverarbeitungssoftware misst. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Aspergillus fumigatus und dem modifizierten Methanaminsilberfleck von Gomori gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen persönlicher Schutzausrüstung und das Arbeiten unter einer gut belüfteten Haube getroffen werden sollten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Wir zeigen, wie 2-Photonen-Mikroskopie für die Beobachtung der Dynamik der neutrophilen Granulozyten im infizierten Lungengewebe verwenden, während sie Krankheitserreger oder phagozytieren produzieren neutrophilen extrazellulären Traps (NETs).

Direkte Beobachtung der Phagozytose und NET-Bildung durch Neutrophile im infizierten Lungengewebe mittels 2-Photonen-Mikroskopie

Die Verwüstung von Getreide durch Samen-Pilzresistenz hat zahlreiche Forschungsarbeiten zum besseren Verständnis Pflanze-Pathogen-Interaktionen dazu aufgefordert werden. Um Saatgut-Pilz-Interaktionen in einem Labor untersuchen, entwickelten wir eine robuste Methode zur Quantifizierung von Pilz-Reproduktion, Biomasse und Mykotoxinkontamination mit Kernel Bioassays.

Die Quantifizierung der Pilzbesiedlung, Sporogenese und Produktion von Mykotoxinen Kernel-Bioassays

Dieses Video zeigt eine Methode zur Quantifizierung von Pilzinfektionen bei Zebrafischlarven. Pilzsporen werden in den Ventrikel des Hinterhirns der Larve mikroinjiziert, und die Larven werden inkubiert, um die Entwicklung einer Infektion zu ermöglichen. Infizierte Larven werden in definierten Intervallen geerntet, und der Infektionsfortschritt wird durch die Aufzählung koloniebildender Einheiten bewertet.

Eine Technik zur Quantifizierung von Pilzinfektionen bei Zebrafischlarven

Dieses Video zeigt eine Methode zur Quantifizierung der Phagozytose von FITC-markierten pathogenen Pilzsporen durch menschliche Leukozyten. Phagozytierte Sporen werden durch Gegenfärbung von zelladhärenten Sporen unterschieden, gefolgt von einer durchflusszytometrischen Analyse.

Quantitative durchflusszytometrische Messung der Pilzsporen-Phagozytose durch humane Phagozyten

Ein Verfahren, um die Fähigkeit der isolierten Maus-Alveolarmakrophagen, um das Wachstum von phagozytierten Aspergillus-Sporen durch konfokale Mikroskopie Steuerung auszuwerten.

Beurteilung der Anti-Pilz-Aktivität von isolierten Alveolarmakrophagen durch konfokale Mikroskopie

Dieses Protokoll bietet eine schnelle und zuverlässige Methode zur quantitativen Messung der Phagozytose der Aspergillus fumigatus conidia durch menschliche primäre Phagozyten mittels Durchflusszytometrie und zur Unterscheidung der Phagozytose der Conidia von der bloßen Adhäsion zu Leukozyten.

Messung der Phagozytose von Aspergillus fumigatus Conidia durch menschliche Leukozyten mit Flow Cytometrie

Dieses Protokoll beschreibt ein Aspergillus-Infektionsmodell bei Zebrafischlarven. Aspergillus Sporen werden mikroinjiziert in das Hinterhirn von Larven, und chemische Behandlung wird verwendet, um Immunsuppression zu induzieren. Das Fortschreiten der Infektion wird über eine tägliche Bildgebung überwacht, um das Pilzwachstum und die Immunantworten sowie die Aufzählung lebender Sporen durch Koloniebildbildung zu überwachen.

Infektion von Zebrafischlarven mit Aspergillus Sporen zur Analyse von Wirts-Pathogen-Wechselwirkungen

Wir beschreiben die Methode zur quantitativen Analyse der Verteilung von Aspergillus fumigatus conidia (3 μm groß) in den Atemwegen von Mäusen. Die Methode kann auch für die Analyse von Mikropartikeln und Nanopartikelagglomeratverteilung in den Atemwegen in verschiedenen pathologischen Zustandsmodellen verwendet werden.

Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie-basierte quantitative Analyse der Aspergillus fumigatus Conidia-Verteilung in der optisch geklärten Mauslunge

Wir präsentieren ein markierungsfreies Live-Imaging-Protokoll mit Durchlichtmikroskopie-Techniken, um Bilder zu erfassen, die Wachstumskinetik des filamentösen Pilzes A. nidulans sowohl in Unterwasserkulturen als auch in festen Medien zu analysieren und zu quantifizieren. Dieses Protokoll kann in Verbindung mit der Fluoreszenzmikroskopie verwendet werden.

Quantitative Analyse der Wachstumsrate von Aspergillus nidulans mittels Live-Mikroskopie und Open-Source-Software

Wir stellen eine Methode für ein Pilzpathogenesemodell vor, das die natürliche Positionierung von Pilzsporen in den Lungenatemwegen für die Analyse mittels Fluoreszenzmikroskopie beibehält.

Effiziente Methode zur Bildgebung der Lunge von Mäusen, die die räumliche Dynamik von Pilzsporen in den Atemwegen bewahrt

Lernen Sie die histologische Quantifizierung der Pilzbelastung in der Lunge bei invasiver Aspergillose in Mäusen. Diese Methode nutzt Gomori-Färbung und liefert vergleichbare Ergebnisse wie quantitative PCR.

Histologischen Quantifizierung Lunge Pilz Belastung in experimentellen Aspergillose bestimmen

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