Wesentlichen Metall Aufnahme in Gram-negativen Bakterien: Röntgen-Fluoreszenz, Radioisotopen, und Zelle Fraktionierung

Das übergeordnete Ziel dieser Technik ist es, bakterielle periplasmatische Inhalte durch Zellfraktionierung für die biophysikalische Charakterisierung zu extrahieren, einschließlich Röntgenfluoreszenz, Röntgenkristallographie und Radiometallaufnahme. Diese Methode kann uns helfen, wichtige biologische Beziehungen zu verstehen, einschließlich der Struktur-Funktions-Beziehungen von ABC-Transportsystemen und wie sie ihre Substrate spezifisch erkennen und durch die Lipiddoppelschicht in die Zelle transportieren. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, den Zellinhalt separat zu bewerten und das Protein mit minimaler Kreuzkontamination aus seiner natürlichen Umgebung zu extrahieren.

Wir hatten die Idee zu dieser Methode, als wir versuchten, das YfeA-Substrat zu entfernen, und stellten fest, dass wir die Zelle anstelle eines künstlichen Ansatzes zur Produktion von Apo-Protein verwenden könnten. Methoden wie dieser Radiotracer-Assay bieten nicht nur Einblicke in die Substratbindung und den Transport durch bakterielle Zellkompartimente, sondern lassen sich auch auf eukaryotische Systeme anwenden, die auch über robuste Fraktionierungstechniken verfügen. Tauen Sie zunächst eine zuvor vorbereitete bakterielle Subkultur-Resuspension bei vier Grad Celsius auf.

Pelletieren Sie dann die aufgetauten Zellen bei 4.000-facher Schwerkraft für 20 Minuten bei 4 Grad Celsius. Als nächstes werden die Zellen in 50 Millilitern eiskaltem Puffer mit hohem Salzgehalt resuspendiert, indem Sie mit einer automatisierten Pipette und einer 25-Milliliter-Spitze aspirieren. Inkubieren Sie die Suspension 20 Minuten lang über Eis mit gelegentlicher Inversion zum Mischen.

Nach der Inkubation pelletieren Sie die Zellen bei 4.500-facher Schwerkraft für 20 Minuten bei 4 Grad Celsius. Suspendieren Sie die Zellen wieder in 15 Millilitern eiskaltem, salzarmem Puffer, indem Sie mit einer automatisierten Pipette und einer 25-Milliliter-Spitze aspirieren. Dann inkubieren Sie die Suspension 20 Minuten lang über Eis mit gelegentlicher Inversion zum Mischen.

Ein osmotischer Schock reißt die gramnegative äußere Membran auf, nachdem die Salzkonzentration in der Umgebung plötzlich gesunken ist. Ein schonender Umgang mit den Zellen ist entscheidend, um einen unerwünschten weiteren Bruch der inneren Membran, eine Kreuzkontamination des Periplasma-Zytoplasmas und eine Destabilisierung oder Aggregation freigesetzter Periplasmaproteine zu vermeiden. Anschließend pelletieren Sie die Sphäroplasten bei 4.500-facher Schwerkraft für 20 Minuten bei 4 Grad Celsius.

Gewinnen Sie dann den Überstand, der das Periplasma enthält. Die pelletierten Sphäroplasten werden in phosphatgepufferter Kochsalzlösung durch Aspirieren mit einer automatisierten Pipette und einer 25-Milliliter-Spitze wieder suspendiert. Lysieren Sie dann die Zellen mit drei Zyklen einer französischen Druckzellenpresse bei 1.500 psi.

Pelletieren Sie nun die Zelltrümmer bei 50.000-facher Schwerkraft für 20 Minuten bei 4 Grad Celsius. Den Überstand mit dem Zytoplasma zurückgewinnen. Nach der Fraktionierung und Reinigung der periplasmatischen Fraktion werden 1,5 Mikroliter des gereinigten Proteins mit PEG 4000, Natriumchlorid, Bis-Tris-Puffer und Natriumazid in einem sitzenden Tropfen oder hängenden Tropfen gemischt, indem mit einer Pipette und einer 10-Mikroliter-Spitze aspiriert wird.

Inkubieren Sie die Kristallisationstropfen bei 293 Kelvin für zwei bis vier Wochen. Nach der Inkubation werden die Kristalle geerntet und in einem Flüssigstickstoffpool für den Versand im Synchrotron schockgefroren. Für die Röntgenfluoreszenzanalyse bewegen Sie die Probe aus dem Strahl und navigieren Sie in der Software zur Registerkarte Hutch.

Energie wird unter Verwendung der Unterposition Energie auf 10 Kiloelektronenvolt eingestellt. Verschieben Sie als Nächstes die Probe zurück in den Strahl und navigieren Sie zur Registerkarte Scannen. Navigieren Sie zur Registerkarte Interaktiv.

Wählen Sie Fluoreszenzsignal optimieren. Geben Sie vier Sekunden unter der Unterüberschrift Zeit ein, und wählen Sie Fluoreszenzspektrum messen aus. Das Spektrum wird automatisch zur Anzeige auf der Registerkarte Diagramm dargestellt.

Es können interessante Elemente ausgewählt werden, um die Analyse der Energieregionen zu leiten, die ihren Emissionsspitzen entsprechen. Für die Analyse der Metallenergieabsorption bewegen Sie die Probe aus dem Strahl. Navigieren Sie zur Registerkarte Scan, dann zur Registerkarte Periodensystem und wählen Sie die K-Kante der gewünschten Elemente aus.

Navigieren Sie als Nächstes zur Registerkarte Hutch. Verwenden Sie die Unterüberschrift Energie, um die Energie auf den Wert im vorherigen Schritt in Kiloelektronenvolt einzustellen. Bewegen Sie die Probe in den Strahl.

Navigieren Sie zur Registerkarte Scannen. Navigieren Sie zur Registerkarte Automatisch und geben Sie zwei Sekunden unter der Unterüberschrift Zeit ein. Wählen Sie nun Scan starten und zeigen Sie den MAD-Scan auf der Registerkarte Plotten an, und wählen Sie Kantenscan, um die Energieabsorptionskante zu bestimmen.

Wählen Sie dann Fertig mit der Fluoreszenz. Nach der Vorbereitung der Subkultur mit dem radioaktiven Tracer aliquotiert ein Milliliter in einzelne 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen, indem mit einer Pipette und einer Ein-Milliliter-Spitze aspiriert wird. Legen Sie die drei Replikationsstandards beiseite.

Sie werden sie bis zum Ende des Experiments nicht mehr benötigen. Legen Sie die restlichen Röhrchen in einen 37 Grad Celsius heißen ThermoMixer und wirbeln Sie sie bei einmaliger Schwerkraft ein. Nach der Inkubation zentrifugieren Sie die Röhrchen 30 Sekunden lang bei der 15.000-fachen Schwerkraft mit einer Tischzentrifuge, vorzugsweise abgekühlt auf 4 Grad Celsius.

Nachdem Sie die Überstände verworfen haben, suspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter eiskaltem Puffer mit hohem Salzgehalt, indem Sie mit einer Pipette und einer Ein-Milliliter-Spitze aspirieren und sofort 20 Minuten lang auf Eis legen. Nach der Zentrifugation werden die Zellen in eiskaltem, salzarmem Puffer durch Aspirieren mit einer Pipette und einer Ein-Milliliter-Spitze wieder suspendiert und 20 Minuten lang auf Eis inkubiert. Nachdem Sie die Zellen 30 Sekunden lang bei der 15.000-fachen Schwerkraft pelletiert haben, sammeln Sie jeden der Überstände in neuen 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.

Messen Sie die Radioaktivität in jeder Fraktion und jedem Standard. Verwenden Sie die Menge an Radioaktivität in den Standards, um die Gesamtmenge an Radioaktivität zu bestimmen, die ursprünglich jeder Probe zugesetzt wurde. Es wurden SDS-PAGE-Gel- und Gelfiltrationschromatogramme gesammelt, um die Qualität der Proteinreinigung aus der präparativen Periplasmafraktionierung zu bewerten.

Ein Liner-Elutionsgradient für die Anionenaustauschchromatographie verbessert die YfeA-Anreicherung von 8 % der Periplasmenfraktion auf 49 % des Anionenaustauschprodukts erheblich. Diese Zusammensetzung wird durch Gelfiltration auf 61% verbessert und die Elutionsvolumina des Apo-Proteins und des Holo-Proteins sind identisch. Gereinigtes Apo und holo YfeA kristallisieren unter den gleichen Kristallisationsbedingungen, obwohl Bilder von Apo- und holo YfeA-Kristallmorphologien Unterschiede im Kristallwachstum zwischen apo- und holo YfeA-Zuständen zeigen.

Angesichts der Tatsache, dass Zink das primäre Substrat ist, das an rekombinantes YfeA gebunden ist, können Röntgenfluoreszenzspektren zwischen einer Probe unterscheiden, die ein starkes Zinksignal enthält, das dem Holo-YfeA entspricht, was auf eine Kreuzkontamination hinweist, oder einem schwächeren Zinksignal, das auf apo YfeA und minimale Kreuzkontamination hindeutet. Ein 60-minütiger Snapshot der Fraktionierung der radioaktiven Metallaufnahme, der periplasmatische und zytoplasmatische Fraktionen von E.coli-Zellen vergleicht, die nur YfeA, den vollständigen YfeABCDE-Transporter, und keine der YfeABCDE-Komponenten exprimieren, zeigt die Auswirkungen der Expression eines einzelnen rekombinanten Proteins oder Proteinkomplexes auf die Metallaufnahme. Sobald das periplasmatische Kompartiment beherrscht ist, kann es durch Fraktionierung aus ganzen Zellen extrahiert werden.

Das Protein, das durch Chromatographie weiter gereinigt wird, und das Protein, das für die Kristallisation von Interesse ist, sinkt in etwa vier Stunden und 30 Minuten, wenn die Verfahren ordnungsgemäß durchgeführt werden. Während des Fraktionierungs- und Aufreinigungsverfahrens ist es wichtig, die Probe während der Fraktionierung auf Eis und während der Reinigung bei 4 Grad Celsius zu halten. Diese Bedingungen verbessern die Qualität der Fraktionierung und die Stabilität des gereinigten Proteins.

Nach diesem Verfahren können andere Metalle wie Kupfer oder Gallium eingeführt werden, um die kompetitive Hemmung oder Transportraten von nicht-kanonischen Substraten zu messen und zusätzliche Fragen zur Substratspezifität und wichtigen funktionellen Aminosäuren zu beantworten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man E.coli-Zellen fraktioniert und biophysikalische Analysen des Inhalts eines Zellkompartiments, wie z. B. des Periplasmas, durchführt, ohne das Zytoplasma zu kontaminieren. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Radioaktivität extrem gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen, wie z. B. eine angemessene Abfallentsorgung und die Verwendung eines minimalen radioaktiven Reagenzes, bei der Durchführung dieses Verfahrens immer berücksichtigt werden sollten.