Size Matters: Messung des Durchmessers der Kapsel in Cryptococcus neoformans

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Polysaccharidkapsel von C.neoformans-Stämmen für die Visualisierung und Messung des Kapseldurchmessers zu färben. Diese Methoden können Forschern bei der Induktion, Bildgebung und Messung der Kapselgröße in Cryptococcus neoformans helfen. Der Hauptvorteil der Färbe- und Bildgebungsverfahren besteht darin, dass sie einfach und schnell sind und eine genaue Messung des Kapseldurchmessers ermöglichen.

visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Softwareschritte bei der ersten Verwendung verwirrend sein können. Der Durchmesser der Kapsel von Cryptococcus neoformans wird oft als Maß für die Virulenz verwendet. Die Möglichkeit, diesen Prozess zu automatisieren, kann erhebliche Einsparungen bei der Analyse von Zeit bringen.

Um die Kapselproduktion zu induzieren, inkubieren Sie zunächst eine C.neoformans-Kolonie in Hefe-Pepton-Dextrose-Brühe bei 37 Grad Celsius und schütteln Sie sie 18-36 Stunden lang, bis sich die Kultur in der logarithmischen Phase befindet. Am Ende der Kultur pelletieren Sie die Hefe durch Zentrifugation und waschen die Hefe dreimal in PBS. Nach der letzten Wäsche resuspendieren Sie die Hefe zweimal 10 bis fünf Zellen pro zwei Milliliter DMEM-Konzentration und inkubieren Sie die Kultur 18 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.

Am nächsten Tag werden die Zellen durch Zentrifugation entnommen und alle bis auf die letzten 10 Mikroliter des Überstands entfernt. Um die Hefe mit Tusche zu färben, resuspendieren Sie das Pellet im restlichen Überstand und übertragen Sie vier Mikroliter der Zellsuspension und vier Mikroliter Tusche auf einen Objektträger aus Glasmikroskop. Mischen Sie die resultierende Lösung vorsichtig, ohne Blasen zu bilden.

Legen Sie dann ein 13 Millimeter dickes Glasdeckglas mit der Stärke 1,5 über die Zellprobe und versiegeln Sie die Ränder mit einem ungiftigen Dichtmittel. Um die Hefe mit einem Fluoreszenzfarbstoff zu färben, resuspendieren Sie das Übernacht-Kulturpellet in 50 Mikrolitern PBS, ergänzt mit 1 %igem Rinderserum, und inkubieren Sie die Zellen in 55-60 Mikrolitern monoklonalem 18B7-Antikörper aus 55-60 Mikrolitern Calcofluor-Weiß und Alexa Fluor 488 konjugierter Kapsel monoklonaler 18B7-Antikörper für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius. Am Ende der Inkubation werden die Zellen durch Zentrifugation entnommen und das Pellet in 10 Mikrolitern PBS plus Rinderserumalbumin resuspendiert.

Übertragen Sie dann acht Mikroliter Zellen auf einen Glasobjektträger, decken Sie die Zellprobe mit einem 13 Millimeter dicken Glasdeckglas mit der Nummer 1,5 ab und versiegeln Sie die Ränder mit einem ungiftigen Dichtmittel. Um die Hefe mit beiden Farbstoffen zu färben, inkubieren Sie die Zellen zunächst mit einer fluoreszierenden Kapsel und einer Zellwandfärbung, wie gerade gezeigt. Geben Sie dann vier Mikroliter fluoreszierend gefärbte Zellen und vier Mikroliter Tusche auf einen Objektträger und legen Sie ein versiegeltes Deckglas wie gezeigt über die Pilzzellprobe.

Um die Zellen durch Lichtmikroskopie abzubilden, wählen Sie das 100-fache Objektiv und bilden Sie mindestens 50 nicht überlappende Zellen pro Bedingung ab, wobei die Belichtungszeiten optimiert sind, um den Bildkontrast zu maximieren und gleichzeitig die durch kleine Zellbewegungen verursachte Unschärfe zu minimieren. Um die Zellen durch Fluoreszenzmikroskopie abzubilden, öffnen Sie die Mikroskop-Bildgebungssoftware und wählen Sie die geeigneten Anregungs- und Emissionswellenlängen für die verwendeten Fluorophore aus. Wählen Sie in der Systemsteuerung des Z-Stapels die vorletzte Option aus.

Fokussieren Sie mit dem Feinfokus am Mikroskop zunächst unterhalb der breitesten Stelle des Zellkörpers einer einzelnen Hefezelle und der Kapseln für alle Zellen innerhalb des aktuellen Sichtfeldes und klicken Sie auf Zuerst einstellen. Verwenden Sie dann den Feinfokussierer, um über den breitesten Punkt des Zellkörpers derselben Zelle und der Kapsel für alle Zellen innerhalb des aktuellen Sichtfelds zu fokussieren, und klicken Sie auf Zuletzt einstellen. Öffnen Sie dann die Registerkarte "Erfassung" und klicken Sie auf "Experiment starten", um den Z-Stapel für die aktuelle Position zu erfassen.

Um die Kapsel- und Küvettendurchmesser manuell zu messen, öffnen Sie ein entsprechendes Küvettenmessprogramm und wählen Sie das zu messende Bild aus. Wählen Sie Messen aus, und ziehen Sie mit dem Cursor eine gerade Linie durch den breitesten Punkt der gesamten Zelle, um den Gesamtdurchmesser der Zelle zu messen. Klicken Sie erneut auf Messen, und ziehen Sie eine gerade Linie durch den Zellkörper, um den Durchmesser des Zellkörpers zu messen und die nächste Zelle zu öffnen.

Wenn alle Zellen vermessen wurden, speichern Sie die Bilder. Für die automatische Messung der Kapsel- und Zelldurchmesser öffnen Sie zunächst ein geeignetes Bildbearbeitungsprogramm und invertieren alle mit Tusche gefärbten Zellbilder. Um als Nächstes sowohl das Original als auch das invertierte Bild in die Zellenmesssoftware zu importieren, öffnen Sie das Dateimenü im Messprogramm und wählen Sie Sequenz importieren, Bild laden, Sequenz manuell definieren, Bemaßungskanal, Importieren und Anwenden.

Um den Zellkörper zu erkennen und zu maskieren, wählen Sie das Fluoreszenzprotokoll des Kolonieanalysators für das erste invertierte Bild von Interesse aus und klicken Sie auf Anwenden. Wählen Sie erneut das Fluoreszenzprotokoll des Kolonieanalysators aus, um die invertierten C.neoformans-Zellkörperbilder aus ihren Kapseln zu segmentieren, und klicken Sie erneut auf Anwenden, um eine Zählmaske zu erstellen. Klicken Sie mit der rechten Maustaste, um die Zählmaske in Zellkörper umzubenennen und das Zellproliferationsprotokoll auf dem Originalbild zu verwenden, um die Kapsel zu erkennen und zu maskieren.

Klicken Sie auf Anwenden, um eine Zählmaske für das Originalbild zu erstellen und die Zählmaskenkapsel umzubenennen. Um eine neue Maske über dem Originalbild zu erstellen, um die angrenzenden Kapseln voneinander zu trennen, wählen Sie Kapselpartition und Kapsel für den Kapselbereich aus. Um die Daten zu exportieren, klicken Sie auf die Tabelle und dann auf das Symbol In Tabelle exportieren.

Wählen Sie die Messungen aus, die Sie exportieren möchten, und speichern Sie abschließend die Daten. Eine Zunahme der Kapselgröße ist bei den meisten Stämmen nach der Induktion offensichtlich, obwohl einige Stämme von Natur aus kleine Kapseln aufweisen. In diesem repräsentativen Experiment wurde durchweg ein signifikanter Unterschied in der Kapselgröße zwischen dem größten Stamm und den beiden kleineren Stämmen beobachtet.

Auch Unterschiede in der Kapselgröße können mit Hilfe von Fluoreszenzfarbstoffen nachgewiesen werden. Die Z-Stapel-Bilderfassung stellt sicher, dass der maximale Kapsel- und Zellkörperdurchmesser für jede Zelle erfasst wird. Die Stacks können dann verarbeitet werden, um Projektionen mit maximaler Intensität für die manuelle Messung der Hefezellkapsel und des Zelldurchmessers zu erstellen.

Es gibt keinen signifikanten Unterschied zwischen den Kapselmessungen mit beiden Färbemethoden, obwohl eine größere Variabilität zwischen den Experimenten beobachtet wird, wenn Tusche zur Messung von Kapseldurchmessern im Vergleich zur Fluoreszenzfärbung verwendet wird. Signifikante Unterschiede bei der Messung des Kapseldurchmessers zwischen verschiedenen Forschern werden in der Regel nicht unabhängig von der verwendeten Methode beobachtet, während kleine, aber signifikante Unterschiede in der Kapselgröße mit der automatisierten Messmethode nachgewiesen werden können. Für eine erfolgreiche automatisierte Messung müssen die Zellen scharf sein, eine mittlere bis große Kapsel haben und dürfen nicht übermäßig geclustert sein.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Kapsel in Cryptococcus neoformans induziert, sie entweder mit Tusche oder Fluoreszenzfärbung färbt, die Kapsel abbildet und mit automatisierter Software vermisst.