Eine Methode, um die Auswirkungen der Umweltanreicherung Doppelpunkt Microbiome Biodiversitätskonvention in einem Mausmodell Doppelpunkt Tumor definieren

Das Hauptziel dieser Veröffentlichung ist es, eine Methode zur Normalisierung des Mikrobioms von Nagetieren vorzustellen. In dieser Demonstration wird die Wirkung der Umweltanreicherung auf das Mikrobiom während der Entstehung von Dickdarmtumoren untersucht. Dieses Protokoll zeigt, wie die Normalisierung des Mikrobioms vor einer Umweltanreicherung die experimentelle Reproduzierbarkeit verbessert.

Wir zeigen auch, wie man den Stress der Tiere reduzieren und die Interaktionen mit einer angereicherten Umgebung verbessern kann. Obwohl wir uns auf den Effekt der Umweltanreicherung in einem Dickdarmtumormodell konzentriert haben, kann die Methode leicht angewendet werden, um die Rolle des Mikrobioms bei der Ätiologie von Krankheiten besser zu verstehen. Stellen Sie die Käfige unter sterilen Bedingungen unter einer belüfteten Haube auf.

Die Kontrollen für dieses Experiment bestehen aus herkömmlichen Käfigen mit Einstreu und Laborgewebe zum Nisten, ansonsten fehlen jedoch Anreicherungsvorrichtungen. Um die Jungtieraufzucht oder umweltangereicherte Käfige einzurichten, verbinden Sie zwei große autoklavierte Käfige mit einem sterilisierten, mit Tüllen gesicherten Tunnel und fügen Sie in jedem Käfig eine sterilisierte Plattform ein, um die Stellfläche zu vergrößern. Für EE stellen Sie auch sterilisierte Laufräder, Tunnel, Iglus, Hütten, Krabbelbälle und Nistmaterial zur Verfügung.

Platzieren Sie sowohl den ausgestalteten als auch den Kontrollkäfig im selben Rack, um eine gleichmäßige Belüftung zu gewährleisten. Für die Zucht kombinieren Sie einen Bullen und zwei potentielle Mütter in normalen Käfigen. Überprüfen Sie jeden Morgen auf Vaginalpfropfen, die darauf hinweisen, dass sich das Tier in der Nacht gepaart hat.

Wenn kein Pfropfen zu sehen ist, kann der Widerstand gegen vaginale Sondierung einen internalisierten Pfropfen erkennen. Wenn ein Weibchen einen Vaginalpfropfen hat, bringen Sie es in einen großen Käfig für die Aufzucht von Jungen. Bis zu 12 trächtige Muttertiere können in den ökologisch angereicherten Käfigen mit Plattformen untergebracht werden, vorausgesetzt, dass sie alle in derselben Woche zur Welt kommen.

Wenn die Jungtiere 21 bis 28 Tage alt sind, verteilen Sie die Männchen und Weibchen nach Genotyp in Kontrollumgebungen oder angereicherte Umgebungen. Achten Sie darauf, dass ein Teil jedes Genotyps in jedem Käfig aufbewahrt wird. Nicht ausgestaltete Käfige können bis zu fünf Mäuse ernähren, während ausgestaltete Käfige mindestens 20 Mäuse für die soziale Stimulation benötigen und bis zu 41 Mäuse ernähren können.

Beginnen Sie ein oder zwei Tage vor dem Einschläfern der Mäuse mit dem Stuhlsammeln. Sammeln Sie immer zur gleichen Tageszeit. Um Kot von lebenden Tieren zu sammeln, schieben Sie das Tier vorsichtig über einen sauberen Käfig.

Anschließend wird der Stuhlgang mit einer sterilen Pinzette entnommen und in ein steriles Mikrofuge-Röhrchen überführt. Wenn ein Tier nicht sofort Kot absetzt, setzen Sie es in einen sauberen Käfig und warten Sie, bis das Tier seinen Kot abgesetzt hat, was bis zu einer Stunde dauern kann. Um Stuhl von einem eingeschläferten Tier zu sammeln, zerlegen Sie ihn, um Zugang zum Dickdarm zu erhalten.

Schneide dann den Doppelpunkt direkt unter dem Blinddarm ab und lege den Doppelpunkt auf ein Stück Filterpapier. Heben Sie dann mit einer Pinzette die Oberseite des Dickdarmschlauchs an und öffnen Sie das Lumen mit einer Schere. In Längsrichtung distal bis proximal schneiden, um den Dickdarm der Länge nach zu spreizen.

Sammeln Sie dann den Stuhl aus dem distalen Dickdarm mit einer sterilen Pinzette in ein steriles Mikrofugenröhrchen. Lagern Sie die Stuhlproben bei minus 80 Grad Celsius. Entnehmen Sie neben dem Stuhl weitere Gewebeproben aus dem Dickdarm und Dünndarm, Mikrosomen, Fettgewebe und so weiter.

Verwenden Sie ein kommerzielles Kit, um mikrobielle DNA aus dem Stuhl nach einem Protokoll zum Nachweis von Stuhlpathogenen zu isolieren. Dabei werden die Proben aus dem minus 80 Grad Celsius warmen Gefrierschrank auf Trockeneis umgefüllt und gewogen. Richten Sie als Nächstes eine PCR ein, die die mikrobielle DNA amplifiziert, wie im Textprotokoll beschrieben.

Anschließend reinigen Sie die Reaktionsprodukte mit Magnetkügelchen. Für die Reinigung zentrifugieren Sie zunächst kurz die Amplikon-PCR-Platte, um die Reaktionsprodukte zu poolen. Als nächstes werden die magnetischen Kügelchen verwirbelt, um sie gleichmäßig zu verteilen, und 20 Mikroliter-Aliquots in jede Reaktionsvertiefung übertragen.

Mischen Sie die Kügelchen gründlich mit der Lösung, indem Sie das gesamte Volumen langsam 10 Mal pipettieren. Lassen Sie die Kügelchen dann fünf Minuten lang ruhen. Legen Sie anschließend die PCR-Platte auf einen Magnetständer und warten Sie zwei Minuten, bis sich die Überstände nach dem magnetischen Sammeln der Kügelchen geklärt haben.

Entfernen und entsorgen Sie dann die Überstände. Füllen Sie als Nächstes, während die Platte noch auf dem Magneten sitzt, jede Vertiefung mit Perlen mit 200 Mikrolitern frischem 80%igem Ethanol und warten Sie 30 Sekunden. Entfernen Sie dann vorsichtig den Überstand.

Wiederholen Sie diesen Waschschritt einmal und lassen Sie die Kügelchen 10 Minuten an der Luft trocknen. Eluieren Sie nun die Reaktionsprodukte von den Kügelchen, indem Sie die Platte vom Magnetständer entfernen und 52,5 Mikroliter Tris in jede Vertiefung geben. Mischen Sie die Kügelchen vollständig in Lösung, indem Sie das gesamte Volumen langsam 10 Mal pipettieren.

Sammeln Sie dann die Kügelchen wie bisher auf dem Magnetständer und geben Sie 50 Mikroliter des Überstands auf eine saubere PCR-Platte. Decken Sie die Platte mit einem Klarsichtkleber ab und lagern Sie sie bis zu einer Woche bei minus 20 Grad Celsius. Verwenden Sie den gesammelten Überstand, um eine Index-PCR durchzuführen und Barcodes an die Adaptersequenz anzuhängen.

Reinigen Sie dann die Produkte und bereiten Sie die indizierte Bibliothek für die Sequenzierung vor. Bei Mäusen ist bekannt, dass die Anreicherung der Umgebung die Lebensdauer und die Heilung von Tumorwunden verbessert. Um die Rolle der Mikrobiota bei diesem Phänotyp zu definieren, wurden Zuchttiere für mindestens einen Monat in die Mauskolonie integriert, um die Mikrobiota zu normalisieren.

Dann wurden sie gezüchtet und ihre Nachkommen wurden in einer angereicherten Umgebung oder einer normalen Umgebung aufgezogen. Die Nachkommen waren ebenfalls tumortragend oder Wildtyp. Nach 16 Wochen wurden die Tiere eingeschläfert und Stuhlproben entnommen, um mikrobielle DNA zu isolieren.

Als nächstes wurde die PCR verwendet, um die ribosomale 16S-Untereinheit in den Proben zu amplifizieren, um die Mikrobiomkomponenten zu untersuchen. Anschließend wurden die Reaktionsprodukte mittels Barcode-Indexierung identifiziert. Interessanterweise verbessern verbesserte Umgebungen die Artenvielfalt bei Wildtyp-Tieren nicht, aber sie erhöhen die Artenvielfalt bei tumortragenden Tieren erheblich.

Dies zeigt die Empfindlichkeit der Methode. Diese Zunahme der Artenvielfalt wurde auf ein erhöhtes Vorkommen des Stammes von Proteobakterien mit signifikanten Zunahmen in den Klassen Alphaproteobakterien und Betaproteobakterien und einer Abnahme pathogener Gammaproteobakterien zurückgeführt. Die größte Zunahme der Betaproteobakterien war in der Gattung Sutterella zu verzeichnen, einem wahrscheinlichen Kommensal, der am sezernierten Abbau von Immunglobulin A beteiligt ist.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Haltungspraktiken ändern können, um das Mikrobiom zwischen Versuchstieren zu normalisieren, bevor Sie mit Ihren interessanten Eingriffen beginnen. Denken Sie bei der Durchführung dieses Verfahrens daran, dass die Tiere ihr Territorium in der Umwelt etabliert haben. Aus diesem Grund können Veränderungen der Umgebung Stress verursachen, der sich auf das Mikrobiom des Tieres auswirkt.

Eine plötzliche Verhaltensänderung des Tieres ist ein körperliches Zeichen von Stress. Nach diesem Verfahren können spezifische Mikroben isoliert und weiter charakterisiert werden, um die Hinlänglichkeit der identifizierten Mikrobe für das Fortschreiten der Krankheit zu testen.