Name: Zwei-Photon intravitalen Bildgebung der Leukozyten im Rahmen der Immunantwort in Lipopolysaccharid behandelt Maus Leber (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-06T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Lernen Sie die Zwei-Photon-Intravitalmikroskopie zur Beobachtung von Leukozyten in der Leber bei LPS-induzierter Endotoxämie. Diese Methode ermöglicht Echtzeit-Analysen der Immunantwort.

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Diese Studie wurde unterstützt durch einen Zuschuss von der National Research Foundation von Korea (NRF) gefördert durch die Regierung von Korea (MSIP, Grant Nr. 2016R1A2B4008199 Y-m. (H.), Ministerium für Gesundheit und Wohlfahrt, Republik Korea (gewähren Nummer: HI14C1324).

Alle Verfahren wurden gemäß den Richtlinien des institutionellen Animal Care und Nutzung Ausschuss der Yonsei University College of Medicine, Korea durchgeführt. LysM-grün fluoreszierenden Proteins (GFP; Gfp / +) Mäuse8 und CX3Cr1-GLP (GLP / +)9 Mäuse im Alter von 8 bis 12 Wochen für intravitalen Bildgebung verwendet wurden. Alle chirurgischen Instrumente wurden autoklaviert und mit 70 % Alkohol desinfiziert.
(1) speziell angefertigte Maus Leber Bildgebung Kammer mit Support-tools
<ol><li>Maus-Leber imaging-Kammer-Konstruktion<ol>
<li>Machen Sie eine Kammer der folgenden Größe für Maus Leber Bildgebung (Abbildung 1): innere Kammer (120 mm Länge × 160 mm Breite × 30 mm Höhe), Außenkammer (100 mm Länge × Breite 100 mm × 24 mm Höhe), Schrauben (Ф 3 mm × 30 mm Höhe), Nüssen (Ф 4 mm) , und Flügel-geformte Muttern (Ф 4 mm).</li>
		<li>Messen Sie die Aushärtung Agent und Elastomer Basis im Verhältnis 1:9 um insgesamt 120 g Silikon zu machen.</li>
		<li>Setzen Sie die Flüssigsilikon-Mischung in einem 250 mL Erlenmeyerkolben und vermischen Sie gut. Dann den Kolben in den Exsikkator gestellt und entfernen Sie Luftblasen für ca. 1 h unter Vakuum durch die Pumpe.</li>
		<li>Gießen Sie flüssiges Silikon-Mischung in eine speziell angefertigte Maus Kammer so hoch wie 10 mm Höhe und lassen Sie es Heilung für ein paar Tage (Abbildung 1A).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vorbereitung der Cover-Folien und die Leber Befestigung Bett<ol>
<li>Befestigen Sie an den Metallrahmen das Deckglas mit Silikonkleber. Für 1 Tag (Abbildung 1 b) trocknen lassen.</li>
		<li>Um das destillierte Wasser für das Wasser-Immersion-Objektiv effektiv zu halten, ist eine semipermanente Wasser blockierende Struktur unerlässlich. 1 mm Rundung Silikonkleber zu machen und über Nacht aushärten.</li>
		<li>Mischen Sie die Aushärtung Agent und Elastomer Basis und dann gießen Sie sie in eine 6-Well-Platte in einer Höhe von ca. 8-10 mm. Perform Aushärtung wie in 1.1.2-1.1.4 beschrieben.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Vorbereitung des LPS
<ol><li>Bereiten Sie steril 1 × Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), die LPS-Pulver von Salmonella Enterica Serotyp Enteritidis zu verdünnen. (1 × PBS: 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4).</li>
	<li>Heizen Sie PBS im Wasserbad bei 37 ° C vor, und öffnen Sie vorsichtig die LPS Pulver Flasche (25 mg).</li>
	<li>Mit eine Pipettieren Hilfe, Gießen Sie sterilen PBS (5 mL) in die LPS Pulver Flasche und umrühren Sie vorsichtig oder auszusetzen Sie, die Lösung um die Stammlösung vorbereiten. Hinweis: Nach LPS Pulver verflüssigt wird, kann harte vortexen Luftblasen verursachen. Verhindern Sie, dass Luftblasen um Verlust zu minimieren, wenn Aliquote in 1,5 mL Röhrchen.</li>
	<li>Speichern Sie der LPS-Stammlösung bei −20 ° C und in LPS Injektionslösung ein 1 mg/mL zu verdünnen.</li>
	<li>Injizieren Sie 1 mg/mL-LPS-Lösung (20 mg/kg) in das Peritoneum nicht narkotisierten Maus mit einer 1-mL-Spritze. Injizieren Sie für das Tier Kontrolle die gleiche Menge an PBS.</li>
	<li>Warten Sie, bis 2 h für ausreichende Entzündungsreaktion.</li>
</ol>3. Vorbereitung des Texas-rot Dextran, Blutgefäße zu beflecken
<ol><li>Bereiten Sie zwei konische Rohre 15 mL und 10 mL sterile PBS.</li>
	<li>Texas-rot Dextran Pulver (25 mg) in 3 mL PBS verdünnen und gut vermischen. Übertragen Sie die Mischung auf eine leere 15 mL konische Rohr.</li>
	<li>Übertragen Sie die restlichen PBS (7 mL) auf die 15 mL konische Röhrchen mit Dextran-Mischung (3 mL).</li>
	<li>Verbinden Sie einen 0,45 µm-Spritze-Filter an der Spitze einer 10 mL Spritze. Die Spritze sollte die Nadel Filterwechsel.</li>
	<li>Filtern Sie die Dextran-Mischung (10 mL). Drücken Sie die Spritze gleichmäßig um Verschütten zu vermeiden.</li>
	<li>500 µL 2,5 mg/mL Dextran-Lösung in das Licht blockiert 1,5-mL-Tube zu verzichten und bei −20 ° c lagern Einmal aufgetaut, Lagern Sie es bei 4° C.</li>
</ol>4. chirurgische Verfahren
<ol><li>Desinfizieren Sie den OP-Tisch und alle Instrumente, die mit 70 % Alkohol vor der Operation. Dann legen Sie die Werkzeuge für die Leberchirurgie und passen Sie die Heizplatte auf 37 ° C (Abb. 2A, B).</li>
	<li>Für die Anästhesie intraperitoneal Spritzen Sie die Mäuse mit 30 mg/kg Tiletamin/Zolazepam und 10 mg/kg Xylazin. Diese Lösungen können gemischt und verdünnt mit PBS-Puffer für die gleichzeitige Injektion. Bestätigen Sie Anesthetization durch leichtes Drücken der Zehe der Maus.  Gehen Sie als nächstes, wenn es keine Reflex gibt.</li>
	<li>Tragen Sie kleine Menge Augensalbe, die Trockenheit der Maus der Netzhaut zu verhindern.</li>
	<li>Entfernen von Körperbehaarung rund um den Bauchbereich mit Enthaarungscreme (Abbildung 2).</li>
	<li>200 µL Texas Red Dextran-Lösung (Konzentration von 2,5 mg/mL) über das Heck Vene oder Retro-Orbital-Injektion mit einer Insulin-Spritze (Abb. 2D) zu injizieren.</li>
	<li>Markieren Sie den rechts subcostal Bereich mit einem Marker. Die Linie sollte vom Xiphoid bis zum Ende der Rippe gezeichnet. Schneiden Sie die Epidermis mit Zange und Schere (Abbildung 2E, F).</li>
	<li>Öffnen der Bauchhöhle mit Mikro-Schere und Zange, und setzen die Leber vorsichtig. Der linke seitliche Lappen sollte mit Wattestäbchen (Abbildung 2, H) ausgerollt werden.</li>
	<li>Gießen Sie 500 µL steriler PBS auf die Bauchhöhle, Trockenheit der Leber zu verhindern.</li>
	<li>Platzieren Sie den Mauszeiger in der rechts-Dekubitus-Position in eine speziell angefertigte Kammer, und wenden Sie eine kleine Menge von Gewebekleber auf dem Silizium-Bett an. Dann befestigen Sie vorsichtig die Leber mit Wattestäbchen (Abbildung 2I). Hinweis: Da das Lebergewebe extrem brüchig ist, nicht mechanisch herausziehen der Leberzellkrebs. Rollen sie mit Wattestäbchen sanft aus.</li>
	<li>Wenige Sekunden später, nass die Leber wieder mit 500 µL steriler PBS, Austrocknung von der Leber zu vermeiden. Den Metallrahmen auf die Leber und befestigen Sie es fest mit Nüssen (Abbildung 2J).</li>
</ol>5. intravitalen Bildgebung der Leber mit zwei-Photonen-Mikroskopie
<ol><li>Führen Sie ZEN Software (Carl Zeiss), schalten Sie den Laser, setzen die Wellenlänge 880 nm, und grün, und rot-Kanäle. Stellen Sie Laserleistung nach Fluoreszenzintensität (Abb. 3A). Emission Filterinformationen lautet wie folgt: grün/Alexa488, 500-550 nm und rot/Alexa 555, 575-610 nm.</li>
	<li>Die Kammer auf der bildgebenden Bühne legen Sie und 20 X eintauchen in Wasser Objektiv in der Nähe das Deckglas.</li>
	<li>Befestigen Sie die Silikon Kautschuk Heizung unter der Maus Körper, seine Körpertemperatur (Abb. 3 b).</li>
	<li>Drop 500 µL destilliertes Wasser auf den Metallrahmen, und ziehen Sie dann das Objektiv in der Nähe der Leber (Abbildung 3).</li>
	<li>Stellen Sie den Fokus und bestimmen Sie die Tiefe und die imaging-Bereich zu.</li>
	<li>Führen Sie Bildgebung.</li>
	<li>Injizieren Sie für die langfristige Bildgebung halbe Dosis von Tiletamin/Zolazepam und Xylazin-Gemisch pro Stunde während der Bildgebung. Aufrechterhaltung der Körpertemperatur der Mäuse bei 37 ° C ist in dieser Phase wichtig. Halten Sie immer auf Auge an der Maus seit Anesthetization Zeit von jeder Maus unterscheidet. Hinweis: Diese Methode eignet sich nicht für die Erholung nach der Operation und Bildgebung. Wir opfern ethisch die Maus unmittelbar nach der Operation.</li>
	<li>Überprüfen Sie das Pedal Reflexe für alle 30 min für stabile Anesthetization.</li>
</ol>(6) Datenanalyse
<ol><li>Öffnen Sie die Daten-Analyse-Software Volocity und dann importieren Sie die Rohdaten in der Bibliothek in die Software.</li>
	<li>Entfernen Sie Rauschen aus dem Bild die Situation zu entsprechen und eine Momentaufnahme. Hinweis: Um glatte Bilder zu erhalten, verwenden Sie den "Fine" oder "Median" Filter. Darüber hinaus verwenden Sie die "Kontrastverstärkung"-Funktion, um dunkle oder unscharfe Bilder klarer zu machen.</li>
	<li>Passen Sie die bearbeiteten Artikel zu 100 % und Export als JPEG oder TIFF-Dateien für Schnappschüsse und AVI-Dateien für Filme.</li>
</ol>

<ol><li>Girard, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fuels%2C+hormones%2C+and+liver+metabolism+at+term+and+during+the+early+postnatal+period+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Fuels, hormones, and liver metabolism at term and during the early postnatal period in the rat.</a> J Clin Invest. 52 (12), 3190-3200 (1973).</li>
<li>Marques, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+liver+biology+in+vivo+using+conventional+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Imaging liver biology in vivo using conventional confocal microscopy.</a> Nat Protoc. 10 (2), 258-268 (2015).</li>
<li>Dasari, S., Weber, P., Makhloufi, C., Lopez, E., Forestier, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+Microscopy+Imaging+of+the+Liver+following+Leishmania+Infection%3A+An+Assessment+of+Hepatic+Hemodynamics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics.</a> J Vis Exp. (101), e52303(2015).</li>
<li>Honda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+neutrophil+recruitment+in+hepatic+ischemia-reperfusion+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of neutrophil recruitment in hepatic ischemia-reperfusion injury in mice.</a> Transplantation. 95 (4), 551-558 (2013).</li>
<li>Jenne, C. N., Wong, C. H., Petri, B., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+spinning-disk+confocal+microscopy+for+the+intravital+analysis+of+platelet+dynamics+in+response+to+systemic+and+local+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The use of spinning-disk confocal microscopy for the intravital analysis of platelet dynamics in response to systemic and local inflammation.</a> PLoS One. 6 (9), e25109(2011).</li>
<li>Ritsma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+through+an+abdominal+imaging+window+reveals+a+pre-micrometastasis+stage+during+liver+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis.</a> Sci Transl Med. 4 (158), 158ra145(2012).</li>
<li>Sierro, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Liver+Capsular+Network+of+Monocyte-Derived+Macrophages+Restricts+Hepatic+Dissemination+of+Intraperitoneal+Bacteria+by+Neutrophil+Recruitment%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">A Liver Capsular Network of Monocyte-Derived Macrophages Restricts Hepatic Dissemination of Intraperitoneal Bacteria by Neutrophil Recruitment.</a> Immunity. 47 (2), 374-388 (2017).</li>
<li>Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertion+of+enhanced+green+fluorescent+protein+into+the+lysozyme+gene+creates+mice+with+green+fluorescent+granulocytes+and+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages.</a> Blood. 96 (2), 719-726 (2000).</li>
<li>Jung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+fractalkine+receptor+CX%283%29CR1+function+by+targeted+deletion+and+green+fluorescent+protein+reporter+gene+insertion%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion.</a> Mol Cell Biol. 20 (11), 4106-4114 (2000).</li>
<li>Heymann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+term+intravital+multiphoton+microscopy+imaging+of+immune+cells+in+healthy+and+diseased+liver+using+CXCR6.Gfp+reporter+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Long term intravital multiphoton microscopy imaging of immune cells in healthy and diseased liver using CXCR6.Gfp reporter mice.</a> J Vis Exp. (97), (2015).</li>
</ol>

Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Die Leber wurde aktiv von vielen Gruppen3,10, aufgrund der Bedeutung ihrer Funktion untersucht. Zum Beispiel schlug Heymann Et Al. eine empfindliche Methode mit Agarose. Obwohl diese Methode erwies sich hochpräzise, dauert die Agarose-Einstellung. Jedoch konnte alle Verfahren mit unserer Methodik innerhalb von 30 min, andere Störfaktoren zu minimieren durchgeführt. Zweitens ist die Stabilisierung der Leberzellkrebs äußerst wichtig, weil der Herzschlag der Video s...

Die Leber ist der großen Stoffwechselorgan bei Säugetieren; Es fungiert als ein Kontrollturm für Energie, Hormone und Entgiftung1. Aufgrund seiner Bedeutung haben Forscher um die Veränderungen in der Leber während einer Entzündung zu erhellen viele in Vitro und in Vivo Experimente durchgeführt. Intravitalen Mikroskopie wurde verwendet, um live-Bilder aus der Leber2 zu erfassen. In der Tat führte verschiedene Leber bildgebende Verfahren wurden2,3,4,5,6. Jedoch um einen vereinfachten chirurgischen Ansatz entwickeln und Stabilisierung der das Zielorgan und die Immunzellen, gestalteten wir ein einfaches Protokoll, das Forscher um minimieren Sie ihren Aufwand für die intravitalen Bildgebung führen können.
In dieser Studie führten wir eine stabile und neuartige bildgebende Kammer und chirurgische Technik, die verwendet werden könnte, um Blutungen und mögliche Infektionen zu minimieren. Wir bestätigen, dass die Leber für mehr als 2 h intakt geblieben. Mit dieser Methode haben wir erfolgreich Morphologien LCMs7 und Neutrophilen unter septischen Zustand identifiziert. Da diese Methode physikalische und biologische Störfaktoren wie Zittern und unerwartete Entzündung während chirurgischen Eingriffs minimiert wird, erwarten wir, dass diese Methode verwendet werden könnte, um akute Reaktionen der immunen Zellen in der Leber als Reaktion auf zu beobachten Reagenzien wie LPS.

<table><tbody><tr><td>Kundenspezifische Kammer</td><td>Lebendzelleninstrumente</td><td></td><td>Kundenspezifische Größe</td></tr><tr><td>Metallabdeckschieber</td><td>Lebendzelleninstrumente</td><td></td><td>Sonderanfertigungen Größe</td></tr><tr><td>Deckglas</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>#72204-03</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 Silikonelastomer-Kit</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Erlenmeyerkolben</td><td>DURAN</td><td>21 216 36</td><td></td></tr><tr><td>Zellkulturplatte (flacher Typ)</td><td>HYUNDAI Micro Co.</td><td>H31006</td><td></td></tr><tr><td>Exsikkator</td><td>ADARSH</td><td>55204</td><td></td></tr><tr><td>High Q BOND SE 5 mL</td><td>BJM LAB</td><td></td><td>Zur Herstellung eines semi-permanenten Damms</td></tr><tr><td>Flexible Silikonkautschuk-Heizelemente</td><td>Omega</td><td>SRFR/SRFG SERIES, M1250/0800</td><td></td></tr><tr><td>DC Netzteil</td><td>Toyotech</td><td>DP30-03A</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td></td><td></td><td>Hausgemacht</td></tr><tr><td>Lipopolysaccharide (LPS) aus Salmonella enteria Serotyp enteritidis</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6011</td><td></td></tr><tr><td>Texas Red Dextran</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1830</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Konisches Röhrchen aus Polypropylen </td><td>FALCON</td><td>14-959-49B</td><td></td></tr><tr><td>0,45 &mu; m Filter (Minisart Spritzenfilter)</td><td>Sartorius</td><td>16555k</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Mikroröhrchen, Amber</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-X</td><td>Für lichtblockierende</td></tr><tr><td>1 mL Spritze</td><td>Korea Vaccine</td><td>KV-S01</td><td></td></tr><tr><td>3 mL Spritze</td><td>Korea Vaccine</td><td>KV-S03</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Spritze</td><td>Korea Vaccine</td><td>KV-S10</td><td></td></tr><tr><td>0,3 mL Insulinspritze</td><td>Becton Dickinson</td><td>324900</td><td></td></tr><tr><td>Haarentfernungscreme 100 mL</td><td>Body natur</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wattestäbchen</td><td>ABDI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zoletil 50 5 mL</td><td>Virbac</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rompun 10 mL</td><td>Bayer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heizplatte</td><td>Live Cell Instruments</td><td>PH-S-10</td><td>DC-Controller in kundenspezifischer Größe</td></tr><tr><td></td><td>Live Cell Instruments</td><td>CU-301</td><td></td></tr><tr><td>Mikrodessektionsschere</td><td>Harvard Apparatur</td><td>72-5418</td><td></td></tr><tr><td>Schere</td><td>Roboz</td><td>RS-5882</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Roboz</td><td>RS-5137</td><td></td></tr><tr><td>Vet bond</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>ZEN software (Black Edition)</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Programm für LSM 7 MP</td></tr><tr><td>LSM 7 MP</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Volocity</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>Analyseprogramm</td></tr></tbody></table>

zwei-photon intravitalen bildgebung der leukozyten im rahmen der immunantwort in lipopolysaccharid behandelt maus leber

Two-photon Intravital Imaging of Leukocytes During the Immune Response in Lipopolysaccharide-treated Mouse Liver

Sepsis ist eine schwere Infektion, die Organversagen und Gewebe verursachen kann Schaden. Obwohl die Mortalität und Morbidität Preise im Zusammenhang mit Sepsis sind extrem hoch, keine direkte Behandlung oder im Zusammenhang mit der Orgel Mechanismus wurde ausführlich in Echtzeit geprüft. Die Leber ist das zentrale Organ, das Gifte und Infektionen im menschlichen Körper steuert. Hier wollten wir intravitalen Bildgebung der Maus Leber nach Induktion der Endotoxämie durchführen, um die Beweglichkeit der Immunzellen, wie Neutrophilen und Leber Kapsel Makrophagen (LCMs) verfolgen. Dementsprechend haben wir eine neuartige Operationsmethode für die Exposition der Leber mit minimal-invasiven Chirurgie entwickelt. Mäuse wurden mit Lipopolysaccharid (LPS), eine gemeinsame Endotoxin intraperitoneal injiziert. Mit unserer neuen chirurgischen Ansatz für Belichtung und intravitalen Bildgebung der Leber, wir fanden, dass die Neutrophilen Maus Rekrutierung in LPS behandelten LysM-grün fluoreszierenden Proteins (GFP) wurde Maus Leber erhöht im Vergleich mit dem in Phosphat-gepuffert Leber mit Kochsalzlösung behandelt. Nach LPS-Behandlung stieg die Zahl der Neutrophilen deutlich mit der Zeit. Darüber hinaus visualisiert mit Hilfe von CX3Cr1-GFP-Mäusen, wir erfolgreich Leber residente Makrophagen genannt LCMs. Daher kann um die Wirksamkeit der neuen Reagenzien zur Steuerung immun Mobilität in Vivozu untersuchen, Bestimmung der Motilität und Morphologie der Neutrophilen und LCMs in der Leber wir therapeutische Wirkung im Organ Versagen und Gewebe Schäden durch identifizieren können Leukozyten-Aktivierung bei Sepsis.

Eine einfache und sehr stabile bildgebende Kammer wurde entwickelt. Der Boden der Kammer wurde mit Silikon, die verhindert Verrutschen der Maus Körper und Organe abgedeckt. Zusätzlich, da Silizium die richtige Menge an Elastizität aufweist, könnte dies induziert durch den Druck der Abdeckung Folie (Abbildung 1A, C) zu erwartenden Schaden verhindern. Zweite, Gewebe-Safe Kleber (Vet-Anleihe) wurde angewandt, um die extrahierten Leber auf dem kr...

Wir haben eine neuartige chirurgische Protokoll für die zwei-Photonen-Bildgebung live Mäuse Leber mit minimaler Invasion. Mit dieser Technik haben wir die detaillierte Struktur der Leber während Lipopolysaccharid-induzierte Endotoxämie identifiziert. Wir erwarten, dass diese Methode verwendet werden, kann um die Wirksamkeit der verschiedenen Reagenzien Behandlung zur hepatischen Leukozyte Migration zu bestimmen.

Zwei-Photon intravitalen Bildgebung der Leukozyten im Rahmen der Immunantwort in Lipopolysaccharid behandelt Maus Leber

Sepsis is a type of severe infection that can cause organ failure and tissue damage. Although the mortality and morbidity rates associated with sepsis are ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Morphologie und Funktionalität der Leukozyten in der Leber während des septischen Schocks zu beobachten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Sie direkte Videos von Leukozyten in der Leber erhalten können. Verwenden Sie vor der Operation 70% Ethanol, um den OP-Tisch und alle Instrumente zu desinfizieren.Richten Sie dann die Werkzeuge für die Leberchirurgie ein und stellen Sie die Heizplatte auf 37 Grad Celsius ein. Nach der Betäubung von LPS- oder PBS-injizierten Mäusen gemäß dem Textprotokoll tragen Sie eine kleine Menge Augensalbe auf, um ein Austrocknen der Netzhaut zu verhindern. Verwenden Sie einen Rasierer und eine Haarentfernungscreme, um die Haare um den Bauch herum zu entfernen.Verwenden Sie dann feuchte Gaze, um den Bauch zu reinigen. Während einer retroorbitalen Injektion mit einer Insulinspritze injizieren Sie 200 Mikroliter Texas Red Dextran-Lösung. Markieren Sie mit einem Marker den rechten subkostalen Bereich vom Xyphoidfortsatz bis zum Ende der Rippe.Tragen Sie dann Povidon-Jod auf den Bauch der Maus auf, um eine Sekundärinfektion zu verhindern. Benutze eine Pinzette und eine Schere, um die Epidermis zu durchtrennen. Öffnen Sie anschließend mit einer Mikroschere und einer Pinzette die Bauchhöhle und legen Sie die Leber vorsichtig frei.Verwende Wattestäbchen, um den linken Seitenlappen auszurollen. Gießen Sie dann 500 Mikroliter steriles PBS auf die Bauchhöhle, um ein Austrocknen der Leber zu verhindern. Platzieren Sie die Maus in der richtigen Dekubitis-Position in einer speziell entwickelten Kammer und tragen Sie eine kleine Menge Gewebekleber auf das Silikonbett auf.Verwenden Sie dann Wattestäbchen, um die Leber vorsichtig zu befestigen. Lebergewebe ist extrem brüchig. Verwenden Sie niemals scharfe oder schwere Werkzeuge, wenn Sie die Leber freilegen und halten.Befeuchten Sie die Leber einige Sekunden später erneut mit 500 Mikrolitern sterilem PBS, um ein Austrocknen zu verhindern. Setze dann den Metallrahmen auf die Leber und fixiere ihn mit Muttern. Setzen Sie immer Stützmuttern ein, bevor Sie den Metallrahmen platzieren.Dies trägt dazu bei, den Druck des Metallrahmens zu reduzieren. Um eine intravitale Bildgebung der Leber durchzuführen, führen Sie die Zen-Software aus, um den Laser einzuschalten. Stellen Sie die Wellenlänge auf 880 Nanometer ein und stellen Sie den grünen und roten Kanal ein.Passen Sie dann die Laserleistung entsprechend der Fluoreszenzintensität an. Platzieren Sie die Kammer auf dem Bildgebungstisch und positionieren Sie das Wasserimmersionsobjektiv mit 20 Potenzen in der Nähe des Deckglases. Befestigen Sie die Silikonkautschukheizung unter dem Mauskörper, um die Körpertemperatur zu halten.Ziehen Sie als nächstes 500 Mikroliter destilliertes Wasser auf den Metallrahmen. Positionieren Sie dann die Objektivlinse nahe an der Leber. Passen Sie den Fokus an und bestimmen Sie die Tiefe und Zeit des Bildbereichs.Für die Langzeitbildgebung injizieren Sie aus ethischen Gründen für jede Stunde während der Bildgebung eine halbe Dosis der zuvor vorbereiteten Anästhesiemischung aus Zoletil und Rompun. Halten Sie die Körpertemperatur bei 37 Grad Celsius und behalten Sie die Maus immer im Auge, da die Narkosezeiten bei jeder Maus unterschiedlich sind. Um die Daten zu analysieren, öffnen Sie Velocity und importieren Sie die Rohdaten aus der Bibliothek.Entfernen Sie dann das Rauschen aus dem Bild und machen Sie einen Schnappschuss. Passen Sie die bearbeiteten Elemente schließlich auf 100% an und exportieren Sie die Dateien als JPEG- oder TIF-Dateien für Schnappschüsse und AVI-Dateien für Filme. Die intravitale bildgebende Analyse von Kontrollmäusen zeigte, dass eine kleine Anzahl von Neutrophilen im Blutgefäß zirkulierte.Während die Anzahl der Neutrophilen bei LPS-behandelten Mäusen signifikant erhöht war. Im LPS-Zustand zirkulierten viele Neutrophile im Blutkreislauf, aber sie wanderten nicht außerhalb des Gefäßes. Wie in diesen Filmen zu sehen ist, waren Neutrophile bei den mit LPS behandelten Mäusen im Vergleich zu Kontrollmäusen fester an der luminalen Oberfläche des Gefäßes haftet, wodurch Neutrophile häufiger im Gefäß nachgewiesen wurden.Abgesehen von der Motilität von Neutrophilen wurden Leberkapselmakrophagen (LCMs) bei CX3CR1-GFP-Mäusen auf der Oberfläche des Lebergewebes und nicht tief im Gewebe beobachtet. Darüber hinaus zeigten LCMs selbst bei LPS-behandelten Mäusen nur geringe Bewegung oder Aktivierung in der Leber. Einmal gemeistert, kann diese Technik in 30 Minuten durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, die Schnittlinie vom Xiphoid-Prozess bis zum Ende des rechten Subkostalbauchs zu setzen. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie die Injektion von Behandlungen durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. wie sich die Leber von Schäden und Infektionen erholt. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik Forschern aus der Medizin den Weg, die Reaktion der Leukozyten während der Sepsis zu erforschen und mögliche Medikamente zu testen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine Leber mit minimalem Bauchschnitt freilegt. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Lipopolysacchariden äußerst gefährlich sein kann und bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie Sterilisation und Händewaschen getroffen werden sollten.

two-photon-intravital-imaging-leukocytes-during-immune-response

Research

Forschung

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Wir beschreiben ein Protokoll zur Überwachung des Verhaltens von Neutrophilen und Monozyten in Mesenterialvenen unter stationären und entzündlichen Bedingungen mittels intravitaler konfokaler Mikroskopie an anästhesierten Mäusen.

Abbilden Neutrophilen und Monozyten in Mesenterialvenen von Intravitalmikroskopie an narkotisierten Ratten in Echtzeit

Hier beschreiben wir einen Lichtbogen-Mikroskop-Ansatz, um das Herz-CD45 + -Leukozyten-Infiltrat in einem murinen Modell der aseptischen fulminanten Myokarditis zu visualisieren, das durch die intratracheale Diphtherie-Toxin-Behandlung von CD11.DTR-Mäusen induziert wird.

Quantitative Visualisierung von Leukozyten-Infiltrat in einem Murin-Modell der Fulminant-Myokarditis durch Licht-Blatt-Mikroskopie

Wir beschreiben beide in vitro und in vivo Infektion-Assays, die verwendet werden können, um die Aktivitäten des Host-Codierung Faktoren zu analysieren.

Verwenden eine bakterielle Erreger, Sonde für zelluläre und organismische Ebene Host Antworten

Wir beschreiben eine Methode zur Visualisierung von GFP-markierten IELs mit intravitaler Bildgebung des murinen Dünndarms durch invertierte Konfokalmikroskopie der Spinnscheibe. Diese Technik ermöglicht die Verfolgung von lebenden Zellen innerhalb der Schleimhaut für bis zu 4 h und kann verwendet werden, um eine Vielzahl von darmen immun-epitheliale Wechselwirkungen zu untersuchen.

Intravitale Bildgebung von intraepitheliale Lymphozyten im murinen Dünndarm

Hier stellen wir ein Protokoll vor, mit dem die transplantierte linke Lunge der Maus mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie intravital abgebildet werden kann. Dies stellt ein wertvolles Werkzeug dar, um die zelluläre Dynamik und Wechselwirkungen in Echtzeit nach einer Lungentransplantation von Mäusen zu untersuchen.

Intravitale Zwei-Photonen-Mikroskopie der transplantierten Mauslunge

Lernen Sie die Zwei-Photon-Intravitalmikroskopie zur Beobachtung von Leukozyten in der Leber bei LPS-induzierter Endotoxämie. Diese Methode ermöglicht Echtzeit-Analysen der Immunantwort.

Zwei-Photon intravitalen Bildgebung der Leukozyten im Rahmen der Immunantwort in Lipopolysaccharid behandelt Maus Leber

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