Zwei-Photon intravitalen Bildgebung der Leukozyten im Rahmen der Immunantwort in Lipopolysaccharid behandelt Maus Leber

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Morphologie und Funktionalität der Leukozyten in der Leber während des septischen Schocks zu beobachten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Sie direkte Videos von Leukozyten in der Leber erhalten können. Verwenden Sie vor der Operation 70% Ethanol, um den OP-Tisch und alle Instrumente zu desinfizieren.

Richten Sie dann die Werkzeuge für die Leberchirurgie ein und stellen Sie die Heizplatte auf 37 Grad Celsius ein. Nach der Betäubung von LPS- oder PBS-injizierten Mäusen gemäß dem Textprotokoll tragen Sie eine kleine Menge Augensalbe auf, um ein Austrocknen der Netzhaut zu verhindern. Verwenden Sie einen Rasierer und eine Haarentfernungscreme, um die Haare um den Bauch herum zu entfernen.

Verwenden Sie dann feuchte Gaze, um den Bauch zu reinigen. Während einer retroorbitalen Injektion mit einer Insulinspritze injizieren Sie 200 Mikroliter Texas Red Dextran-Lösung. Markieren Sie mit einem Marker den rechten subkostalen Bereich vom Xyphoidfortsatz bis zum Ende der Rippe.

Tragen Sie dann Povidon-Jod auf den Bauch der Maus auf, um eine Sekundärinfektion zu verhindern. Benutze eine Pinzette und eine Schere, um die Epidermis zu durchtrennen. Öffnen Sie anschließend mit einer Mikroschere und einer Pinzette die Bauchhöhle und legen Sie die Leber vorsichtig frei.

Verwende Wattestäbchen, um den linken Seitenlappen auszurollen. Gießen Sie dann 500 Mikroliter steriles PBS auf die Bauchhöhle, um ein Austrocknen der Leber zu verhindern. Platzieren Sie die Maus in der richtigen Dekubitis-Position in einer speziell entwickelten Kammer und tragen Sie eine kleine Menge Gewebekleber auf das Silikonbett auf.

Verwenden Sie dann Wattestäbchen, um die Leber vorsichtig zu befestigen. Lebergewebe ist extrem brüchig. Verwenden Sie niemals scharfe oder schwere Werkzeuge, wenn Sie die Leber freilegen und halten.

Befeuchten Sie die Leber einige Sekunden später erneut mit 500 Mikrolitern sterilem PBS, um ein Austrocknen zu verhindern. Setze dann den Metallrahmen auf die Leber und fixiere ihn mit Muttern. Setzen Sie immer Stützmuttern ein, bevor Sie den Metallrahmen platzieren.

Dies trägt dazu bei, den Druck des Metallrahmens zu reduzieren. Um eine intravitale Bildgebung der Leber durchzuführen, führen Sie die Zen-Software aus, um den Laser einzuschalten. Stellen Sie die Wellenlänge auf 880 Nanometer ein und stellen Sie den grünen und roten Kanal ein.

Passen Sie dann die Laserleistung entsprechend der Fluoreszenzintensität an. Platzieren Sie die Kammer auf dem Bildgebungstisch und positionieren Sie das Wasserimmersionsobjektiv mit 20 Potenzen in der Nähe des Deckglases. Befestigen Sie die Silikonkautschukheizung unter dem Mauskörper, um die Körpertemperatur zu halten.

Ziehen Sie als nächstes 500 Mikroliter destilliertes Wasser auf den Metallrahmen. Positionieren Sie dann die Objektivlinse nahe an der Leber. Passen Sie den Fokus an und bestimmen Sie die Tiefe und Zeit des Bildbereichs.

Für die Langzeitbildgebung injizieren Sie aus ethischen Gründen für jede Stunde während der Bildgebung eine halbe Dosis der zuvor vorbereiteten Anästhesiemischung aus Zoletil und Rompun. Halten Sie die Körpertemperatur bei 37 Grad Celsius und behalten Sie die Maus immer im Auge, da die Narkosezeiten bei jeder Maus unterschiedlich sind. Um die Daten zu analysieren, öffnen Sie Velocity und importieren Sie die Rohdaten aus der Bibliothek.

Entfernen Sie dann das Rauschen aus dem Bild und machen Sie einen Schnappschuss. Passen Sie die bearbeiteten Elemente schließlich auf 100% an und exportieren Sie die Dateien als JPEG- oder TIF-Dateien für Schnappschüsse und AVI-Dateien für Filme. Die intravitale bildgebende Analyse von Kontrollmäusen zeigte, dass eine kleine Anzahl von Neutrophilen im Blutgefäß zirkulierte.

Während die Anzahl der Neutrophilen bei LPS-behandelten Mäusen signifikant erhöht war. Im LPS-Zustand zirkulierten viele Neutrophile im Blutkreislauf, aber sie wanderten nicht außerhalb des Gefäßes. Wie in diesen Filmen zu sehen ist, waren Neutrophile bei den mit LPS behandelten Mäusen im Vergleich zu Kontrollmäusen fester an der luminalen Oberfläche des Gefäßes haftet, wodurch Neutrophile häufiger im Gefäß nachgewiesen wurden.

Abgesehen von der Motilität von Neutrophilen wurden Leberkapselmakrophagen (LCMs) bei CX3CR1-GFP-Mäusen auf der Oberfläche des Lebergewebes und nicht tief im Gewebe beobachtet. Darüber hinaus zeigten LCMs selbst bei LPS-behandelten Mäusen nur geringe Bewegung oder Aktivierung in der Leber. Einmal gemeistert, kann diese Technik in 30 Minuten durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, die Schnittlinie vom Xiphoid-Prozess bis zum Ende des rechten Subkostalbauchs zu setzen. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie die Injektion von Behandlungen durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. wie sich die Leber von Schäden und Infektionen erholt. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik Forschern aus der Medizin den Weg, die Reaktion der Leukozyten während der Sepsis zu erforschen und mögliche Medikamente zu testen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine Leber mit minimalem Bauchschnitt freilegt. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Lipopolysacchariden äußerst gefährlich sein kann und bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie Sterilisation und Händewaschen getroffen werden sollten.