Menschen mit induzierten pluripotenten Stammzellen gewonnenen Hepatozyten-ähnliche Zellen für die Wirkstoffforschung

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, humane induzierte pluripotente Stammzellen in hepatozytenähnliche Zellen zu differenzieren, und zwar auf eine Weise, die für das Hochdurchsatz-Screening geeignet ist. Leberzellen sind im Labor schwer zu züchten, können jedoch aus induzierten pluripotenten Stammzellen erzeugt werden, was eine Screening-Plattform zur Identifizierung von Behandlungen für Lebererkrankungen bietet. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass von jedem Patienten mit Lebererkrankung eine unbegrenzte Anzahl von Hepatozyten erzeugt werden kann, die die Krankheit im Labor rekapitulieren.

Das Verfahren ist relativ einfach zu etablieren, auch ohne umfangreiche Kenntnisse in der Stammzellbiologie. Seine Reproduzierbarkeit ermöglicht es Forschern, Tausende von Verbindungen zu screenen, ohne dass komplexe Robotik erforderlich ist. Ray Liu, ein Postdoktorand, und Paige Lamprecht, eine Doktorandin, werden heute das Verfahren demonstrieren.

Verdünnen Sie zunächst das Fusionsprotein Ecad auf 15 Mikrogramm pro Milliliter mit Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS), die Kalzium und Magnesium enthält. 100-Millimeter-Suspensions-Gewebekulturschalen mit fünf Millilitern verdünnter Matrix beschichten und mindestens eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Entfernen Sie nach der Inkubation das Substrat und ersetzen Sie es durch fünf Milliliter iPSC-Kulturmedium.

Entnehmen Sie ein Fläschchen mit kryokonservierten humanen induzierten pluripotenten Stammzellen aus flüssigem Stickstoff. Tauen Sie bei 37 Grad Celsius auf, bis ein kleiner Eiskristall übrig bleibt. Pipettieren Sie die Zellen dann vorsichtig in ein steriles konisches 15-Milliliter-Röhrchen, das vier Milliliter des Kulturmediums enthält.

Die Zellen werden fünf Minuten lang bei 300 g zentrifugiert. Entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellen vorsichtig mit fünf Millilitern Medium, das mit zehn Mikromolaren Y-27632 ergänzt wird, einem selektiven Inhibitor einer Rho-assoziierten, Coiled-Coil-haltigen Proteinkinase. Nehmen Sie nun das Nährmedium aus den Ecad-beschichteten Zehn-Millimeter-Suspensions-Gewebekulturschalen und fügen Sie fünf Milliliter der Zellen hinzu.

Sobald die iPS-Zellen eine Konfluenz von etwa 80 % erreicht haben, entfernen Sie das Kulturmedium und waschen Sie es einmal mit kalzium- und magnesiumfreiem DPBS. Aspirieren Sie das DPBS und fügen Sie eine ausreichende Menge 0,02%iger EDTA-Lösung hinzu, um das Geschirr abzudecken. Inkubieren Sie die Zellen dann bis zu drei Minuten lang bei Raumtemperatur.

Sobald die Zellen zu lösen beginnen, entfernen Sie die 0,02%ige EDTA-Lösung und fluten Sie die Schale mit zehn Millilitern M-Medium, um die Zellen freizusetzen. Unterstützen Sie die Ablösung von iPS-Zellen durch schonendes Pipettieren. 1/10 der suspendierten Zellen wird in eine frische, mit Ecad beschichtete Gewebekulturschale mit fünf Millilitern M-Medium übertragen.

Inkubieren Sie die Kulturen bei 37 Grad Celsius unter 4 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid und wechseln Sie das Medium täglich. Entnehmen Sie ein Fläschchen mit 250 Mikrolitern eiskaltem Matrixmaterial mit einer Konzentration von zwei Milligramm pro Milliliter und tauen Sie es auf Eis auf. Kombinieren Sie anschließend die aufgetaute Matrix mit zehn Millilitern kaltem DMEM/F12, indem Sie vorsichtig mit einer vorgekühlten Pipette mischen, um eine Endkonzentration von 0,05 Milligramm pro Milliliter zu erreichen.

Übertragen Sie 100 Mikroliter der verdünnten Matrix in jede Vertiefung einer 96-Well-Gewebekulturplatte. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius unter 4 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid für mindestens eine Stunde. Nach der Inkubation verwerfen Sie die Matrix und ersetzen Sie sie durch 50 Mikroliter M Medium pro Vertiefung, wobei das gleiche Beschichtungsverfahren mit den restlichen Platten wiederholt wird.

Kultivieren Sie nun die iPS-Zellen auf 100-Millimeter-Schalen, bis sich die Zellen einer Konfluenz von 80 % nähern. Um die iPSCs von jeder 100-Millimeter-Platte zu gewinnen, aspirieren Sie das Kulturmedium und spülen Sie es mit fünf Millilitern DPBS aus. Ersetzen Sie die Spülung durch drei Milliliter Zellablösungslösung, wie z. B. Accutase.

Dann etwa zwei Minuten lang bei 37 Grad Celsius unter 4 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid inkubieren. Sobald sich die Zellen abzulösen beginnen, ernten Sie, indem Sie sieben Milliliter M-Medium hinzufügen. Pipettieren Sie mehrmals, um die Zellkolonien in kleine Cluster von etwa drei bis sechs Zellen zu dissoziieren.

Anschließend werden die iPS-Zellen in ein steriles 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen gegeben und fünf Minuten lang bei 300 g zentrifugiert. Wenn Sie fertig sind, entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Zellpellet wieder in fünf Millilitern M-Medium. Verteilen Sie die Zellen gleichmäßig auf mit 96-Well-Matrix beschichtete Platten, indem Sie mit einer Mehrkanalpipette 50 Mikroliter Suspensionszellen in jede Vertiefung pipettieren.

Kultivieren Sie die Zellen dann über Nacht bei 37 Grad Celsius unter 4 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid und wiederholen Sie die Aussaatverfahren mit den restlichen Platten. Untersuchen Sie die 96-Well-Platten durch Mikroskopie, um sicherzustellen, dass die Zellen mindestens 70 % der Oberfläche jedes einzelnen Wells bedecken. Ersetzen Sie das Nährmedium für den ersten bis zweiten Tag der Differenzierung durch 100 Mikroliter RPMI-basiertes Differenzierungsmedium pro Vertiefung.

Inkubieren Sie die Zellen dann zwei Tage lang bei 37 Grad Celsius in Umgebungssauerstoff und 5 % Kohlendioxid mit einem täglichen Mediumwechsel. Ersetzen Sie das Kulturmedium am dritten bis fünften Tag der Differenzierung durch 100 Mikroliter RPMI-basiertes Differenzierungsmedium, das mit 2 % B27 und 100 Nanogramm pro Milliliter aktiver NA ergänzt wird. Kultivieren Sie die Zellen drei Tage lang bei 37 Grad Celsius in Umgebungssauerstoff und 5 % Kohlendioxid mit täglichem Mediumwechsel. Am fünften Tag der Differenzierung behandeln Sie jede Vertiefung 30 Sekunden lang mit 100 Mikrolitern 0,02%iger EDTA-Lösung und entfernen Sie die Lösung sofort.

Fügen Sie 100 Mikroliter frisches Differenzierungsmedium auf RPMI-Basis hinzu und wiederholen Sie den gleichen Vorgang für die restlichen Platten. Für die Differenzierung zwischen den Tagen sechs bis zehn ersetzen Sie das Kulturmedium durch 100 Mikroliter RPMI-basiertes Differenzierungsmedium. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius unter 4 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid für fünf Tage mit einem täglichen Mediumwechsel.

Zur Differenzierung zwischen den Tagen 11 und 15 wird das Kulturmedium durch 100 Mikroliter RPMI-basiertes Differenzierungsmedium ersetzt, ergänzt mit 2 % B27 und 20 Nanogramm pro Milliliter HGF. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius unter 4 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid für fünf Tage mit einem täglichen Mediumwechsel. Zur Unterscheidung zwischen den Tagen 16 und 20 wird das Kulturmedium durch ein Hepatozyten-Zellkulturmedium ersetzt, das mit 20 Nanogramm pro Milliliter Oncostatin-M ergänzt wird.

Inkubieren Sie die Zellen fünf Tage lang bei 37 Grad Celsius in Umgebungssauerstoff und 5 % Kohlendioxid mit täglichem Mediumwechsel. Nach Abschluss der Differenzierung an Tag 20 wird das Kulturmedium durch 100 Mikroliter frisches Hepatozyten-Zellkulturmedium ersetzt, das mit 20 Nanogramm pro Milliliter Oncostatin-M ergänzt wird. Nach 24-stündiger Inkubation wird das Nährmedium in eine frische 96-Well-Platte gegeben und bei 20 Grad Celsius gelagert.

Wiederholen Sie den gleichen Entnahmevorgang für die restlichen Platten. Geben Sie 90 Mikroliter frisches Hepatozyten-Zellkulturmedium, ergänzt mit Oncostatin-M, in jede Vertiefung der 96-Well-Platte. Fügen Sie zehn Mikroliter jeder gewählten Verbindung aus einer zuvor vorbereiteten Arbeitsstofflösung hinzu.

Geben Sie DMSO bis zu 0,2 % in die Kontrollvertiefungen, um die Endkonzentration in den behandelten Proben zu erreichen. Nach 24-stündiger Inkubation wird das Nährmedium in eine frische 96-Well-Platte gegeben und bei 20 Grad Celsius gelagert. Wiederholen Sie den gleichen Entnahmevorgang für die restlichen Platten.

Nach fünftägiger Behandlung exprimieren die Zellen Proteine, die charakteristisch im Definitive Endoderm exprimiert werden. Nach weiteren fünf Tagen der Differenzierung wandelt sich das Endoderm in ein hepatisches Schicksal um und die Zellen exprimieren FOXA2 und HNF 4a. Nach der HGF-Zugabe exprimieren die Zellen Proteine, die in fetalen Hepatozyten vorkommen, und nach Abschluss der Differenzierung nehmen die Zellen eine quaderförmige Morphologie mit einem Kern mit prominenten Nukleolen und einem großen Zytoplasma mit mehreren Lipidtröpfchen an.

Die Immunfärbung zum Nachweis von HNF 4a und Albumin am Tag 20 der Differenzierung zeigt, dass die Verteilung dieser Hepatozytenproteine in allen Vertiefungen ähnlich ist. iPSCs wurden zum Screening auf APOB-senkende Verbindungen verwendet, um ein Beispiel für die Verwendung von iPSC-abgeleiteten Hepatozyten für das Screening kleiner Moleküle zu liefern. Der z-Faktor des APOB-Assays beträgt 0,73, was die Eignung der Plattform für die Wirkstoffforschung bestätigt.

Für jede Verbindung wurde das Verhältnis von APOB nach der Arzneimittelbehandlung und vor der Arzneimittelbehandlung bestimmt. Eine Identifizierung der Treffer wurde durch eine Z-Score-Analyse erreicht. Es wurden 24 potenzielle Treffer mit einem APOB-Verhältnis von 0,86 bis 0,44 identifiziert.

Nach dem Ausschluss von Verbindungen, die sich negativ auf die Lebensfähigkeit der Zellen auswirkten, erwiesen sich zwei Verbindungen als reproduzierbar zur Senkung des APOB. Einmal gemeistert, kann diese Technik in 25 Tagen durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, täglich frisches Medium zuzubereiten.

Eine falsche Konzentration von Komponenten aufgrund von Degradation verändert die Differenzierungsfähigkeit der Zellen. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Arzneimittelforschung, um die therapeutische Behandlung von Lebererkrankungen mit humanen induzierten pluripotenten Stammzellen zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man humane induzierte pluripotente Stammzellen kultiviert und konserviert und wie man die Leberdifferenzierung in einer kleinen oberflächengepressten Form für das Hochdurchsatz-Screening durchführt.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit humanen induzierten pluripotenten Stammzellen äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Eingriffs immer persönliche Schutzausrüstung wie Handschuhe und ein Laborkittel getragen werden sollten.