Name: Menschen mit induzierten pluripotenten Stammzellen gewonnenen Hepatozyten-ähnliche Zellen für die Wirkstoffforschung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 40 s
Description: Lernen Sie die Differenzierung von iPSCs in hepatozytenähnliche Zellen für Hochdurchsatz-Screening bei Lebererkrankungen. Diese Methode ermöglicht personalisierte Medizin mit patientenspezifischen Zellen.

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Diese Arbeit wurde von der National Institutes of Health (DK55743, DK087377, DK102716 und HG006398, S.A.D) unterstützt. Wir möchte Dr. Behshad Pournasr, Dr. James Heslop und Ran Jing für ihre Beiträge danken.

(1) Kultur der menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen
<ol><li>
Beschichtung von rekombinanten menschlichen E-Cadherin Fc Fusionsprotein (E-Cad-Fc) oder andere Matrizen für hPSC Kultur geeignet 6<ol>
<li>Verdünnen Sie E-Cad-Fc mit Dulbeccos Phosphate-Buffered Kochsalzlösung enthält Calcium und Magnesium (DPBS (+)) bis 15 μg/mL.</li>
		<li>Mantel 100 mm Federweg Gewebekultur Gerichte mit 5 mL der verdünnten E-Cad-Fc und Inkubation bei 37 ° c für mindestens 1 h Substrat entfernen und ersetzen mit 5 mL Medium (z. B. mTeSR1, die fortan als M-Medium bezeichnet)7. Hinweis: In diesem Protokoll verwendeten Kulturmedium ist nach veröffentlichten Protokolle7zubereitet. Jedoch mehrere andere Medien-Präparate sind beschrieben worden, oder sind im Handel erhältlich, die wahrscheinlich kompatibel mit dem Verfahren sind.</li>
		<li>Rufen Sie ein Fläschchen mit kryokonservierten iPSCs aus flüssigem Stickstoff. Tauen Sie bei 37 ° c auf, bis eine kleine Eiskristall übrig bleibt. Sanft pipette Zellen in ein steriles 15 mL konische Röhrchen mit 4 mL des Mediums M.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie bei 300 X g für 5 min. Überstands entfernen und sanft wieder auszusetzen Zellen mit 5 mL des Mediums mit 10 µM Y-27632, ein selektiver Inhibitor der Rho-assoziierten, coiled-Coil enthaltenden Proteinkinase (ROCK) ergänzt.</li>
		<li>Entfernen Sie das M-Medium aus Schritt 1.1.2 und übertragen Sie 5 mL Zellen von Schritt 1.1.4 auf E-Cad-Fc-beschichtet 100 mm Federung Gewebekultur Gerichte.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Aufrechterhaltung der menschlichen iPSCs in Kultur
	<ol>
<li>Angekommen iPSCs um 80 % Konfluenz Kulturmedium zu entfernen und waschen einmal mit Kalzium und Magnesium frei DPBS (-). Aspirieren Sie des DPBS (-) und fügen Sie eine ausreichende Menge von 0,02 % EDTA-Lösung für die Abdeckplatten, dann bis zu 3 min bei Raumtemperatur inkubieren. Hinweis: Am Zusammenfluss von 80 % sollte die Platte ca. 2 x 107 Zellen enthalten. Es ist wichtig, nicht zu die Zellen überwuchern und um sicherzustellen, dass die Zellen eine undifferenzierte Morphologie behalten. Die Pluripotenz der Zellen kann durch Färbung mit Stammzell-Marker Tra-1-60 oder gleichwertige8bestimmt werden.</li>
		<li>Sobald die Zellen beginnen zu lassen, entfernen Sie die 0,02 % EDTA-Lösung und überfluten Sie die Schüssel mit 10 mL des Mediums M zu die Zellen zu lösen. Unterstützen Sie die Ablösung des iPSCs durch sanft pipettieren. Hinweis: Die durchschnittliche Inkubationszeit für Zellen zu trennen ist ca. 3 min, aber dies muss für jede Zeile der iPSC empirisch bestimmt werden. Die Zellen freigegeben werden soll, als kleine Cluster mit rund 5-10 iPSCs pro Cluster.</li>
		<li>1/10 der suspendierten Zellen pro frische E-Cad-Fc beschichteten 100 mm Federung Gewebekultur Schale mit 5 mL M-Medium zu übertragen. Inkubation der Kulturen bei 37 ° c weniger als 4 % O25 % CO2 und Änderung des Mediums täglich. Hinweis: Obwohl iPSCs routinemäßig unter physiologischen sauerstoffbedingungen Pluripotenz zu fördern kultiviert werden, können iPSCs auch mit ambient Sauerstoff angebaut werden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(2) Differenzierung der menschlichen iPSCs Hepatozyten-ähnliche Zellen auf 96-Well-Platten
Hinweis: Dieser Abschnitt beschreibt die Differenzierung der iPSCs in einem Format, die kompatibel mit Screening ist. Bei dieser Vorgehensweise ist es möglich, menschliche iPSCs zu differenzieren und Hepatozyten-ähnliche Zellen bilden in 20 Tagen zu induzieren. Während dies für die meisten Tests geeignet ist, kann die Länge der Kultur erweitert werden, um die Reife der Zellen zu verbessern.
<ol><li>
96-Well-Zellkultur-Platten mit reduzierten Wachstumsfaktor Basalmembran Matrix Beschichtung
	<ol>
<li>Bereiten Sie das Lager durch Verdünnung der Matrix bis 2 mg/mL mit eiskalten sterile DMEM/F12 Gewebekultur Medium. Teilen Sie die Matrix in 250 μl-Aliquots und lagern bei-80 ° c bis erforderlich. Chill-10 mL DMEM/F12 auf Eis für 30 min. Abrufen einer 250 μL Aliquot von 2 mg/mL Matrix Lager und Tauwetter auf Eis.</li>
		<li>Kombinieren Sie die Matrix mit 10 mL kalte DMEM/F12 durch Mischen, vorsichtig mit einer vorgekühlt Pipette Endkonzentration von 0,05 mg/mL zu machen.</li>
		<li>100 μl verdünnter Matrix in jede Vertiefung einer 96-Well-Zellkultur-Platte zu übertragen. Bei 37 ° c inkubieren, 4 % O25 % CO2 für mindestens 1 h verwerfen die Matrix und ersetzen mit 50 μL der M-Medium pro Bohrloch. Lagerung bei 37 ° C, 4 % O25 % CO2 bis benötigt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Platte-Zellen zur Differenzierung
	<ol>
<li>Kultur die iPSCs auf 100-mm-Platten, bis die Zellen 80 % Zusammenfluss nähern. Stellen Sie sicher, dass die Platte ca. 2 x 107 Zellen enthält. Zellzahlen von Zelle Durchflusszytometer oder Hemocytometer zu bestimmen. Hinweis: Mit Erfahrung kann die Qualität der Zellen iPSCs Mikroskopie beurteilt werden; Allerdings sollte in der Nähe von 98 % der Zellen Pluripotenz Markierungen wie die TRA-1-60-Epitop FACS oder Immunostaining gemessen äußern. Es ist wichtig, dass die Zellen aktiv teilenden bleiben und nicht überwuchert.</li>
		<li>Um die iPSCs aus jeder 100-mm-Platte zu ernten, das Kulturmedium abgesaugt und spülen Sie mit 5 mL des DPBS (-). Ersetzen Sie die Spülung mit 3 mL der Zelle Ablösung Lösung (z.B. Accutase) und inkubieren Sie für ca. 2 min bei 37 ° C, 4 % O25 % CO2. Hinweis: Es ist wichtig, die Loslösung der Zellen von Mikroskopie zu folgen. Tun Sie nicht über Digest mit Accutase. Ziel ist es, die Zellen als kleine Cluster mit minimalen Behandlung zu veröffentlichen.</li>
		<li>Sobald die Zellen beginnen sich zu trennen, durch Zugabe von 7 mL des Mediums M zu ernten. Pipette mehrmals distanzieren die Zelle Kolonien in kleine Gruppen von rund 3 bis 6 Zellen (Abbildung 1A).</li>
		<li>Sammeln Sie die iPSCs in einem sterilen Zentrifugenröhrchen 15 mL und Zentrifuge bei 300 X g für 5 min. Überstands zu entfernen und erneut aussetzen der Zelle Pellet in 5 mL M-Medium.</li>
		<li>Verteilen Sie gleichmäßig die Zellen auf 96-Well-Matrix-beschichteten Platten durch pipettieren 50 μL der Aussetzung Zellen in jedem Brunnen. Um jede 96-Well-Platte einzurichten, verwenden Sie eine 100-mm-Platte von iPSCs mit Zellen bei ca. 80 % Konfluenz enthält ca. 5 x 106 Zellen um die Differenzierung setup. Verwenden Sie eine Mehrkanal-Pipette, um diesen Prozess zu beschleunigen. Kulturzellen Sie über Nacht bei 37 ° c, 4 % O25 % CO2. Hinweis: Es ist wichtig, dass eine gleiche Anzahl von Zellen in jedem Bohrloch zu gewährleisten reproduzierbare Differenzierungen hinterlegt ist.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Differenzierung der Zellen induzieren
	<ol>
<li>Prüfen Sie die 96-Well-Platten Mikroskopie um sicherzustellen, dass die Zellen zu mindestens 70 % der Fläche des einzelnen gut abdecken. Wenn die Abdeckung weniger als 70 % ist, ersetzen Sie das Medium mit frischem Medium und inkubieren Sie für weitere 24 h bei 37 ° c, 4 % O25 % CO2. Hinweis: Inkubation der Zellen für mehr als 48 h nach Beschichtung ohne Differenzierung häufig reduziert die Effizienz der Differenzierung. Differenzierung tritt auch mit ambient Sauerstoff, obwohl die Effizienz möglicherweise betroffenen.
</li>
		<li>Tag 1 bis Tag2 der Differenzierung, ersetzen das Kulturmedium mit RPMI ergänzt mit 2 % B27 (ohne Insulin), 100 ng/mL Activin A, 10 ng/mL BMP4 und 20 ng/mL FGF2. Fügen Sie 100 μL des Mediums pro Bohrloch und Inkubation bei 37 ° c, Umgebungstemperatur O25 % CO2 mit einer täglichen mittleren Änderung für 2 Tage. Hinweis: Umgang mit einer großen Anzahl von 96-Well Platten erfordern den Einsatz einer assistierten Pipette oder Roboter. 12-Kanal und 96-Kanal Pipetten sind ideal für tägliche mittlere Veränderung.</li>
		<li>Für Tag3 bis Tag 5 der Differenzierung ergänzt ersetzen das Kulturmedium mit RPMI Zellen bei 37 ° c, Umgebungstemperatur O25 % CO2 mit täglichen mittlere Änderung für 3 Tage mit 2 % B27 (ohne Insulin) und 100 ng/mL Activin A. Culture.</li>
		<li>Auf Differenzierung 5.Tag, vor dem Austausch mit frischem Nährmedium, behandeln jedes gut mit 100 μL 0,02 % EDTA Lösung für 30 s, dann entfernen und ersetzen mit frischem Nährmedium. Hinweis: Wenn die Differenzierung zum Entoderm effizient ist, ist der Monolage Zellen zu unterscheiden anfällig für Peeling von der Platte. Eine kurze Behandlung mit 0,02 % EDTA Lösung lindert Zelle ablösen. Diese Behandlung beeinflusst nicht die Differenzierung in Hepatozyten.</li>
		<li>Zur Differenzierung zwischen Tagen 6 bis 10 ersetzen Sie das Kulturmedium mit RPMI / 2 % B27 (mit Insulin) mit 20 ng/mL BMP4 und 10 ng/mL FGF2 ergänzt und Inkubation bei 37 ° c, 4 % O25 % CO2 für 5 Tage mit täglicher mittlerer Wechsel. Dieser Phase induziert Zellen in Leber Vorläuferzellen zu unterscheiden.</li>
		<li>Zur Differenzierung zwischen Tage 11 bis 15 ersetzen Sie das Kulturmedium mit RPMI / 2 % B27 (mit Insulin) ergänzt mit 20 ng/mL HGF. Inkubation bei 37 ° c, 4 % O25 % CO2 für 5 Tage mit täglicher mittlerer Wechsel.</li>
		<li>Zur Differenzierung zwischen Tagen 16 bis 20 ersetzen Sie das Kulturmedium mit einem Hepatozyten Zellkulturmedium (HCM) mit 20 ng/mL von Oncostatin-M (OSM) ergänzt. Inkubieren Sie die Zellen an 37 ˚C Umgebungstemperatur O25 % CO2 mit tägliche mittlere Änderung für 5 Tage. Hinweis: Die Reproduzierbarkeit der Differenzierung zwischen den einzelnen Brunnen kann effizient durch Messung der relativen Höhe von Albumin, AFP oder APOB ELISA ins Medium sezerniert ermittelt werden (siehe 3.2).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. kleines Molekül Screening
Hinweis: Im folgenden beschreibt das Verfahren verwendet, um Verbindungen zu identifizieren, die verwendet werden, um die APOB im Medium der Hepatozyten-wie Zellen aus familiärer Hypercholesterinämie iPSCs zu senken. Eine Beschreibung des Modells und seine Verwendung bei der Identifizierung von Cholesterin-senkenden Medikamenten beschrieben worden im detail vorher5,9. Im aktuellen Beispiel wurden 1.000 Verbindungen aus South Carolina Compound-Sammlung (SC3) Bibliothek gezeigt. Jeder Verbindung wurde bei einer Konzentration von 2 µg/mL getestet.
<ol><li>
Behandlung von iPSC - abgeleitete Hepatozyten mit kleinen Molekülen
	<ol>
<li>Verdünnen Sie die zusammengesetzten Hauptbibliothek um Platten arbeiten Bestände mit Verbindungen in einer Konzentration von 20 μg/mL in 2 % DMSO und bei-20 ° c zu erzeugen.</li>
		<li>Bereiten Sie genügend 96-Well-Platten der iPSC-abgeleitete Hepatozyten ermöglichen jede Verbindung getestet werden. Hinweis: Die Anzahl der Verbindungen zu siebenden bestimmen die Anzahl der 96-Well Platten, die erforderlich sind. Ein einzelnes sollte in der Regel jedes zusammengesetzte, plus zusätzliche Brunnen für jede Kontrollproben gut vorbereitet sein. Die Regionen in äußerster Vertiefungen der Platte vermieden werden häufig die Möglichkeit, Randeffekte zu reduzieren, die Auslegung beschädigen kann. Treffer zu erkennen mit der Z-Score-Methode ohne Wiederholungen verwenden. Wenn Wiederholungen enthalten sind, ist es sinnvoller, den t-Test verwenden.</li>
		<li>Nach Abschluss der Differenzierung (Tag 20, siehe 2.3.7) ersetzen das Kulturmedium mit 100 μL frische HCMmit 20 ng/mL Oncostatin m ergänzt. Bei 37 ° c inkubieren, 4 % O25 % CO2 für genau 24 h abrufen das Kulturmedium in eine frische 96-Well-Platte und speichern bei-20 ° c. Verwenden Sie dieses Beispiel, um das Niveau der APOB in das Medium vor der Zugabe des Medikaments zu berechnen.</li>
		<li>Fügen Sie 90 μL frische HCM mit 20 ng/mL Oncostatin m in jedem Brunnen ergänzt. Fügen Sie 10 μL jeder Verbindung von der Arbeit bestand nach dem Mischen von pipettieren. 0,2 % Steuern Brunnen entsprechend die Endkonzentration in den behandelten Proben und bei 37 ° c inkubieren DMSO hinzufügen, ambient O25 % CO2 für genau 24 h das Kulturmedium zu sammeln und bei-20 ° c lagern. Verwenden Sie dieses Beispiel, um das Niveau von APOB nach einer Behandlung mit Verbindungen zu bestimmen.</li>
		<li>Optional - die verbleibenden Zellen für Immunostaining, Zellviabilität oder Analysen der mRNA-Niveaus mit Standardmethoden verarbeitet werden können. Hinweis: Dieser Bildschirm wurde entwickelt, um Medikamente zu identifizieren, die eine rasche Wirkung auf APOB hatte. Je nach Krankheitsmodell, nachgeschaltete Assays oder Medikament Wirkmechanismus kann es vorteilhaft, die Probe für mehrere Tage zu behandeln sein.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
APOB von ELISA zu bestimmen
	<ol>
<li>Apolipoprotein B (APOB) Konzentration von beiden die Pre- und Post-Medikamenten behandelten Proben mit einem menschlichen APOB ELISA-Development-Kit des Herstellers-Protokolle zu bestimmen.</li>
		<li>
Die folgenden Lösungen vorbereiten
		<ol>
<li>Waschpuffer, komponiert von 0,05 % Tween 20 in PBS, pH 7.4. Bei 4 ° c bis zur Verwendung aufbewahren.</li>
			<li>Inkubation Puffer, bestehend aus 0,05 % Tween 20 und 0,1 % Rinderserumalbumin (BSA) mit PBS-Puffer, pH 7.4. Bei 4 ° c bis zur Verwendung aufbewahren.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Bereiten Sie APOB (mAB 20/17) Antikörper durch Verdünnen bis 2 µg/mL mit PBS-Puffer, pH 7.4 vor. Fügen Sie 100 μL der verdünnten Antikörper pro Bohrloch und über Nacht bei 4 ° c inkubieren.</li>
		<li>Entfernen Sie den Antikörper von den Assay-Platten und waschen Sie auch zweimal mit 200 μl PBS, pH 7.4.</li>
		<li>Fügen Sie 200 μl/Well von 0,05 % Tween 20, 0,1 % Rinderserumalbumin (BSA) mit PBS-Puffer, pH 7,4 und auf einer schütteln Plattform für 1 h bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
		<li>Bereiten Sie eine standard 8-Punkt-Kurve mit 0,05 % Tween 20 und 0,1 % BSA mit PBS-Puffer, pH 7.4 mit der folgenden Konzentrationen von APOB: 300 ng/mL, 200 ng/mL, 175 ng/mL, 150 ng/mL, 125 ng/mL, 100 ng/mL, 75 ng/mL und 50 ng/mL.</li>
		<li>Verdünnen Sie die Test-Proben 1:4 mit 0,05 % Tween 20 und 0,1 % BSA mit PBS-Puffer, pH 7.4.</li>
		<li>Nach 1 h Inkubation Puffer zu blockieren, den Puffer zu verwerfen und waschen die Assay-Platten fünfmal mit 200 μL von 0,05 % Tween 20 in PBS, pH 7.4.</li>
		<li>Vollständig zu entfernen Sie alle restlichen waschen-Puffer und übertragen Sie 90 μL der verdünnten Proben und die APOB-Standards an der Assay-Platten. Inkubation bei Raumtemperatur auf einem Boston-Shaker für 1 h.</li>
		<li>Verwerfen Sie die Probe und Waschen mit 200 μL 0,05 % Tween 20 in PBS, pH-Wert 7,4 pro Bohrloch. Die Waschungen insgesamt 5 Mal zu wiederholen. Fügen Sie 100 μL pro Well von mAB LDL 11-Biotin verdünnten 1:1,000 in 0,05 % Tween 20 und 0,1 % BSA mit PBS-Puffer, pH 7.4. Inkubation bei Raumtemperatur auf einem schütteln Plattform für 1 h.</li>
		<li>Das Reagenz zu verwerfen und mit 200 μl pro gut waschen Puffer 5 Mal waschen. Fügen Sie 100 μL pro Well Streptavidin-HRP Antikörper (1:1 000 Verdünnung mit Inkubation Puffer), dann bei Raumtemperatur auf einem schütteln Plattform für 1 h inkubieren.</li>
		<li>Das Reagenz zu verwerfen und Waschen mit 200 μL 0,05 % Tween 20 in PBS, pH-Wert 7,4 pro Bohrloch. Die Waschungen insgesamt 5 Mal zu wiederholen. Vollständig entfernen Sie die restliche Wäsche Puffer aus der Assay-Platten 100 μL pro Well Tetramethylbenzidin (TMB) Substratlösung hinzufügen und bei Raumtemperatur für 8 min inkubieren.</li>
		<li>Ohne die TMB-Substrat fügen Sie direkt 100 μL pro Well Stopp-Lösung (1N HCl hinzu).</li>
		<li>Bestimmen die Extinktion bei 450 nm mit einem Teller-Reader.</li>
		<li>Eine Standardkurve kann festgestellt werden, mit Hilfe der vier Parameter logistische Regression Methode, dann verwendet, um die Konzentration von APOB in jeder Probe10definieren.</li>
		<li>Untersuchen Sie die Pre-Droge: Post-Medikament Verhältnis von APOB in jeder Probe, Verbindungen mit dem Potenzial zur Senkung von APOB identifizieren Ebenen im Medium.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Mallanna, S. K., Duncan, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+hepatocytes+from+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Stem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Differentiation of hepatocytes from pluripotent stem cells.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 26 (Unit 1G 4), (2013).</li>
<li>Song, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+hepatocyte-like+cells+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of hepatocyte-like cells from human induced pluripotent stem cells.</a> Cell Res. 19 (11), 1233-1242 (2009).</li>
<li>Cai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+functional+hepatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional hepatic cells.</a> Hepatology. 45 (5), 1229-1239 (2007).</li>
<li>Si-Tayeb, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+generation+of+human+hepatocyte-like+cells+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells.</a> Hepatology. 51 (1), 297-305 (2010).</li>
<li>Pashos, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+Population+Cohorts+of+hiPSCs+and+Derived+Hepatocyte-like+Cells+Reveal+Functional+Genetic+Variation+at+Blood+Lipid-Associated+Loci%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Diverse Population Cohorts of hiPSCs and Derived Hepatocyte-like Cells Reveal Functional Genetic Variation at Blood Lipid-Associated Loci.</a> Cell Stem Cell. 20 (4), 558-570 (2017).</li>
<li>Davidson, M. D., Ware, B. R., Khetani, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell-derived+liver+cells+for+drug+testing+and+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Discov+Med%22%5BJournal%5D)">Stem cell-derived liver cells for drug testing and disease modeling.</a> Discov Med. 19 (106), 349-358 (2015).</li>
<li>Choi, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+drug+screening+and+gene+correction+for+treating+liver+disease+using+patient-specific+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Efficient drug screening and gene correction for treating liver disease using patient-specific stem cells.</a> Hepatology. 57 (6), 2458-2468 (2013).</li>
<li>Tafaleng, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+model+personalized+variations+in+liver+disease+resulting+from+alpha1-antitrypsin+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells model personalized variations in liver disease resulting from alpha1-antitrypsin deficiency.</a> Hepatology. 62 (1), 147-157 (2015).</li>
<li>Jing, R., Duncan, C. B., Duncan, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small-molecule+screen+reveals+that+HSP90beta+promotes+the+conversion+of+induced+pluripotent+stem+cell-derived+endoderm+to+a+hepatic+fate+and+regulates+HNF4A+turnover%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A small-molecule screen reveals that HSP90beta promotes the conversion of induced pluripotent stem cell-derived endoderm to a hepatic fate and regulates HNF4A turnover.</a> Development. 144 (10), 1764-1774 (2017).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Ziel basiert Arzneimittelforschung, wo kleine Moleküle identifiziert werden, die Einfluss auf die Aktivität eines bestimmten Proteins, wurde der Fokus vieler bestehende Screening-Bemühungen. Obwohl dieser Ansatz hat zahlreiche Arzneimittel, basierend auf Umkehr ein Phänotyp, klassischen Pharmakologie, Bildschirme zur Verfügung gestellt wurden erfolgreicher bei der Identifizierung von First-in-Class-Verbindungen, die klinisch wirksame1gewesen sein. Ein Nachteil phänotypischen Arzneimittelforschung ...

Erfolg bei der Identifizierung von Medikamenten, die verwendet werden, um eine seltene Krankheit gezielt stützt sich auf die Entwicklung von Assays, die für das Screening verwendet werden können. Hypothese oder zielbasierte Bildschirme (umgekehrte Pharmakologie) sind nützlich, aber erfordern ein detailliertes Verständnis der molekularen Grundlagen der Krankheit. Phänotypische Bildschirme (klassische Pharmakologie) vermeiden die Notwendigkeit für ein detailliertes Verständnis der biochemischen Bahnen, aber stattdessen verlassen Sie sich auf die Entwicklung von Modellen, die genau die Pathophysiologie der Erkrankung widerspiegeln. Trotz Begeisterung für Ziel-basierte Ansätze zeigen Analysen der FDA-Zulassung in erstklassige Medikamente, dass phänotypischen Bildschirme weitaus erfolgreicher1gewesen sein. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist eine Plattform für Hochdurchsatz-screening, die verwendet werden können, um kleine Moleküle für die Behandlung der metabolischen Lebererkrankungen zu identifizieren. Mehrere in-vitro- Modelle wurden einschließlich primäre Hepatozyten, Hepatom Zellen und Leber Progenitor Zellen2beschrieben. Jedoch die meisten dieser Modelle haben Einschränkungen, und besteht ein Bedarf für neue Modelle, die genau die Pathophysiologie des metabolischen Leber Mängel in der Kultur rekapitulieren kann. Vor kurzem haben menschliche pluripotente Stammzellen kombiniert mit dem Bearbeiten von Gen bot Gelegenheit, sogar die seltensten der seltenen Krankheiten in der Kultur ohne die Notwendigkeit, Patienten Zugang zu modellieren direkt3. Während der Einsatz von patientenspezifischen iPSCs wie ein Werkzeug, um kleine Moleküle für die Behandlung von seltenen Erkrankungen der Leber entdecken konzeptionell angemessen ist, gibt es nur wenige Berichte zeigen die Machbarkeit dieses Ansatzes4. Allerdings haben wir vor kurzem eine Plattform geschaffen, mit denen iPSC-abgeleitete Hepatozyten um erfolgreich Medikamente zu identifizieren, die für die Behandlung von Mängeln im LEBERSTOFFWECHSEL5verwendet werden können.
Dieses Protokoll erklärt den Prozess der menschlichen iPSCs Hepatozyten-ähnlichen Zellen in 96-Well Platten zu unterscheiden und mit ihnen eine Bibliothek mit kleinen Molekülen auf den Bildschirm. Es beschreibt auch die Endpunktanalyse mit Hypercholesterinämie als Beispiel für metabolische Lebererkrankungen. Dieser Ansatz sollte zur Untersuchung der Rolle und der Anwendung von kleinen Molekülen im Rahmen der infektiöse Lebererkrankungen, metabolische Lebererkrankungen, medikamententoxizität und anderen Lebererkrankungen nützlich sein.

<table><tbody><tr><td>100 mm x 20 mm sterile Gewebekulturschalen&nbsp;</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>100 mm x 20 mm sterile Suspensionskulturschalen</td><td>Corning</td><td>430591</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Gewebekulturplatte&nbsp;</td><td>Corning</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human-Albumin</td><td>Dako</td><td>A 0001</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human-Antikörper FOXA2(6C12)</td><td>Novus Biological</td><td>H00003170-M12</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human-HNF4 alpha</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-6556</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human-Oct-3/4-Antikörper</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-9081</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human-SOX17</td><td>R& D</td><td>AF1924</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human-TRA-1-60 FITC-konjugiertes</td><td>Millipore</td><td>FCMAB115F</td><td></td></tr><tr><td>Activin A rekombinantes humanes Protein&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>PHC9563</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Ergänzung, abzüglich Insulin&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>0050129SA</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Ergänzungsmittel, serumfrei&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>BMP4 Rekombinantes humanes Protein&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>PHC9533</td><td></td></tr><tr><td>Zelldissoziationsreagenz StemPro&nbsp; Accutase&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A1110501</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo Lumineszenz-Zellviabilitätsassay&nbsp;</td><td>Promega</td><td>7572</td><td></td></tr><tr><td>DPBS+(Calcium, Magnesium)</td><td>Invitrogen</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>DPBS-(kein Calcium, kein Magnesium)</td><td>Invitrogen</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, HEPES&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11330057</td><td></td></tr><tr><td>ELISA humaner APOB ELISA Entwicklungskit</td><td>Mabtech</td><td>3715-1H-20</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 (FGF2)</td><td>Invitrogen</td><td>PHG0023</td><td></td></tr><tr><td>Hepatozyten-Kulturmedium (HCM Bullet Kit)</td><td>Lonza</td><td>CC-3198</td><td></td></tr><tr><td>Hepatozyten-Wachstumsfaktor&nbsp; (HGF)</td><td>Invitrogen</td><td>PHC0321</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>MEM Lösung für nicht-essentielle Aminosäuren</td><td>Invitrogen</td><td>11140076</td><td></td></tr><tr><td>Oncostatin M (OSM) rekombinantes humanes Protein&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>PHC5015</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15140163</td><td></td></tr><tr><td>Feeder-freies pluripotentes Stammzellmedium: mTesR1&nbsp;</td><td>STEMCELL technologies</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>Basalmembran-Matrix mit reduziertem Wachstumsfaktor&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A1413301</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium, HEPES&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>22400105</td><td></td></tr><tr><td>StemAdhere Defined Matrix für hPSC (e-cad-fc)</td><td>Primorigen Biosciences</td><td>S2071</td><td></td></tr><tr><td>TMB-ELISA Substrat Lösung</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>34022</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TRA-1-60 FITC, konjugiertes</td><td>Millipore</td><td>FCMAB115F</td><td></td></tr><tr><td>Versen (EDTA) 0,02%&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>17-711E</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 ROCK-Inhibitor</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72302</td><td></td></tr></tbody></table>

menschen mit induzierten pluripotenten stammzellen gewonnenen hepatozyten-ähnliche zellen für die wirkstoffforschung

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocyte-like Cells for Drug Discovery

Die Fähigkeit, menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) in Hepatozyten-ähnliche Zellen (GLT) differenzieren bietet neue Möglichkeiten, angeborene Fehler bei der hepatischen Metabolismus zu studieren. Das Verfahren erfordert jedoch um eine Plattform zu bieten, die die Identifikation von kleinen Molekülen unterstützt, die potenziell zur Behandlung von Erkrankungen der Leber, eine Kultur-Format, die kompatibel mit screening-Tausende von Verbindungen ist. Hier beschreiben wir ein Protokoll mit vollständig definierten Kulturbedingungen, wodurch die reproduzierbare Differenzierung der menschlichen iPSCs Hepatozyten-ähnlichen Zellen in 96-Well-Zellkultur-Platten. Wir bieten auch ein Beispiel für die Nutzung der Plattform zu Bildschirm-Verbindungen für ihre Fähigkeit, Apolipoprotein B (APOB) senken aus iPSC-abgeleitete Hepatozyten erzeugt eine familiäre Hypercholesterinämie Patienten hergestellt. Die Verfügbarkeit einer Plattform, die kompatibel mit Wirkstoffforschung sollte erlauben Forschern, neuen Therapeutika für Krankheiten zu identifizieren, die die Leber betreffen.

Generation von Hepatozyten - wie Zellen: Abbildung 1 beschreibt den Zeitrahmen der Änderungen, die während der Differenzierung der menschlichen iPSCs Hepatozyten-ähnliche Zellen auftreten. Die Kultur der iPSCs auf E-Cad-Fc bietet ca. 2 mm Durchmesser-Kolonien, die den pluripotenten Marker OCT4 Ausdrücken (Abbildung 1A-B). Die Morphologie der Zellen auf eine E-Cad...

Die hier vorgestellten Protokoll beschreibt eine Plattform zur Identifizierung von kleiner Molekülen für die Behandlung von Lebererkrankungen. Eine schrittweise Beschreibung präsentiert Details wie iPSCs in Zellen mit Hepatozyten Eigenschaften in 96-Well Platten zu differenzieren und die Zellen verwenden, um Bildschirm für kleine Moleküle mit möglichen therapeutischen Tätigkeit.

Menschen mit induzierten pluripotenten Stammzellen gewonnenen Hepatozyten-ähnliche Zellen für die Wirkstoffforschung

The ability to differentiate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into hepatocyte-like cells (HLCs) provides new opportunities to study inborn ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, humane induzierte pluripotente Stammzellen in hepatozytenähnliche Zellen zu differenzieren, und zwar auf eine Weise, die für das Hochdurchsatz-Screening geeignet ist. Leberzellen sind im Labor schwer zu züchten, können jedoch aus induzierten pluripotenten Stammzellen erzeugt werden, was eine Screening-Plattform zur Identifizierung von Behandlungen für Lebererkrankungen bietet. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass von jedem Patienten mit Lebererkrankung eine unbegrenzte Anzahl von Hepatozyten erzeugt werden kann, die die Krankheit im Labor rekapitulieren.Das Verfahren ist relativ einfach zu etablieren, auch ohne umfangreiche Kenntnisse in der Stammzellbiologie. Seine Reproduzierbarkeit ermöglicht es Forschern, Tausende von Verbindungen zu screenen, ohne dass komplexe Robotik erforderlich ist. Ray Liu, ein Postdoktorand, und Paige Lamprecht, eine Doktorandin, werden heute das Verfahren demonstrieren.Verdünnen Sie zunächst das Fusionsprotein Ecad auf 15 Mikrogramm pro Milliliter mit Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS), die Kalzium und Magnesium enthält. 100-Millimeter-Suspensions-Gewebekulturschalen mit f

using-human-induced-pluripotent-stem-cell-derived-hepatocyte-like

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Dieser Artikel wird auf die Erzeugung von menschlichen Leber Entoderm aus humanen embryonalen Stammzell-Populationen zu konzentrieren.

Robuste Generierung von Leber-ähnlichen Zellen aus humanen embryonalen Stammzell-Populationen

Die hier vorgestellte Methode beschreibt eine skalierbare und gute Herstellungspraxis (GMP) -fähigen Differenzierungssystem menschlichen Hepatozyten-ähnliche Zellen aus pluripotenten Stammzellen zu erzeugen. Es dient als eine kostengünstige und standardisiertes System humanen Hepatocyten-artigen Zellen für Grundlagen- und angewandten Forschung der menschlichen Leber zu erzeugen.

Definierte und Scalable Generierung von Leber-ähnlichen Zellen aus humanen pluripotenten Stammzellen

Dieses Protokoll beschreibt einen halbautomatischen Ansatz um Hepatozyten-wie Zellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen in einem 96-well-Plattenformat zu produzieren. Dieser Prozess ist schnell und kostengünstig, so dass die Herstellung von hochwertigen Chargen von Hepatozyten-ähnliche Zellen für Grundlagen- und angewandte Forschung am Menschen versichert.

Halbautomatische Herstellung von Hepatozyten wie Zellen aus pluripotenten Stammzellen

Dieses Protokoll beschreibt eine monolayer, serumfreie Methode zur effizienten Erzeugung von Hepatozyten-ähnlichen Zellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) in 18 Tagen. Dies beinhaltet sechs Schritte, da hPSCs sequenziell in zwischengeschaltete Zelltypen wie den Primitivstreifen, das definitive Endoderm, das hintere Vorgut und die Leberknospenvorläufer differenzieren, bevor hepatozytenähnliche Zellen gebildet werden.

Effiziente Differenzierung menschlicher pluripotenter Stammzellen in Leberzellen

Dieses Protokoll beschreibt einen Ansatz zur Herstellung von Hepatosphären aus menschlichen pluripotenten Stammzellen unter Verwendung eines definierten Kultursystems und einer Zellselbstmontage. Dieses Protokoll ist in einer Reihe von Zelllinien reproduzierbar, kostengünstig und ermöglicht die Produktion von stabilen menschlichen Hepatosphären für die biomedizinische Anwendung.

Serumfreie Produktion dreidimensionaler menschlicher Hepatosphären aus pluripotenten Stammzellen

Das Ziel dieses Artikels ist es, einen standardisierten Ansatz zur Induktion der Differenzierung des menschlichen Lebervorläufers von pluripotenten Stammzellen bereitzustellen. Die Entwicklung dieses Verfahrens mit gebrauchsfertigen Medienformulierungen bietet dem Anwender ein einfaches System zur Erzeugung menschlicher Leberzellen für die biomedizinische Forschung und Translation.

Hepatischer Vorläufer aus pluripotenten Stammzellen unter Verwendung eines definierten Differenzierungssystems

Dieses Manuskript beschreibt ein detailliertes Protokoll zur Differenzierung menschlicher embryonaler Stammzellen (hESCs) in funktionelle hepatozytenähnliche Zellen (HLCs) durch kontinuierliche Ergänzung von Activin A und CHIR99021 während der hESC-Differenzierung zu definitivem Endoderm (DE).

Eine effiziente Methode zur gerichteten Hepatozyten-ähnlichen Zellinduktion aus menschlichen embryonalen Stammzellen

Hier stellen wir eine nicht-genetische Methode zur Erzeugung humaner autologer Lebersphäroide unter Verwendung mononukleärer Zellen vor, die aus peripherem Blut im stationären Zustand isoliert wurden.

Humane Lebersphäroide aus peripherem Blut für Studien zu Lebererkrankungen

Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung von schnellen und reproduzierbaren endodermalen Leberorganoiden (eHEPOs). Mit diesem Protokoll können eHEPOs innerhalb von 2 Wochen hergestellt werden und langfristig (mehr als 1 Jahr) expandieren, ohne ihre Differenzierung und Funktionalität zu verlieren.

Erzeugung von funktionellen endodermalen Leberorganoiden

Hepatozyten, die aus pluripotenten Stammzellen gewonnen werden, können durch Zellsortierung aufgereinigt werden, wobei eine Kombination aus mitochondrialer und aktivierter Leukozytenzelladhäsionsmolekülfärbung (ALCAM, auch bekannt als CD166) verwendet wird.

Anwendung der Färbung lebender Mitochondrien bei der Zellsortierung zur Aufreinigung von Hepatozyten, die aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen gewonnen wurden

Lernen Sie die Differenzierung von iPSCs in hepatozytenähnliche Zellen für Hochdurchsatz-Screening bei Lebererkrankungen. Diese Methode ermöglicht personalisierte Medizin mit patientenspezifischen Zellen.

Menschen mit induzierten pluripotenten Stammzellen gewonnenen Hepatozyten-ähnliche Zellen für die Wirkstoffforschung

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