Erhebung und Verarbeitung von Lymphknoten von großen Tieren für RNA-Analyse: Vorbereitung auf Lymphknoten Transkriptomischen Studien der großen Tierarten

Hallo, mein Name ist Dr. Robert Schaut und ich bin Wissenschaftler am National Animal Disease Center in Ames, Iowa. In diesem JoVE-Video teilen wir mit Ihnen Informationen über die Entnahme und Verarbeitung von Lymphknoten von Großtieren für die Verwendung in nachgelagerten RNA-Experimenten. Diese Experimente können beispielsweise quantitative PCR an reverse transkribierten Produkten oder RNA-Sequenzierungsstudien von Transkriptomen umfassen.

Lymphknoten sind nützliche Proben für die Beurteilung der Immunantworten des Wirts, können aber auch eine Quelle für Krankheitserreger-RNA für Studien darstellen, wie z. B. bei intrazellulären Krankheitserregern, die in Immunzellen in Lymphknoten vorkommen. Proben von Großtieren, darunter sowohl Nutz- als auch Wildtierarten, sind für die Erforschung von Zoonosen von Interesse. Hier, am National Animal Disease Center, untersuchen wir Infektionen von Nutztieren mit Spezies wie Brucella abortus, die Brucellose bei Rindern und Bisons verursacht, und E.Coli O157:H7, das aus den Darmbahnen von Rindern ausgeschieden wird.

Wir werden auch Gewebeproben von Wildtierarten wie Hirschen und Elchen entnehmen. Eine Reihe von Lymphknoten kann von Tieren entnommen werden, die mit verschiedenen Krankheiten infiziert sind. Untersuchungen von Geweben dieser natürlichen Wirtsspezies sind im Allgemeinen relevanter für das natürliche Fortschreiten der Krankheit als Mausmodelle.

Der Prozess der Gewebeentnahme bei großen Spezies ist jedoch notwendigerweise komplizierter als bei Mäusen, einschließlich der längeren Verzögerung zwischen Euthanasie und Gewebeentnahme und einer größeren Größe der Lymphknoten. Hier stellen wir ein Protokoll für die Isolierung von Lymphknoten von Großtieren für RNA-Studien vor, das sowohl für Molekularbiologen, die an transkriptomischen Studien von Großtierinfektionen beteiligt sind, als auch für Veterinärforscher, die mit transkriptomischen Studien beginnen, informativ sein wird. In diesem Video zeigen wir Verfahren an Lymphknoten bei Rindern.

Vor der Autopsie empfehlen wir, die folgenden Verbrauchsmaterialien speziell für das Gewebeisolationsverfahren zusammenzustellen. Mikrofuge-Röhrchen, gefüllt mit etwa 1 ml RNA-Gewebekonservierungsmittel, wie RNAlater, Einwegskalpelle, saubere und autoklavierte Pinzetten, Biopsienadeln, ein Behälter für scharfe Gegenstände für gebrauchte Skalpelle und Nadeln und entweder ein Schneidebrett oder ein Einwegtablett, je nach Grad der Infektiosität der beteiligten Materialien. In diesem Fall werden wir die wichtigsten Elemente des Verfahrens anhand von Lymphknoten demonstrieren, die wir in der Regel von Rindern sammeln.

Sie sind mit Bakterien infiziert, die Brucellose verursachen. Dabei handelt es sich um die präscapularen Lymphknoten und den Ohrspeicheldrüsenlymphknoten. Bei der Durchführung einer großen Tierautopsie zur RNA-Rückgewinnung ist es sinnvoll, mindestens drei Teilnehmer an tierischem Gewebe arbeiten zu lassen.

Dissektor eins ist verantwortlich für das Schneiden verschiedener Teile des Tieres bei Großtieren, Dissektor zwei gewinnt Lymphknoten von verschiedenen Tierabschnitten auf dem Hauptnekrosietisch, und Dissektor drei arbeitet an einem separaten Tisch, um Schnitte von jedem Lymphknoten zu isolieren und sie mit Konservierungslösung in Schläuche zu übertragen. Wir beginnen mit der Identifizierung und Entfernung des präscapularen Lymphknotens. Im Idealfall hilft das Abtasten eines Lymphknotens vor der Dissektion, die Lage des Lymphknotens zu identifizieren.

Obwohl es nicht immer möglich ist, den präscapularen Lymphknoten zu erkennen, ist er bei einem gesunden Tier typischerweise tastbar. Beginnen Sie damit, das Tier in die Seitenlage zu legen. Strecken Sie die Schulter, indem Sie das vordere Glied auf Höhe des Knies nach hinten bewegen.

Diese Bewegung bringt die Schulter zurück und ermöglicht ein leichtes Abtasten des Lymphknotens. Fühlen Sie nach dem Vorhandensein des Lymphknotens, wie gezeigt. Sobald Sie die Schulter lokalisiert haben und noch gestreckt sind, verwenden Sie ein Skalpell oder ein Autopsiemesser, um einen Hautschnitt entlang des Umrisses der Schulter zu machen.

Ziehen Sie die Haut zurück, um die Spitze der Schulter- und Nackenmuskulatur freizulegen. Manchmal wird ein Abschnitt von subkutanem Fett beobachtet, insbesondere bei überkonditionierten Tieren. Der präscapulare Lymphknoten befindet sich häufig mit Abschnitten aus subkutanem Fett.

Hier sehen Sie die drei Schichten der Haut, der Muskeln und des Unterhautfettgewebes. Tasten Sie erneut die Stelle eines Lymphknotens ab. Im Gegensatz zum Unterhautfett behält der Lymphknoten seine Form, wenn er abgetastet wird.

Nachdem Sie den präscapularen Lymphknoten lokalisiert haben, präparieren Sie vorsichtig das Unterhautfett und präparieren Sie den Lymphknoten. Das Aussehen dieser Lymphknoten bei Bisons, die wir in Brucellosestudien aufgrund der Anfälligkeit von Bisons im Greater Yellowstone-Gebiet für Brucella verwendet haben, ist ähnlich. Hier zeigen wir das Aussehen des präscapularen Lymphknotens, wie er aus der rechten Schulter eines amerikanischen Bisons präpariert wurde.

Als nächstes gehen wir zur Isolierung des Ohrspeicheldrüsenlymphknotens über. Wenn das Tier seitlich liegt, lokalisieren Sie das Kiefergelenk. Machen Sie mit einem Skalpell oder einem Autopsiemesser vorsichtig einen Schnitt in die Haut.

Beginnen Sie dorsal des Gelenks und erstrecken Sie sich vertikal entlang der Kieferlinie. Präparieren Sie die Haut, um das Unterhautgewebe freizulegen. Die Speicheldrüse der Ohrspeicheldrüse wird sichtbar sein, vor allem aufgrund ihrer Größe, des läppchenförmigen Oberflächenaussehens und der roten Färbung.

Schieben Sie mit einer Pinzette und einem Skalpell die Speicheldrüse zur Seite, um den Ohrspeicheldrüse zu finden, der nur kranial und medial zur Speicheldrüse sitzt. Bei der Isolierung des Ohrspeicheldrüsen-Lymphknotens ist es wichtig, das Lymphknotengewebe vom Gewebe der Ohrspeicheldrüse zu trennen. Die Gewebetypen sehen unterschiedlich aus, auch innerhalb des Gewebequerschnitts.

Dies ist hier zu beobachten, mit dem Ohrspeicheldrüsen-Lymphknoten auf der linken Seite und der Ohrspeicheldrüse auf der rechten Seite. Achten Sie darauf, das Ohrspeicheldrüsen-Lymphknotengewebe vor der weiteren Verarbeitung sorgfältig auf Textur zu untersuchen. In einigen Fällen kann es notwendig sein, die Ohrspeicheldrüse herauszuschneiden, um den Ohrspeicheldrüsenlymphknoten zu lokalisieren.

Hier ist ein Beispiel für eine Ohrspeicheldrüse, die aus einem Ochsen herausgeschnitten wurde, bei der der Lymphknoten in die Speicheldrüse eingebettet und vor der Drüsenentfernung nicht sichtbar war. Weitere Informationen zur Identifizierung ausgewählter Lymphknoten finden Sie im Hauptmanuskript. Sobald die Lymphknoten entnommen wurden, können Sie die Schnitte zur Konservierung herausschneiden.

Verwenden Sie ein Skalpell oder ein Autopsiemesser, entfernen Sie einen Abschnitt des Lymphknotens und machen Sie einen sagittalen Schnitt, um den Lymphknoten zu öffnen. Untersuchen Sie das Innere des Lymphknotens, insbesondere bei Proben infizierter Tiere, und suchen Sie nach Asymmetrien, Läsionen, Farbunterschieden usw. In diesem präskapularen Lymphknoten des Rinders sind mehrere Merkmale mit bloßem Auge sichtbar.

Dazu gehören Follikel, in denen sich B-Lymphozyten befinden, und tiefe kortikale Einheiten, in denen sich T-Zellen befinden. Diese Gründe erscheinen dunkler als die Marknebenhöhlen, die heller sind. Hier ist ein weiteres Beispiel für einen nicht infizierten Lymphknoten dargestellt.

Dieser Lymphknoten stammt von einem jüngeren Bison. Beachten Sie, dass die Follikel in diesem Beispiel weniger ausgeprägt sind. Um Gewebe für die Verarbeitung zu schneiden, besteht eine Möglichkeit darin, kleine Gewebestücke von jedem Lymphknoten mit einem Skalpell für die anschließende RNA-Rückgewinnung zu sammeln.

Eine große Herausforderung beim Vergleich von Expressionsprofilen zwischen Proben ist jedoch die Größe großer tierischer Lymphknoten im Vergleich zu einem Mauslymphknoten, der für die RNA-Extraktion leicht als Ganzes extrahiert werden kann. Dies hat zur Folge, dass kleine Gewebeschnitte das Profil der Zellen über einem Lymphknoten nicht gleichmäßig erfassen. Anstatt Zellen quer über das Profil eines Lymphknotens zu erfassen, schneidet man einen tortenförmigen Keil aus dem Lymphknoten heraus, schneidet ihn in kleine Stücke von nicht mehr als 5 mm Dicke und legt ihn mit einer Pinzette in Röhrchen, die RNAlater enthalten.

Alternativ können Sie Biopsiemethoden verwenden, um Gewebeschnitte aus jedem Lymphknoten zu entfernen. Wählen Sie das Stanzbiopsie-Tool, wenn Sie bestimmte Schnitte, wie z. B. bestimmte Follikel, aus dem Knoten entnehmen und dann mit einer Pinzette an RNAlater übertragen möchten. Sobald die Proben in RNAlater übertragen wurden, übertragen Sie sie zurück ins Labor und lagern Sie sie über Nacht bei 4 Grad Celsius, um eine Durchdringung des Gewebes zu ermöglichen.

Anschließend überschüssige RNAlater abbauen und Gewebeproben bei 80 Grad Celsius lagern. Ein Vorteil der Verwendung von RNA-Konservierungslösung ist, dass weder bei der Autopsie noch bei der Entnahme von Proben aus dem Feld flüssiger Stickstoff benötigt wird. Vor dem Zugang zu den Proben das Trizol-Reagenz zur Homogenisierung in die Röhrchen voraliquotieren.

Nachdem die Proben aus dem Gefrierschrank genommen wurden, übertragen Sie sie sofort in das Trizol-Reagenz zur anschließenden Verarbeitung, basierend auf den Empfehlungen des Herstellers. Hier wird ein Stück von 50-100 mg Gewebe auf das Trizol-Reagenz übertragen. Begrenzen Sie das Auftauen vor der Zugabe von Trizol so weit wie möglich.

Die Lagerung auf Trockeneis kann verwendet werden, wenn mehrere Proben zur Verarbeitung aus dem Gefrierschrank entnommen werden. Legen Sie die Röhrchen auf den Homogenisator und homogenisieren Sie sie mit dem Trizol-Reagenz. Hier wird eine zweiminütige RNA-Extraktionseinstellung verwendet.

Wenn Sie fertig sind, prüfen Sie, ob es trüb aussieht. Wiederholen Sie den Vorgang bei Bedarf. Befolgen Sie das Protokoll des Herstellers, um wässrige und organische Schichten für jede Probe zu erzeugen.

Entfernen Sie die obere klare wässrige Phase mit einer Pipettenspitze. In ein neues Mikrozentrifugenröhrchen umfüllen. Mischen Sie anschließend mit einem gleichen Volumen von 100% Ethanol.

Gründlich mischen. Die Röhre erscheint oft trüb. Übertragen Sie die Flüssigkeit mit einer Mikropipettenspitze in eine kommerzielle Spin-Säule auf Siliziumdioxidbasis, um Ihre RNA weiter zu reinigen und dann zu eluieren.

Um die RNA-Qualität zu beurteilen, laden Sie ein oder zwei l der eluierten RNA-Probe zur Analyse in ein Spektralphotometer. Nach Abschluss des Verfahrens beobachten wir Absorptionsverhältnisse von etwa zwei für das Verhältnis 260-280 und das Verhältnis 260-230, was auf eine hohe Reinheit mit minimaler chemischer Verschleppung hinweist. Eine Phenolkontamination wäre durch eine Abnahme des Absorptionsverhältnisses von 260-230 nm zu beobachten.

Bei der Autopsie bei Tieren wie Bisons beobachteten wir einen Zeitraum von mindestens 20 Minuten zwischen der Euthanasie und der Übergabe der ersten Gewebeprobe an das Konservierungsmittel. Im Gegensatz dazu können Lymphknoten von Mäusen nach der Euthanasie innerhalb weniger Minuten entfernt und konserviert werden. Daher waren wir daran interessiert, das Abbauprofil von Lymphknoten im Zeitverlauf zu charakterisieren.

Im Hauptmanuskript haben wir auch eine Zusammenfassung der RNA-Stabilitätsprofile in einer Reihe anderer Gewebetypen zusammengestellt, die in anderen Publikationen getestet wurden. In repräsentativen Experimenten, die mit Bison-Lymphknoten durchgeführt wurden, war die RNA-Stabilität über den Verlauf einer Stunde nach der Euthanasie relativ konstant. Hier zeigen wir ein Gelbild der Gesamt-RNA, die aus Stücken des supramammären Lymphknotengewebes eines amerikanischen Bisons gereinigt wurde.

Dieser Befund steht im Einklang mit früheren Daten für andere Gewebetypen, die aus der Literatur zusammengestellt wurden. Dies deutet darauf hin, dass Proben von akzeptabler Qualität für die nachgelagerte Analyse der Genexpression auch von anspruchsvolleren Arten wie Bisons und Elchen entnommen werden können. Es ist jedoch wichtig zu verstehen, dass längere Zeiträume zwischen dem Tod und der Probenkonservierung zu Veränderungen in den RNA-Expressionsprofilen führen können, einschließlich einer Zunahme des Abbaus von drei Primzahlen von mRNA-Transkripten.

Daher ist es nach wie vor wichtig, einen schnellen, optimierten Arbeitsablauf für die Geweberückgewinnung zu verwenden, um weitere Verzögerungen zu reduzieren, sobald das Tier für die Autopsie zur Verfügung steht, um die biologisch validesten RNA-Profile zu erhalten. Darüber hinaus weisen wir darauf hin, dass während des gesamten Verfahrens darauf geachtet werden muss, dass während des gesamten Prozesses keine RNA-Verunreinigungen in die Proben gelangen, die über die bereits im Gewebe vorhandenen hinausgehen. Dazu gehört auch die Verwendung von Handschuhen als Teil der sonstigen erforderlichen persönlichen Schutzausrüstung.

Wir aliquotieren auch das RNA-Endprodukt in mehrere Röhrchen, um das Freistauen von RNA-Proben so weit wie möglich zu begrenzen. So können beispielsweise separate Aliquots für die Verwendung in Qualitätskontrolltests gespeichert werden. Zusammenfassend haben wir in diesem Video wichtige Informationen für den Einsatz bei der Identifizierung, Sammlung, repräsentativen Probenahme und Verarbeitung von Lymphknoten für die nachgeschaltete Genexpressionsanalyse bereitgestellt.

Während unser repräsentatives Video mit Beispielen von Rindern und Bisons demonstriert wurde, haben wir auch mit Lymphknoten anderer großer Arten, einschließlich Ziegen und Elchen, gearbeitet. Wir hoffen, dass Sie dieses Video für Ihre Arbeit nützlich finden, egal ob Sie ein Veterinärwissenschaftler sind, der den Einsatz transkriptomischer Methoden in seiner Arbeit in Betracht zieht, oder ein Molekularbiologe, der daran interessiert ist, sich in das Gebiet der Großtierwissenschaften zu wagen.