Paraffin einbetten und dünn schneiden von mikrobiellen Kolonie Biofilmen für die mikroskopische Analyse

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, paraffineingebettete Biofilmschnitte zu generieren, die zur Beurteilung der Verteilung der Genexpression verwendet werden können, wie sie durch die Produktion fluoreszierender Proteine innerhalb intakter nativer Morphologien berichtet wird. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen bei der Erforschung mikrobieller Gemeinschaften zu beantworten, wie z.B. die Expression spezifischer Gene bei der Produktion exopolymerer Substanzen, die im Kontext der nativen Biofilmarchitektur verteilt werden. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Analyse der Genexpression innerhalb der erhaltenen Morphologie von Biofilmquerschnitten ermöglicht und gleichzeitig für nachgelagerte Behandlungen wie das Färben unterschiedlicher Merkmale und hochauflösende Bildgebung wie Konfokal- oder Elektronenmikroskopie zugänglich ist.

Nach der Zubereitung der Agar-Trypton-Lösung gemäß dem Textprotokoll gießen Sie mit einem konischen 50-Milliliter-Röhrchen 45 Milliliter der Lösung in eine 100 Millimeter x 100 Millimeter große quadratische Schale. Lassen Sie den Agar etwa 20 bis 30 Minuten lang erstarren. Gießen Sie eine zweite 15-Millimeter-Schicht auf die erste Schicht, lassen Sie sie dann über Nacht erstarren und verwenden Sie bei Bedarf ein fusselfreies Tuch, um Kondenswasser von den Deckeln zu entfernen.

Als nächstes, um Kolonie-Biofilme zu erkennen, pipettieren Sie nach dem Züchten einer isolierten einzelnen P.Aeruginosa-Kolonie aus einem gefrorenen Bestand gemäß dem Textprotokoll 2,5 bis 10 Mikroliter Zellsuspension auf eine mittelgroße Zweischichtplatte. Die Völker können bis zu vier Tage lang im Dunkeln bei 25 Grad Celsius und 80 bis 100 % relativer Luftfeuchtigkeit inkubiert werden. Gießen Sie vorsichtig 15 Milliliter der Agarlösung über das Wachstumsmedium und die Kolonie und lassen Sie den Agar fünf Minuten lang bei Raumtemperatur ein Gel bilden.

Schneide dann mit einer scharfen Rasierklinge ein quadratisches, dreilagiges Futter, bei dem die Kolonie zwischen den oberen beiden Schichten laminiert ist. Wenn Sie mehrere Proben vorbereiten, stellen Sie sicher, dass jedes Spannfutter auf eine vergleichbare Größe zugeschnitten ist. Entfernen Sie vorsichtig überschüssiges Agar aus dem koloniehaltigen Chuck.

Befeuchten Sie dann den flachen Kopf eines Spatels mit PBS oder Wasser und führen Sie ihn vorsichtig zwischen die obere und untere Schicht des Agars ein. Übertragen Sie die laminierte Kolonie sofort in eine Einbettkassette, die mit einem chemikalienbeständigen Markierungsstift beschriftet ist. Legen Sie die Einbettkassette in einen Glas-Dia-Versandbeutel, der das zuvor vorbereitete Fixiermittel enthält.

Verarbeiten Sie die Proben. Waschen Sie sie mit 1X PBS zweimal für jeweils eine Stunde. Die besten Ergebnisse erzielen Sie, wenn Sie die Homogenisierung der Reagenzien mit der niedrigen Einstellung der Schleuderfunktion eines automatischen Gewebeprozessors automatisieren.

Um die Proben einzubetten, füllen Sie eine Wachsform mit geschmolzenem Paraffinwachs, das auf 55 Grad Celsius erhitzt wird, und verwenden Sie dann einen erhitzten flachen Spatel, um das infiltrierte Spannfutter schnell von der Einbettkassette in die Wachsform zu übertragen, wobei Sie sicherstellen, dass das Spannfutter parallel zum Boden der Form aufliegt. Lassen Sie das Wachs über Nacht bei vier Grad Celsius erstarren. Proben, die aus festem Wachs geformt wurden, können auf unbestimmte Zeit bei dieser Temperatur gelagert werden.

Sobald das Wachs erstarrt ist, entfernen Sie die Probe aus der Form und verwenden Sie eine Rasierklinge, um überschüssiges Wachs aus der Umgebung der Probe zu entfernen. Lassen Sie etwas Wachs von einem Ende der Probe ausgehen, das zum Einklemmen in das Mikrotom verwendet werden kann. Es ist wichtig, die in Wachs eingebettete Probe so zu trimmen, dass ihre Form die Entnahme glatter linearer Bänder erleichtert.

Kleine Unvollkommenheiten beim Beschneiden können zu Artefakten im Farbband führen und die Integrität des Abschnitts beeinträchtigen. Als nächstes erhitzen Sie ein Wasserbad auf 42 Grad Celsius. Klemmen Sie dann die Probe in das Mikrotom ein, wobei die Oberfläche der Kolonie senkrecht zum Rand der Klinge ausgerichtet ist.

Trimmen Sie die Probe in 50-Mikrometer-Intervallen, bis die gewünschte Ebene der Kolonie erreicht ist, aus der die Schnitte mit einem Mikrotom entnommen werden, das auf eine Schnittgeschwindigkeit von 75 bis 80 U/min und einen Abstandswinkel von sechs bis 10 Grad eingestellt ist. Schneiden Sie ein Band aus der gewünschten Anzahl von 10 Mikrometer dicken Abschnitten ab. Löse dann mit einem Pinsel mit feiner Spitze das Band von der Klinge.

Übertragen Sie nun mit einer Pinzette oder einem Tropfen Wasser an der Spitze einer Pasteurpipette das Band vorsichtig in das Wasserbad. Führen Sie sofort einen Objektträger in das Wasserbad ein und positionieren Sie ihn in einem 45-Grad-Winkel unter dem Band. Berühren Sie den schmalen Rand des Farbbands mit der Folie direkt unter dem mattierten Etikett.

Das Farbband sollte haften. Ziehen Sie die Rutsche aus dem Wasserbad und stellen Sie den Winkel so ein, dass sie senkrecht zur Wasseroberfläche steht, damit das Band entlang seiner Länge flach an der Rutsche anliegt. Vermeiden Sie es, überschüssiges Wasser unter dem Farbband einzuschließen.

Stellen Sie den Objektträger vorsichtig auf ein saugfähiges, fusselfreies Gewebe, das überschüssiges Wasser aus dem Schnitt ableitet. Legen Sie dann die Folie auf ein Papiertuch und lassen Sie sie über Nacht im Dunkeln bei Raumtemperatur trocknen. Erhitzen Sie eine gehauchte Kochplatte auf 45 Grad Celsius und legen Sie die Schiene für 30 bis 60 Minuten auf die Platte.

Das Wachs wird halbgeschmolzen und drückt sich gegen den Objektträger ab. Heben Sie den Objektträger vorsichtig von der Heizplatte und legen Sie ihn etwa eine Minute lang flach auf eine glatte, ebene Oberfläche mit Raumtemperatur, bis das Wachs fest wird. Stellen Sie sicher, dass das geschmolzene Wachs nicht zu beiden Seiten des Objektträgers zieht.

Entwachsen Sie die Objektträger in einem Glas-Objektträger-Versandbehälter in vier Waschgängen mit Clearingmittel für jeweils fünf Minuten. Verwenden Sie einen Buchner-Aspirator, um die Lösung zwischen den Wäschen zu entfernen. Verwenden Sie 100% Ethanol, um die Objektträger dreimal für jeweils eine Minute zu waschen.

Dann, nach dem Rehydrieren der Objektträger gemäß dem Textprotokoll, montieren Sie die Abschnitte sofort in ein tris-gepuffertes Einbettmedium und bringen Sie ein Deckglas an. Der Overlay-Agar um den Abschnitt reagiert nicht mit dem Fixiermittel und haftet daher nicht an der Mangoldfolie. Dieser Agar kann sich während der Rehydrierung lösen und den Schnitt beschädigen, daher sollte darauf geachtet werden, dass die Lösung während der Rehydrierung nicht gerührt wird.

Lassen Sie das Einbettmedium über Nacht bei Raumtemperatur polymerisieren. Verwenden Sie nach der Polymerisation klaren Nagellack, um das Deckglas auf dem Objektträger zu versiegeln. Lagern Sie die versiegelten Objektträger schließlich unbegrenzt im Dunkeln bei vier Grad Celsius.

Während die DIC-Bildgebung mit einem 40-fachen Ölimmersionsobjektiv ausreichen kann, um einige morphologische Merkmale von Biofilm-Dünnschliffen zu zeigen, bietet die Fluoreszenzmikroskopie von Stämmen, die so konstruiert sind, dass sie fluoreszierende Proteine konstitutiv exprimieren, eine verbesserte Visualisierung der zellulären Verteilung innerhalb der Proben. Wie in diesen Panels gezeigt, können Bilder einzelner Abschnitte zusammengefügt werden, um einen Querschnitt der gesamten Kolonie zu erzeugen und einen Kontext für die Lokalisierung von Strukturmerkmalen innerhalb der Gesamtmorphologie auf makroskopischer Ebene zu liefern. Die Verwendung eines Stammes, der so konstruiert wurde, dass er fluoreszierendes Protein unter der Kontrolle eines spezifischen Promotors exprimiert, ermöglicht die Visualisierung der Verteilung der Genexpression.

Darüber hinaus können Kolonien auf einem Medium gezüchtet werden, das Farbstoffe enthält, oder Farbstoffe können nach dem Schneiden zu färbenden Polysacchariden hinzugefügt werden. Schließlich können Proben auch mit Hilfe der Transmissionselektronenmikroskopie, wie hier vorgestellt, präpariert und mit höherer Auflösung abgebildet werden. Wenn Sie dieses Verfahren ausprobieren, ist es wichtig, die Agilität der Proben und das Potenzial zu berücksichtigen, fluoreszierende und strukturelle Artefakte entweder durch Fixierung, Schnitt oder Rehydrierung einzuführen, die Ihre Interpretation der Daten beeinflussen können.

Dieses Verfahren ermöglicht eine quantitative Bildanalyse, wie z.B. die Korrelation der Expressionsprofile von fluoreszierenden Reportern mit morphologischen Merkmalen und der Z-Achse eines Biofilms. Dieses Protokoll kann auf verschiedene Arten von biofilmbildenden Mikroben mit medizinischer und industrieller Bedeutung angewendet werden, wie z. B. Pseudomonas aeruginosa, Vibrio cholerae und Bacillus subtilis. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Kolonie-Biofilme züchtet und vorbereitet, um sie durch Paraffineinbettung zu schneiden.