Name: Ein Microbiomechanical-System für das Studium Varizen-Bildung und Erholung in zentralen Neuronen Axone (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Erfahren Sie, wie ein druckbasiertes Fluid-System wiederholbare Varizen in kultivierten Hippocampus-Neuronen induziert. Diese Methode erlaubt die Untersuchung mechanischer Stressantworten und neuronaler Plastizität für Hirnverletzungsforschung.

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Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den nationalen Institute der Gesundheit Tier Verwendung Richtlinien durchgeführt. Diese Arbeit wurde zum Teil durch Zuschüsse aus dem National Institutes of Health (R01NS093073 und R21AA024873), C. Gu unterstützt.

Alle nachfolgend beschriebene Methoden wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) von der Ohio State University genehmigt.
(1) Deckglas Vorbereitung
<ol><li>Legen Sie einen oder mehrere Kisten mit 12 mm oder 25 mm Deckgläsern in ein Becherglas mit 70 % Salpetersäure und inkubieren Sie Deckgläsern bei Raumtemperatur über Nacht. Hinweis: Waschen Sie die 25 mm Deckgläsern im gleichen Becher als 12 mm Deckgläsern nicht. Es ist besser, sie separat zu waschen.</li>
	<li>Übertragen Sie alle Deckgläsern in 4 L Becher gefüllt mit 2,5 L DdH2O und schütteln Sie den Becher mit den Deckgläsern für 1 h bei 100 u/min. Verwenden Sie Gummibänder die Becher beim Schütteln zu halten. Wiederholen Sie das Spülen mit frischen 2,5 L DdH2O viermal.</li>
	<li>Übertragen Sie gereinigte Deckgläsern auf eine trockene Flasche mit einem Metalldeckel. Backen Sie die Deckgläsern in einem Ofen bei 225 ° C für 6 h und auf Raumtemperatur abkühlen lassen. Hinweis: Die 25 mm-Deckglas ist anfällig für Bruch. Deckgläsern eins nach dem anderen zu trennen und an der Luft trocknen, dann in einem Ofen zu backen.</li>
	<li>Lagern Sie die getrocknete und gereinigten Deckgläsern bei Raumtemperatur bis zur Verwendung in einem sterilisierten Plastikbehälter.</li>
	<li>
Bestreichen Sie die Deckgläsern wie folgt:
	<ol>
<li>Bereiten Sie frische Beschichtungslösung in ein Zentrifugenröhrchen.</li>
		<li>Platzieren Sie jedes Deckglas in einem Brunnen einer 24-Well (oder 6-Well) Platte. Platz 30 (oder 100) µL des Deckglases Beschichtungslösung (Tabelle 1) auf eine 12 mm (oder 25 mm) Deckglas und Wirbel. Fügen Sie 1 mL sterile Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS, Gewebekultur Grade) zum Brunnen. Diese Platten können sofort verwendet oder bei 4 ° C in sterilen PBS für bis zu einer Woche gelagert werden.</li>
		<li>Am Tag der Dissektion entfernen Sie die PBS. An der Luft trocknen Sie und legen Sie die Platten unter UV-Licht (30W) für 2-4 h. Hinweis: Der letzte Schritt sollte mit UV-Licht auf in eine Zelle Kultur Laminar-Flow Haube abgeschlossen sein. Die Tür der Haube sollte leicht angehoben werden, um Luftstrom zu ermöglichen, für die Trocknung der Deckgläsern.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Präparation, Dissoziation und Kultur der Hippocampal Neuronen aus Schwangere Maus/Ratte
<ol><li>
Dissektion und Dissoziation des hippocampal Neuronen für Kultur
	<ol>
<li>Protease Enzymlösung (3 mg/mL Protease 23 in SLDS, Tabelle 1) Auftauen und Vorwärmen Beschichtung Medien (Tabelle 2) bei 37 ° C.</li>
		<li>Hippocampus zu sezieren und Spülen mit SLDS, nach den Methoden, die in früheren Publikation14beschrieben. Hinweis: Vier hippokampi bieten genügend Zellen für einen 24-Brunnen oder eine 6-Well-Platte.</li>
		<li>Entfernen Sie SLDS zu, fügen Sie 2 mL Enzymlösung Protease und inkubieren Sie die Probe bei 37 ° C, 5 % CO2 für 15 min.</li>
		<li>Waschen Sie der Hippocampus Explantaten mit 5-10 mL Beschichtung Medium zweimal. Hinzugeben Sie 5 mL Medium Plattieren. Hippocampale Explantaten in Einzelzellen zu distanzieren, erzeugen einen kleinen Wirbel mit einer Pipette mit einer 1-mL-Kunststoff-Spitze. Pipette rauf und runter ca. 40 Mal, vermeiden die Bildung von sauerstoffbläschen, bis die Lösung trüb wird und keine großen Stücke des modellabhängigen bleiben. Hinweis: Denken Sie daran, einige Medien während Waschungen zu verlassen, der Hippokampus Explantaten während des gesamten Prozesses in das Medium eingetaucht bleiben sollen.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Zellen bei 1.125 x g für 3 min. Entfernen des Überstands mit den Zellen in den Medien überflutet. Aufzuwirbeln Sie die Zellen in 145 mL Plattieren Medien. Fügen Sie 1 mL/Well die Zellsuspension auf einer 24-Well-Platte (3 mL/Brunnen, ein 6-Well-Platte). Hinweis: 145 mL Plattieren Medien wird verwendet, um eine Zellsuspension zu produzieren, die eine niedrige Zelle Dichte aufweist. Dieser Band ermöglicht die Beschichtung von Zellen in sechs 24-Well-Platten, acht 6-Well-Platten oder verschiedene Kombinationen von 24 oder 6-Well Platten abhängig von den Experimenten durchgeführt werden. Jede Vertiefung des 24-Well-Platte wird etwa 3 x 104 Zellen9haben.</li>
		<li>Brüten Sie die Zellen in den Überzug Medien bei 37 ° C, 5 % CO2 für 2-4 h, dann entfernen Sie alle Beschichtung Medien und ersetzen Sie es mit frischen Wartung Medien.</li>
		<li>Nach 2 Tagen (2 Tage in Vitro, 2DIV), ersetzen Sie die Hälfte der Medien mit 2 µM Ara-C (Arabinosylcytosine) aufgelöst in Wartung Medien das Wachstum von Fibroblasten, Endothelzellen und Glia-Zellen hemmt. Ersetzen Sie nach der Freilegung Zellen, Ara-C für zwei Tage die Medien mit frischen Wartung Medien.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Transfektion zur Visualisierung der Zellmorphologie Hinweis: Transfizieren Sie Zellen mit fluoreszierenden Konstrukte des grün fluoreszierenden Proteins (GFP), gelb fluoreszierenden Proteins (YFP), mCherry, etc. , die Morphologie einzelner Neuronen zu beleuchten.<ol>
<li>Verdünnen Sie die Konstrukte ab Lager (1 µg/µL) in Opti-MEM Media (0,8 µg des Konstrukts in 50 µL der Opti-MEM Media) und Wirbel. 1 Konstrukt Verdünnung für jedes gut vorbereiten. Hinweis: Eine 24-Well-Platte erfordert 0,8 µg des Konstrukts in 50 µL der Opti-MEM-Medien. Eine 6-Well-Platte erfordert 2,4 µg des Konstrukts in 150 µL Opti-MEM-Medien.</li>
		<li>Verdünnen Sie Liposomen-vermittelte Transfektion Reagenz in Opti-MEM Media (1,5 µL des Transfection Reagens in 50 µL der Opti-MEM Media) und Wirbel. 1 Transfektion Verdünnung für jedes gut vorbereiten. Hinweis: Eine 24-Well-Platte erfordert 1,5 µL Transfection Reagens in 50 µL der Opti-MEM-Medien. Eine 6-Well-Platte erfordert 4,5 µL Transfection Reagens in 150 µL des Opti-MEM Media.</li>
		<li>Bereiten Sie eine 1:1 Mischung (100 µL) des Konstrukts im Opti-Mem Media und Transfection Reagens in Opti-MEM Media und Wirbel. Inkubieren Sie die Mischung bei Raumtemperatur für 20 min. Hinweis: Pro Bohrloch sollte etwa 100 µL Lösung mit Konstrukt, Transfection Reagens und Opti-MEM Media, wenn mit einer 24-Well-Platte (300 µL für 6-Well-Platte).</li>
		<li>Die Hälfte der Medien (500 µL für 24-Well-Platte, 1,5 mL für 6-Well-Platte) aus jedem Brunnen zu entfernen und dieses Medium in einer sauberen konischem Rohr übertragen. Halten Sie diese Röhre im Inkubator. Fügen Sie 100 µL Gemisch (Schritt 2.2.3) die restlichen Medien in den Brunnen. Lassen Sie die Zellen, die bei 37 ° C für 20-30 min inkubieren.</li>
		<li>Während der Inkubation (Schritt 2.2.4) fügen Sie 1 Volumenteil frische Wartung Medien Medien in das konische Rohr (Schritt 2.2.4 hinzu). Legen Sie die Mischung in den selben Inkubator (37 ° C und 5 % CO2).</li>
		<li>Entfernen Sie nach der Inkubation alle Medien, die die Transfektion Lösung aus dem Brunnen zu und ersetzen Sie es mit dem 1:1 Mischung aus alten und frischen Wartung Medien in das konische Rohr (Schritt 2.2.5). Hinweis: Abhängig von der Größe der Konstrukte können Zellen beginnen mit dem Ausdruck innerhalb von 12 h; für größere Konstrukte können 3-4 Tage erforderlich sein, bevor der Gipfel Ausdruck der Konstrukte erreicht wird.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Einrichten der Puffing Pipette Apparat
Hinweis: Es gibt fünf grundlegende Komponenten zu diesem Set-up: die Glaspipette, das Rohr der Spritze, der Mikromanipulator und Puffer (Hank). Puffer, die physiologisch relevante Salzkonzentrationen hat könnte in diesem Set-up verwendet werden.
<ol><li>Ziehen Sie eine Borosilikat-Pipette, um 45 µm Durchmesser Öffnung Spitze mit einer Mikropipette Puller und die Angaben in Tabelle 3zu haben. Hinweis: Es wurde festgestellt, dass 45 µm ist eine geeignete Größe für den Durchmesser der Öffnung unter experimentellen Bedingungen Pipette. Geringfügige Abweichungen in der Größe der Öffnung sollte Ergebnisse nicht wesentlich beeinflussen. Es ist wichtig zu beachten, dass größere Abweichungen von dieser Nummer noch arbeiten sollten für Varizen Induktion durch die Höhenverstellung der Spritze, die mit der Pipette über Schläuche verbunden ist, aber dies erfordert eine Rekalibrierung der Druckwert.</li>
	<li>Legen Sie die UN zog Ende der Pipette in dünnen Gummischlauch. Hinweis: Die Schlauch Wand sollte dünn und starre, Flüssigkeitsbeständigkeit, um sicherzustellen, dass die Höhe der Spritze ist direkt proportional zum Druck der Flüssigkeit fließt durch die Pipette mit vernachlässigbaren Widerstand zu minimieren. Der Schlauch sollte nicht mehr als etwa 0,6 m Länge weiter minimieren den Widerstand.</li>
	<li>Verbinden Sie das andere Ende des Schlauches auf einen 10-mL-kunststoffspritze über einen Connector mit einem Zug-Lage Ventil. Hinweis: Die kunststoffspritze muss bei einer Konstanten, messbare Höhe um ein genaues Maß für den angenommenen Druck fließt aus der Pipette zu gewährleisten. Eine Höhe von 190 mm wurde verwendet, da diese sorgt für minimalen Druck sondern zuverlässig Krampfadern in Axone induziert. Anderen Höhenwerte können auch verwendet werden, wenn der Druck dazu führen, die Zellen dass, von dem Deckglas Oberfläche zu lösen. Es wird empfohlen, die gleiche Einstellung während des Experiments zu verwenden.</li>
	<li>Legen Sie die Pipette in Schraube oben Mikromanipulator auf die Pipette in Position zu halten. Die Schraube aus Metall, flache gekrönt mit dem Mikromanipulator Arm befestigt, so dass es hält das UN-zog Ende der Pipette oberhalb wo der Gummischlauch befestigt ist. Winkel der Pipette in einem 45°-Winkel mit der Oberfläche der Neuron-haltigen Deckgläsern. Hinweis: Der Mikromanipulator sollte gebaut werden, so dass die Pipette stattfinden kann, ohne Verengung der Gummischlauch. Der Mikromanipulator darf Bewegung der Pipette in der x-, y- und Z-Richtung, genau innerhalb der Zellbereich zu positionieren. Eine Grafik sowie ein Foto des Geräts erfolgt unter (Abbildung 1).</li>
	<li>Schalten Sie ein Fluoreszenz-Filter, öffnen Sie die Blende und sicherzustellen Sie, dass eine fluoreszierende Stelle kommt durch das Ziel gesehen werden kann. Bewegen Sie die Pipette mit dem Mikromanipulator in eine Position, die reiht sich die Spitze mit dem fluoreszierenden Punkt und senken Sie die Pipette in eine Position direkt über die Höhe der Zelle Kulturschale (35 mm x 10 mm). Sobald sie in der Lage ist, das transmittierte Licht schalten Sie ein und schalten Sie Fluoreszenz aus.</li>
	<li>Mit einer Pinzette, einem Deckglas (mit den Zellen nach oben in Richtung der Pipette) aus hinzufügen der Zellplatte Kultur der Zelle Kulturschale mit etwa 2 mL Hanks Puffer bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Ort der Kulturschale mit dem Deckglas auf den Anwendungsbereich.</li>
	<li>Mit den feinen fokussierknopf und 20 X Objektiv, konzentrieren Sie sich auf einer Ebene über vier volle Umdrehungen über die Zellen (ca. 0,4 mm). Verwenden Sie der Mikromanipulator, um die PIPETTENSPITZE zu positionieren, so dass es konzentriert und in der Mitte, Links von der Ebene gesehen durch die Okulare. Hinweis: Dendriten sind Projektionen, die im gleichen Rahmen wie die Zellkörper sein sollten, die, denen Sie stammen. Axonale Krampfadern zu induzieren, sollte man längere Projektionen vom Zellkörper, medialen und distalen Axone folgen.</li>
</ol>4. Kalibrierung des Drucks der Pipette eine dehnbare Membran-System nutzen
<ol><li>Richten Sie der puffing Pipette Apparat mit den exakten gleichen Parametern wie oben beschrieben über ein System mit einer Microfabricated-Silikon-Membran (500 µm im Durchmesser) und 50 µm dick ein und konzentrieren Sie das Mikroskop auf der Oberfläche der Membran zu. Hinweis: Dieses System wurde entwickelt, um kleine Druckwerte zu messen und eine Erklärung des Systems vor10veröffentlicht wurden. Diese Messung muss nur einmal durchgeführt werden, für Experimente schnaufend, wenn die exaktere gleiche Einstellung der schnaufend verwendet wird.</li>
	<li>Konzentrieren Sie das Mikroskop auf die Arrays mikropunkte (4 µm im Durchmesser) und 10 µm auseinander, gemessen zwischen Zentren. Drehen Sie das Absperrventil und Flüssigkeiten Sie fließen aus der Pipette. Die Auslenkung der Membran als Reaktion auf den Flüssigkeitsdruck mit einem konfokalen Mikroskop zu untersuchen.</li>
	<li>Nutzen Sie ein lineares Modell um den entsprechenden Druck verbunden mit Auslenkung der Membran zu bestimmen. Hinweis: Während einer kürzlich durchgeführten Studie festgestellt, dass eine Durchbiegung w =-3.143 ± 0,69 µm wurde für Spritze Höhe 190 mm erhalten, dies führte zu einen Druck von 0,25 ± 0,06 nN/µm2 aus dem aktuellen Pipette Setup, die innerhalb der physiologischen und pathologischen, allerdings ist die Spritze-Höhe ist nicht der einzige bestimmende Faktor. Andere Faktoren beeinflussen die genaue Druckwert auf die Neuronen, einschließlich Pipette öffnen, Positionierung (Abstand und Winkel) der Pipettenspitze im Vergleich zu den Zellen und auch die Flexibilität der Schlauch4,10.</li>
</ol>5. schnaufend um Krampfadern zu induzieren
<ol><li>Sobald die Pipette in Position ist, konzentrieren Sie sich das Mikroskop auf ein Flugzeug, das eine Zielregion enthält. Positionieren Sie die Zellen und Prozesse in der linken Hälfte des Bildfeld (gesehen von live Aufnahme der Kamera) im Bereich puffing, während die Rechte Hälfte ist außerhalb Bereich schnaufend. Hinweis: Aufgrund von umfangreichen Auswuchs der Axone und Dendriten der Nervenzellen ist es unwahrscheinlich, dass alle Prozesse eines Neurons im gleichen Bereich und puffing sind. Dies ist tatsächlich ein Vorteil von diesem System, das ermöglicht die Prüfung der die lokale Wirkung der schnaufend. Es gibt zwei Arten von schnaufend, die genutzt werden können, um Krampfadern zu induzieren: lange Dauer schnaufend und Puls schnaufend.</li>
	<li>
Schnaufend
	<ol>
<li>Langer Dauer schnaufend<ol>
<li>Positionieren Sie die Spritze in die Höhe 190 mm über das Deckglas mit kultivierten Neuronen4. Beginnen Sie Time-Lapse Imaging Bereich von Interesse mit einer optimierten Belichtungszeit offenbart klare neuronale Morphologie. Erfassen Sie mindestens 15 Frames in einem 2 s-Intervall (30 s gesamt) als Grundlage. Das Intervall kann anhand des Experiments angepasst werden. Bei Frame 16, öffnen Sie wiederum in der Lage Absperrventil der Spritze und lassen Flüssigkeit für 75 Frames (150 s). Drehen Sie bei Frame 75 das Ventil aus, so dass Flüssigkeit fließen Haltestellen. Videoaufnahme zu stoppen. Hinweis: Dies sollte axonalen Krampfadern in Neuronen 7-9 DIV innerhalb von 5-10 s, induzieren während ältere Neuronen Form Krampfadern länger dauern.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Schnaufend Puls (2 s Dauer)<ol>
<li>Positionieren Sie die Spritze in der richtigen Höhe (190 mm). Time-Lapse Bildgebung beginnen und mindestens 15 Frames zu erfassen (30 s) in einem 2 s-Intervall. Öffnen Sie bei Frame 16 das Ventil der Spritze Flüssigkeit fließen lassen und schließen Sie das Ventil nach 2 S. warten 5-20 s (abhängig von der Frequenz zu prüfenden) vor dem Öffnen des Ventils wieder. Wiederholen Sie öffnen und Schließen des Ventils Fluid Impulse zu schaffen, und fahren Sie für einen Gesamtzeitraum von 150-300 s. weiter Zeitraffer imaging für 20 min, die Erholungsphase zu erfassen. Hinweis: Wenn das Intervall ist länger als 10 s, die Impulse induzieren drastisch weniger Krampfadern. In einem 20 s-Intervall können keine Krampfadern durch die Impulse-4induziert werden. Um zuverlässige, konsistente Varizen-Bildung zu erhalten, ist es ratsam, die Spritze Höhe sollte ca. 190 mm. Spritze Höhe und Flüssigkeitsdruck sollte nicht erhöht werden, bis zu einem Punkt, wo Zellen beginnen von der Oberfläche Deckglas abnehmen.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Vor einem Tag voller Einsatz, reinigen die Set-up (Pipette, Schlauch und Spritze) fließt über 10 mL 70 % Ethanol durch das Set-up. Im Anschluss an das Ethanol waschen, 10 mL Hanks Puffer (oder gewünschten Puffer) durch die Einrichtung des Systems für den Einsatz des Tages Prime fließen. Nach der Veredelung Experimente für den Tag, reinigen Sie das Set-up als zuvor beschriebenen mit Ethanol zu verhindern das Wachstum von Schadstoffen über Nacht.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(6) Ergänzend zu Methoden
Hinweis: Die puffing Assay kann mit einer Vielzahl von verschiedenen Techniken kombiniert werden, die im Abschnitt Einführung diskutiert werden. Hier ist der Fokus auf den Kern-Techniken, die am häufigsten zusammen mit der puffing Assay, einschließlich hochauflösender Fluoreszenz Timelapse Bildgebung, Kalzium Imaging und Wiederherstellung Assays verwendet werden. Diese werden nachfolgend erläutert.
<ol><li>
Durchführen Sie hochauflösende fluoreszierende Zeitraffer Bildgebung durch nach dem Protokoll unten
	<ol>
<li>Verfolgen Sie die Bewegung der eindringmittel getaggt Proteine innerhalb der Neuronen mit 100 X Öl-Objektiv. Neuronen sind mit dem richtigen cDNA-Konstrukt transfiziert. Für 150 Frames erfassen (Gesamt 300 s) mit einem 2 s-Intervall. Hinweis: Manchmal wird Multiple-Farbe Zeitraffer Bildgebung durchgeführt, um die Bewegung von mehr als einem eindringmittel getaggt Protein gleichzeitig Bild.</li>
		<li>Generieren Sie eine Glomeruli durch die Video-Aufnahme-Software oder durch ImageJ (NIH). Hinweis: Die Geschwindigkeit und die Richtwirkung des Reisens können bestimmt werden mit Hilfe der Glomeruli. * Sicher festzustellen, die Richtung die Soma aus der Region liegt erfasst. Reisen in Richtung der Soma ist rückläufig, während Reisen abseits der Soma in der axonalen Spitze Anterograde.</li>
		<li>Wiederholen Sie diesen Prozess nach puffing, oder ein Glomeruli mit der Bilderfassung während des puffing Tests erstellt werden kann. Hinweis: Die Auswirkungen der schnaufend auf axonalen Transport von Mitochondrien und synaptischen Proteine wurden in einem aktuellen Papier4gezeigt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Calcium imaging
	<ol>
<li>Fügen Sie 1 µL (für ein 24-Well-Platte) oder 3 µL (für eine 6-Well-Platte) von 5 mM Fluo-4 Uhr zur Kultur Medien in einem gut und bei 37 ° C für 30 min inkubieren.</li>
		<li>Waschen Sie die Zellen zweimal mit 1 mL Hank Puffer. Hinweis: Geladene Neuronen emittieren grün fluoreszieren durch einen FITC-Filter-Set. Loci bezeichnen Regionen spürbar Kalzium in der Zelle. In Kombination mit schnaufend kann eine Zunahme der Intensität (Anstieg der internen Kalziumspiegel) gesehen werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Varizen-Erholung Hinweis: Unmittelbar nach einem puffing Experiment kann eine 20 min Erholung Experiment durchgeführt werden.<ol>
<li>Aufnahmen für 300 Frames (1.200 s) mit einem 4 s-Intervall. Hinweis: Eine Zelle mit löslichen YFP/mCherry/GFP transfiziert sollte zeigen mäßigen Lautstärke (weniger als 50 %) der Erholung bis zum Jahresende die imaging-Sitzung. Axonalen Erholung hängt von einer Reihe von Faktoren, wie z. B. vom Entwicklungsstadium der kultivierten Neuronen4. Dies kann auch mit hochauflösenden Fluoreszenz-Bildgebung und Kalzium Imaging oben beschriebenen kombiniert werden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Das Verfahren des Microbiomechanical Assays ist geradlinig. Es werden zuverlässige Ergebnisse produzieren, wenn alle seine Schritte sorgfältig durchgeführt werden. Es gibt mehrere wichtige Schritte, die, wenn nicht ordnungsgemäß durchgeführt, erfolgreiche Datenerfassung behindern. Die entscheidenden Schritte beginnen oberhalb der tatsächlichen Anwendung des puffing Stimulus. Sorgfältige Dissektion, Kultivierung und Pflege der primäre Neuron Kultur im Vordergrund stehen. Wenn die kultivierten Neuronen nicht gesund sind, r...

Varizen-Bildung oder Schwellung/Sicke, entlang der Axone, ist ein hervorstechendes Merkmal der Neurodegeneration bei vielen Erkrankungen oder Verletzungen des zentralen Nervensystems, einschließlich multipler Sklerose, Morbus Alzheimer, Morbus Parkinson, beobachtet und traumatischen Gehirn Verletzungen1,2. Trotz der erheblichen physiologischen Auswirkungen der axonalen Krampfadern auf Aktionspotential Ausbreitung und die synaptische Übertragung3wie die Krampfadern entstehen, bleibt unbekannt. Vor kurzem, mit einer neu gegründeten Microbiomechanical-Assay auf kultivierten hippocampal Neuronen von Nagetieren, fanden wir, dass mechanische Reize Krampfadern in diesen Neuronen mit höchst faszinierende Funktionen hervorrufen können. Erstens Varizen Induktion ist schnell (< 10 s) und dieser Prozess kann unerwartet rückgängig gemacht werden. Zweitens, Varizen Einleitung hängt von der Stärke schnaufend Druck: je höher der Druck, desto schneller die Einleitung. Varizen Einleitung hängt Drittens neuronalen Alter. Die Axone der jüngere Neuronen scheinen stärker auf die mechanische Beanspruchung im Vergleich zu älteren Neuronen. Vierter, Krampfadern Form entlang der Axone hippocampal Neuronen, während die Dendriten und erste Axon Segmente dieser Neuronen zeigen keine Veränderung unter den gleichen Bedingungen, puffing. So, unsere Studie ergab ein Novum der neuronale Polarität. Diese Erkenntnisse mit dem in-vitro- System sind physiologisch relevanten. Eine in Vivo Modell zeigten für milde traumatische Hirnverletzungen (mTBI) wir, dass axonale Krampfadern in einer Multi-focal Mode im somatosensorischen Cortex der Mäuse, sofort nach dem Schließen-Totenkopf Aufprall, Einklang mit unserem in-vitro entwickelt- Ergebnisse4. Es ist wichtig zu beachten, dass unsere Färbung und Bildgebung der mTBI Mäuse nur eine Momentaufnahme der neuronalen morphologische Veränderungen, seit Durchführung in Vivo Zeitraffer Bildgebung der neuronale Morphologie während eine mechanische Wirkung ist noch nicht möglich.
Diese Flüssigkeit schnaufend System erlaubt uns nicht nur einzigartige Eigenschaften zu mechanischen Stress-induzierte Varizen-Bildung zu erfassen, sondern auch den zugrunde liegende Mechanismus zu bestimmen. Durch das Testen verschiedener extrazellulären Lösungen, Blocker und Öffner der verschiedenen Kandidaten der Mechanosensitive Ionenkanäle und zelluläre Elektrophysiologie, festgestellt wir, dass die Transienten Rezeptor potenzielle kation Kanal Unterfamilie V Bauteil 4 (TRPV4) Kanal, der ist durchlässig für Ca2 + und Na+ und aktiviert durch schnaufend ist hauptverantwortlich für die erste mechanischen Beanspruchung während der axonalen Varizen Bildung4erkennen. Dies wurde noch mit einem SiRNA ko Ansatz bestätigt. Zusammengenommen, diesem neuen Testsystem, die wir mit hippocampal Neuronen Kultur entwickelt haben, ist sehr wertvoll für die Mikromechanische Eigenschaften des zentralen Neuronen, vor allem in Kombination mit anderen Techniken zu studieren.
Dieses mikromechanische System, die, das wir eingerichtet haben, ist einzigartig und unterscheidet sich von den bereits bestehenden Systemen in einigen wichtigen Aspekten. Zuerst erleben die Neuronen in diesem System Out-of-Plane mechanischen Beanspruchung in den Formen der Kompression und Scheren. Während die mechanischen Auswirkungen neuronale Prozesse bleiben an der Oberfläche Deckglas und bewegen sich nicht. Dies unterscheidet sich von anderen experimentellen Systemen, die vor allem bücken und Strecken in der Ebene beteiligt (oder Spannung), zum Beispiel die Durchbiegung der gebündelte Axone wie Saiten5,6 verschieben oder dehnen Axone auf Micropatterned gewachsen Kanäle und dehnbare Membranen7,8. Darüber hinaus obwohl axonale Krampfadern auch in induziert werden können diese Tests wie in unserem Flüssigkeit schnaufend System, den Prozess in diesen Einstellungen dauert viel länger (ab 10 min bis mehreren Stunden6,7,8) und erscheint irreversible. Zu guter Letzt unser System mit lokalen Fluid schnaufend ermöglicht die Untersuchung der räumlichen Eigenschaften der Varizen-Bildung (zB., Dendriten, dendritische Dornen, Soma, axonalen ersten Segmente axonalen Klemmen), neben seiner zeitlichen Eigenschaften. Mit diesem System haben wir mehrere unerwartete und einzigartige Eigenschaften der axonalen Varizen-Bildung, vor allem schnellen Wirkungseintritt langsam Reversibilität und Axon-Dendrit Polarität entdeckt.
Das System, das wir in diesem Papier zu diskutieren ist kompatibel mit vielen Techniken der molekularen und Zellbiologie. Zum Beispiel zur Untersuchung der Auswirkungen von mechanischem Stress auf neuronale Morphologie und Funktion zusammen mit Myelin Coculture, Time-Lapse Bildgebung des Fluoreszenz Resonanz Energietransfer (FRET) und Totalreflexion Fluoreszenz (TIRF) einsetzbar Calcium Imaging und Patch-Clamp-Aufnahme. In diesem Artikel konzentrieren wir uns auf den Kern-Komponenten des Systems. Hippocampal Neuronen Kultur, die Flüssigkeit schnaufend Setup, hochauflösender Zeitraffer Imaging für axonalen Transport und Kalzium Imaging werden Schritt für Schritt unten illustriert.

<table><tbody><tr><td>12 mm Deckgläser&nbsp;</td><td>Warner Instruments&nbsp;</td><td>64-0702</td><td>für 24-Well-Platten&nbsp;</td></tr><tr><td>25 mm Deckgläser&nbsp;</td><td>Fisher Wissenschaftlich&nbsp;</td><td>12-545-102&nbsp;</td><td>für 6-Well-Platte&nbsp;</td></tr><tr><td>Essigsäure</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>A38-212</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysin</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>Kollagen des Rattenschwanzes&nbsp;</td><td>Roche&nbsp;</td><td>11 179 179 001&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>10X PBS&nbsp;</td><td>Nationale Diagnostik&nbsp;</td><td>CL-253</td><td></td></tr><tr><td>Na2SO4</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>S373-500</td><td></td></tr><tr><td>K2SO4</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>P304-500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>Fisher Wissenschaftlich&nbsp;</td><td>BP410-500</td><td></td></tr><tr><td>D-Glukose&nbsp;</td><td>Fisher Wissenschaftlich&nbsp;</td><td>D16-500</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher Wissenschaftlich&nbsp;</td><td>SS255-1</td><td></td></tr><tr><td>Protease-Enzym&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P4032</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>26140</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyruvat&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Gibco&nbsp;</td><td></td><td></td>25030081</tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin 100x (P/S)</td><td>Gibco&nbsp;</td><td></td><td></td>15140122</tr><tr><td>MEM Earle's Salze&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>11090</td><td></td></tr><tr><td>B27 Beilage&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Arabinosylcytosin (Ara-C)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>147-94-4</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM Medien&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>1854313</td><td>Transfektionsreagenz&nbsp;</td></tr><tr><td>Borosilikat-Stäbe&nbsp;</td><td>World Precision Instruments Inc.&nbsp;</td><td>PG52151-4</td><td>für Puffpipette&nbsp;</td></tr><tr><td>Gummischläuche&nbsp;</td><td>Fisher Wissenschaftlich&nbsp;</td><td>14-169-1A</td><td></td></tr><tr><td>10cc Kunststoffspritze und Kolben</td><td>Becton Dickinson&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator&nbsp;</td><td>Sutter Instruments&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl&nbsp;</td><td>Fisher Wissenschaftlich&nbsp;</td><td>S640-3</td><td></td></tr><tr><td>KCl&nbsp;</td><td>Fisher Wissenschaftlich&nbsp;</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>C70-500</td><td></td></tr><tr><td>Zellkulturschale (35 mm x 10 mm)</td><td>Corning&nbsp;</td><td>3294</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Molekulare Sonden</td><td>F14201</td><td>für die Calcium-Bildgebung&nbsp;</td></tr><tr><td>Mito-YFP-Konstrukt&nbsp;</td><td>Takara Bio Inc.&nbsp;</td><td></td><td>für die Zelltransfektion&nbsp;</td></tr><tr><td>YFP-N1 Konstrukt&nbsp;</td><td>Takara Bio Inc.&nbsp;</td><td></td><td>für die Zelltransfektion&nbsp;</td></tr><tr><td>Modell P-1000 Flammender/Brauner Mikropipettenabzieher&nbsp;</td><td>Sutter Instruments&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eclipse TE2000-U Mikroskop&nbsp;</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plan Fluor ELWD 20x Objektiv&nbsp; &nbsp;</td><td>Nikon</td><td>062933</td><td>Objektiv&nbsp;</td></tr><tr><td>Apo TIRF 100x/1.49 Öllinse&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>MRD01991</td><td>Objektiv&nbsp;</td></tr></tbody></table>

ein microbiomechanical-system für das studium varizen-bildung und erholung in zentralen neuronen axone

A Microbiomechanical System for Studying Varicosity Formation and Recovery in Central Neuron Axons

Axonale Krampfadern sind erweiterte Strukturen entlang der Wellen von Axonen mit ein hohes Maß an Heterogenität. Sie sind nicht nur im Gehirn mit neurodegenerativen Erkrankungen oder Verletzungen, sondern auch im normalen Gehirn. Hier beschreiben wir eine neu gegründete mikromechanische System, schnell, zuverlässig und reversibel axonale Krampfadern, induzieren, ermöglicht es uns, die EZB, Varizen-Bildung und heterogenen Proteinzusammensetzung Mechanismen zu verstehen. Dieses System stellt eine neuartige Mittel zur Bewertung der Auswirkungen von Kompression und Shear Stress auf verschiedenen subzelluläre Kompartimente von Neuronen, anders als andere in-vitro- Systeme, die sich hauptsächlich auf die Wirkung von stretching. Vor allem aufgrund der einzigartigen Merkmale unseres Systems haben wir vor kurzem eine neuartige Entdeckung zeigt, dass die Anwendung der unter Druck stehende Flüssigkeit schnell und reversibel axonale Krampfadern durch die Aktivierung eines Transienten Rezeptor potenzielle Kanals hervorrufen kann. Unsere biomechanische System kann bequem in Kombination mit Medikamenten Perfusion, live Cell Imaging, Kalzium Bildgebung und Patch-Clamp-Aufnahme genutzt werden. Daher kann diese Methode für das Studium Mechanosensitive Ionenkanäle, axonalen Transport Verordnung axonalen Zytoskelett Dynamik, Kalzium-Signalisierung und morphologische Veränderungen im Zusammenhang mit traumatischen Hirnverletzungen übernommen werden.

Vor schnaufend, zeigen Axone normalerweise kleine Varizen-Bildung. Folgenden schnaufend mit unseren Normdruck (190 MmH2O Höhe), die Axone Start viele Perlen-wie Krampfadern entwickeln. Die Bildung von Krampfadern ist teilweise reversibel, dargestellt durch Regionen des Axons Rückkehr in ihre bereits aufgeblasen Zustand nach einer 10 Minuten Erholungszeit (Abbildung 2A-B). Nach längerer Zeit der Erholung (&gt; 20 min), einige Axone ...

Dieses Protokoll beschreibt eine physiologisch relevante, unter Druck stehende flüssige Ansatz für schnelle und reversible Induktion von Krampfadern in den Neuronen.

Ein Microbiomechanical-System für das Studium Varizen-Bildung und Erholung in zentralen Neuronen Axone

Axonal varicosities are enlarged structures along the shafts of axons with a high degree of heterogeneity. They are present not only in brains with ...

Das übergeordnete Ziel dieses unter Druck stehenden Flüssigkeitsaufbaus ist es, wiederholbare und konsistente Schwellungen entlang der Axone kultivierter Neuronen zu erzeugen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Hirnverletzung zu beantworten, wie z. B. die Mechanismen hinter subzellulären morphologischen Veränderungen in Neuronen nach einer Verletzung. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Methode konsistente und wiederholbare morphologische Veränderungen hervorruft, die sich im Laufe der Zeit erholen.Dies ist eine sehr wichtige Technik, die wir im Labor entwickelt haben. Dies liegt daran, dass wir das System nicht nur zur Identifizierung molekularer Mechanismen verwenden können, die die durch mechanischen Stress induzierte Axonmorphologieänderung als neue Form der neuronalen Plastizität steuern, sondern das System auch als Screening-Instrument zur Identifizierung neuer Medikamente und der Behandlungsstrategie für leichte oder traumatische Hirnverletzungen. Um dieses Verfahren zu beginnen, legen Sie eine oder mehrere Schachteln mit 12-Millimeter- oder 25-Millimeter-Deckgläsern in ein Becherglas mit 70 % Salpetersäure und inkubieren Sie die Deckgläser über Nacht bei Raumtemperatur.Am nächsten Tag geben Sie alle Deckgläser in ein Vier-Liter-Becherglas, das mit 2,5 Litern doppelt destilliertem Wasser gefüllt ist. Schütteln Sie den Becher mit den Deckgläsern eine Stunde lang bei 100 U/min und vergessen Sie nicht, Gummibänder zu verwenden, um den Becher während des Schüttelns zu halten. Anschließend werden die gereinigten Deckgläser mit dem Metalldeckel in einen trockenen Kolben überführt.Die Deckgläser im Backofen bei 225 Grad Celsius sechs Stunden backen. Lassen Sie sie dann auf Raumtemperatur abkühlen und bewahren Sie sie bis zur Verwendung in einem sterilisierten Plastikbehälter auf. Legen Sie nun ein Deckglas in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte.Geben Sie 30 Mikroliter Deckglas-Beschichtungslösung auf ein 12-Millimeter-Deckglas und schwenken Sie es. Geben Sie anschließend einen Milliliter steriles PBS in jede Vertiefung. Die Platte kann entweder sofort verwendet oder bei vier Grad Celsius in sterilem PBS bis zu einer Woche gelagert werden.Am Tag der Sektion PBS von der Platte entfernen. Trocknen Sie die Platte an der Luft und legen Sie sie zwei bis vier Stunden lang unter UV-Licht. Um die Hippocampus-Neuronen für die Kultur zu dissoziieren, tauen Sie die Protease-Enzymlösung auf und erwärmen Sie das Beschichtungsmedium auf 37 Grad Celsius.Spülen Sie anschließend den präparierten Hippocampus mit SLDS ab. Entfernen Sie es dann, fügen Sie zwei Milliliter Protease-Enzymlösung hinzu und inkubieren Sie die Probe 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Waschen Sie anschließend die Hippocampus-Explantate zweimal mit fünf bis 10 Millilitern Galvanikmittel und fügen Sie fünf Milliliter Plattierungsmittel hinzu.Dissoziieren Sie die Hippocampus-Explantate in einzelne Zellen, indem Sie mit einer Pipette mit einer Ein-Milliliter-Kunststoffspitze einen kleinen Wirbel erzeugen. Pipettieren Sie etwa 40 Mal auf und ab und vermeiden Sie die Bildung von Sauerstoffblasen, bis die Lösung trüb wird und keine großen Explantatstücke mehr übrig sind. Als nächstes zentrifugieren Sie die Zellen drei Minuten lang bei der 1.125-fachen Schwerkraft.Entfernen Sie den Überstand mit den in Medium getauchten Zellen und suspendieren Sie die Zellen wieder in 145 Millilitern Beschichtungsmedium. Geben Sie dann einen Milliliter der Zellsuspension pro Vertiefung auf eine 24-Well-Platte. Inkubieren Sie die Zellen im Beschichtungsmedium bei 37 Grad Celsius für zwei bis vier Stunden.Entfernen Sie anschließend das Beschichtungsmedium und ersetzen Sie es durch frisches Pflegemedium. Ersetzen Sie nach zwei Tagen die Hälfte des Mediums durch zwei mikromolare RSC, die in Erhaltungsmedium gelöst sind, um das Wachstum von Fibroblasten-, Endothel- und Gliazellen zu hemmen. Nachdem Sie die Zellen zwei Tage lang RSC ausgesetzt haben, ersetzen Sie das Medium durch frisches Erhaltungsmedium.Um für die Visualisierung der Zellmorphologie zu transfizieren, verdünnen Sie das Konstrukt aus dem Stamm bei einem Mikrogramm pro Mikroliter in Opti-MEM-Medium und Vortex. Verdünnen Sie dann das Liposomen-vermittelte Transfektionsreagenz in Opti-MEM-Medien und Vortex. Bereiten Sie anschließend für jede Vertiefung eine Konstruktionsverdünnung und eine Transfektionsverdünnung vor.Bereiten Sie als Nächstes eine Eins-zu-Eins-Mischung aus dem Konstrukt und dem Opti-MEM-Medium und dem Transfektionsreagenz sowie dem Opti-MEM-Medium und dem Vortex vor. Inkubieren Sie die Mischung 20 Minuten lang bei Raumtemperatur. Entfernen Sie nach 20 Minuten die Hälfte des Mediums aus jeder Vertiefung und geben Sie dieses Medium in ein sauberes konisches Röhrchen.Bewahren Sie das Röhrchen im Inkubator auf und geben Sie dann 100 Mikroliter der im vorherigen Schritt vorbereiteten Mischung zu dem restlichen Medium in der Vertiefung. Lassen Sie die Zellen 20 bis 30 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Während der Inkubation wird dem Medium in dem konischen Röhrchen ein Volumen frisches Erhaltungsmedium zugesetzt und die Mischung in denselben Inkubator gegeben.Nach der Inkubation werden die Medien, die die Transfektionslösung enthalten, aus den Vertiefungen entnommen und durch die Eins-zu-Eins-Mischung aus altem und frischem Erhaltungsmedium in dem konischen Rohr ersetzt. Führen Sie bei diesem Verfahren die Pipette in den Schraubverschluss des Mikromanipulators ein, um sie an Ort und Stelle zu halten. Schrauben Sie die Metallschraube mit flachem Aufsatz, die am Mikromanipulatorarm befestigt ist, so fest, dass sie das nicht gezogene Ende der Pipette knapp über der Stelle hält, an der der Gummischlauch befestigt ist.Winkeln Sie die Pipette in einem 45-Grad-Winkel mit der Oberfläche des Neurons an, die Deckgläser enthält. Schalten Sie den Fluoreszenzfilter ein. Öffnen Sie die Blende und stellen Sie sicher, dass ein fluoreszierender Fleck durch das Objektiv fällt.Bewegen Sie die Pipette mit dem Mikromanipulator in eine Position, die die Spitze mit dem Fluoreszenzfleck ausrichtet, und senken Sie die Pipette in eine Position knapp über der Höhe der Zellkulturschale. Sobald es in Position ist, schalten Sie das Durchlicht ein und schalten Sie die Blüte aus. Übertragen Sie mit einer Pinzette ein Deckglas mit den Zellen in Richtung Pipette von der Zellkulturplatte in die Zellkulturschale mit 2 Millilitern Hank-Puffer bei Raumtemperatur.Fokussieren Sie mit dem Feinfokusknopf und dem 20-fach-Objektiv auf eine Ebene, die sich etwa vier volle Umdrehungen über den Zellen befindet. Verwenden Sie anschließend den Mikromanipulator, um die Pipettenspitze so zu positionieren, dass sie fokussiert ist und sich in der linken Mitte der Ebene befindet, wie sie durch die Okulare gesehen wird. Sobald die Pipette in Position ist, fokussieren Sie das Mikroskop auf eine Ebene, die den interessierenden Bereich enthält.In der Bildgebung von sieben Div-Neuronen zeigten GFP-transfizierte Hippocampus-Neuronen der Maus ein Axon vor und nach dem Puffen sowie eine anschließende 10-minütige Erholungsphase. Hier ist der Kymograph der Zeitraffer-Bildgebung desselben Neurons. Rote Pfeile zeigen die Krampfadern an, die sich gebildet haben, bis nach 150 Sekunden 190 Milliliter H2O-Puffen, beginnend bei 30 Sekunden.Einmal gemeistert, kann diese Technik in drei Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie Ganzzellaufzeichnung, FRET- und TIRF-Bildgebung im Zeitraffer sowie Kalziumbildgebung durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. die Auswirkungen mechanischer Belastung auf die neuronale und elektrische und Kalziumsignalisierung, den Proteintransport und die Wechselwirkungen. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der phototraumatischen Hirnverletzung, um die molekularen Mechanismen zu erklären, die der Bildung axonaler Varikosität in lebenden Neuronen zugrunde liegen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Experimente zur Untersuchung der Mechanoempfindungen zentraler Neuronen durchführen.

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Research

Forschung

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Neuroscience

Neurowissenschaften

Live-Gram-negative und gram-positive Bakterien können auf Gelatine-beschichteten Glimmer immobilisiert werden und abgebildet in Flüssigkeit mit Atomic Force Microscopy (AFM).

Bakterielle Immobilisierung für Imaging von Atomic Force Microscopy

Dieses Video demonstriert eine Methode zur Verfolgung des axonalen Transports in Motoneuronen mit Hilfe eines mikrofluidischen Kammersystems. Dabei wird embryonales Rückenmarksgewebe von Mäusen in polymerbeschichteten Vertiefungen mit Nährmedium kultiviert, um das axonale Wachstum zu induzieren. Die Bewegung von fluoreszierenden Farbstoff-gefärbten Organellen in der Live-Bildgebung bestätigt den bidirektionalen axonalen Transport.

Verfolgung des axonalen Transports von Organellen in Motoneuronen mit einem mikrofluidischen Gerät

Dieses Video zeigt die Induktion axonaler Varikositäten durch Anwendung mikromechanischer Stimulation auf Neuronen. Das System besteht aus einer Mikropipette, die über einen Schlauch an einer Spritze mit Puffer befestigt ist. Mit Hilfe eines Mikromanipulators wird die Mikropipette über den Neuronen positioniert. Anschließend wird Flüssigkeitsdruck angewendet, um Krampfadern in den Axonen zu induzieren.

Induktion axonaler Varizen mit einem mikromechanischen Stimulus auf Neuronen

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