Ein Microbiomechanical-System für das Studium Varizen-Bildung und Erholung in zentralen Neuronen Axone

Das übergeordnete Ziel dieses unter Druck stehenden Flüssigkeitsaufbaus ist es, wiederholbare und konsistente Schwellungen entlang der Axone kultivierter Neuronen zu erzeugen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Hirnverletzung zu beantworten, wie z. B. die Mechanismen hinter subzellulären morphologischen Veränderungen in Neuronen nach einer Verletzung. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Methode konsistente und wiederholbare morphologische Veränderungen hervorruft, die sich im Laufe der Zeit erholen.

Dies ist eine sehr wichtige Technik, die wir im Labor entwickelt haben. Dies liegt daran, dass wir das System nicht nur zur Identifizierung molekularer Mechanismen verwenden können, die die durch mechanischen Stress induzierte Axonmorphologieänderung als neue Form der neuronalen Plastizität steuern, sondern das System auch als Screening-Instrument zur Identifizierung neuer Medikamente und der Behandlungsstrategie für leichte oder traumatische Hirnverletzungen. Um dieses Verfahren zu beginnen, legen Sie eine oder mehrere Schachteln mit 12-Millimeter- oder 25-Millimeter-Deckgläsern in ein Becherglas mit 70 % Salpetersäure und inkubieren Sie die Deckgläser über Nacht bei Raumtemperatur.

Am nächsten Tag geben Sie alle Deckgläser in ein Vier-Liter-Becherglas, das mit 2,5 Litern doppelt destilliertem Wasser gefüllt ist. Schütteln Sie den Becher mit den Deckgläsern eine Stunde lang bei 100 U/min und vergessen Sie nicht, Gummibänder zu verwenden, um den Becher während des Schüttelns zu halten. Anschließend werden die gereinigten Deckgläser mit dem Metalldeckel in einen trockenen Kolben überführt.

Die Deckgläser im Backofen bei 225 Grad Celsius sechs Stunden backen. Lassen Sie sie dann auf Raumtemperatur abkühlen und bewahren Sie sie bis zur Verwendung in einem sterilisierten Plastikbehälter auf. Legen Sie nun ein Deckglas in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte.

Geben Sie 30 Mikroliter Deckglas-Beschichtungslösung auf ein 12-Millimeter-Deckglas und schwenken Sie es. Geben Sie anschließend einen Milliliter steriles PBS in jede Vertiefung. Die Platte kann entweder sofort verwendet oder bei vier Grad Celsius in sterilem PBS bis zu einer Woche gelagert werden.

Am Tag der Sektion PBS von der Platte entfernen. Trocknen Sie die Platte an der Luft und legen Sie sie zwei bis vier Stunden lang unter UV-Licht. Um die Hippocampus-Neuronen für die Kultur zu dissoziieren, tauen Sie die Protease-Enzymlösung auf und erwärmen Sie das Beschichtungsmedium auf 37 Grad Celsius.

Spülen Sie anschließend den präparierten Hippocampus mit SLDS ab. Entfernen Sie es dann, fügen Sie zwei Milliliter Protease-Enzymlösung hinzu und inkubieren Sie die Probe 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Waschen Sie anschließend die Hippocampus-Explantate zweimal mit fünf bis 10 Millilitern Galvanikmittel und fügen Sie fünf Milliliter Plattierungsmittel hinzu.

Dissoziieren Sie die Hippocampus-Explantate in einzelne Zellen, indem Sie mit einer Pipette mit einer Ein-Milliliter-Kunststoffspitze einen kleinen Wirbel erzeugen. Pipettieren Sie etwa 40 Mal auf und ab und vermeiden Sie die Bildung von Sauerstoffblasen, bis die Lösung trüb wird und keine großen Explantatstücke mehr übrig sind. Als nächstes zentrifugieren Sie die Zellen drei Minuten lang bei der 1.125-fachen Schwerkraft.

Entfernen Sie den Überstand mit den in Medium getauchten Zellen und suspendieren Sie die Zellen wieder in 145 Millilitern Beschichtungsmedium. Geben Sie dann einen Milliliter der Zellsuspension pro Vertiefung auf eine 24-Well-Platte. Inkubieren Sie die Zellen im Beschichtungsmedium bei 37 Grad Celsius für zwei bis vier Stunden.

Entfernen Sie anschließend das Beschichtungsmedium und ersetzen Sie es durch frisches Pflegemedium. Ersetzen Sie nach zwei Tagen die Hälfte des Mediums durch zwei mikromolare RSC, die in Erhaltungsmedium gelöst sind, um das Wachstum von Fibroblasten-, Endothel- und Gliazellen zu hemmen. Nachdem Sie die Zellen zwei Tage lang RSC ausgesetzt haben, ersetzen Sie das Medium durch frisches Erhaltungsmedium.

Um für die Visualisierung der Zellmorphologie zu transfizieren, verdünnen Sie das Konstrukt aus dem Stamm bei einem Mikrogramm pro Mikroliter in Opti-MEM-Medium und Vortex. Verdünnen Sie dann das Liposomen-vermittelte Transfektionsreagenz in Opti-MEM-Medien und Vortex. Bereiten Sie anschließend für jede Vertiefung eine Konstruktionsverdünnung und eine Transfektionsverdünnung vor.

Bereiten Sie als Nächstes eine Eins-zu-Eins-Mischung aus dem Konstrukt und dem Opti-MEM-Medium und dem Transfektionsreagenz sowie dem Opti-MEM-Medium und dem Vortex vor. Inkubieren Sie die Mischung 20 Minuten lang bei Raumtemperatur. Entfernen Sie nach 20 Minuten die Hälfte des Mediums aus jeder Vertiefung und geben Sie dieses Medium in ein sauberes konisches Röhrchen.

Bewahren Sie das Röhrchen im Inkubator auf und geben Sie dann 100 Mikroliter der im vorherigen Schritt vorbereiteten Mischung zu dem restlichen Medium in der Vertiefung. Lassen Sie die Zellen 20 bis 30 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Während der Inkubation wird dem Medium in dem konischen Röhrchen ein Volumen frisches Erhaltungsmedium zugesetzt und die Mischung in denselben Inkubator gegeben.

Nach der Inkubation werden die Medien, die die Transfektionslösung enthalten, aus den Vertiefungen entnommen und durch die Eins-zu-Eins-Mischung aus altem und frischem Erhaltungsmedium in dem konischen Rohr ersetzt. Führen Sie bei diesem Verfahren die Pipette in den Schraubverschluss des Mikromanipulators ein, um sie an Ort und Stelle zu halten. Schrauben Sie die Metallschraube mit flachem Aufsatz, die am Mikromanipulatorarm befestigt ist, so fest, dass sie das nicht gezogene Ende der Pipette knapp über der Stelle hält, an der der Gummischlauch befestigt ist.

Winkeln Sie die Pipette in einem 45-Grad-Winkel mit der Oberfläche des Neurons an, die Deckgläser enthält. Schalten Sie den Fluoreszenzfilter ein. Öffnen Sie die Blende und stellen Sie sicher, dass ein fluoreszierender Fleck durch das Objektiv fällt.

Bewegen Sie die Pipette mit dem Mikromanipulator in eine Position, die die Spitze mit dem Fluoreszenzfleck ausrichtet, und senken Sie die Pipette in eine Position knapp über der Höhe der Zellkulturschale. Sobald es in Position ist, schalten Sie das Durchlicht ein und schalten Sie die Blüte aus. Übertragen Sie mit einer Pinzette ein Deckglas mit den Zellen in Richtung Pipette von der Zellkulturplatte in die Zellkulturschale mit 2 Millilitern Hank-Puffer bei Raumtemperatur.

Fokussieren Sie mit dem Feinfokusknopf und dem 20-fach-Objektiv auf eine Ebene, die sich etwa vier volle Umdrehungen über den Zellen befindet. Verwenden Sie anschließend den Mikromanipulator, um die Pipettenspitze so zu positionieren, dass sie fokussiert ist und sich in der linken Mitte der Ebene befindet, wie sie durch die Okulare gesehen wird. Sobald die Pipette in Position ist, fokussieren Sie das Mikroskop auf eine Ebene, die den interessierenden Bereich enthält.

In der Bildgebung von sieben Div-Neuronen zeigten GFP-transfizierte Hippocampus-Neuronen der Maus ein Axon vor und nach dem Puffen sowie eine anschließende 10-minütige Erholungsphase. Hier ist der Kymograph der Zeitraffer-Bildgebung desselben Neurons. Rote Pfeile zeigen die Krampfadern an, die sich gebildet haben, bis nach 150 Sekunden 190 Milliliter H2O-Puffen, beginnend bei 30 Sekunden.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in drei Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie Ganzzellaufzeichnung, FRET- und TIRF-Bildgebung im Zeitraffer sowie Kalziumbildgebung durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. die Auswirkungen mechanischer Belastung auf die neuronale und elektrische und Kalziumsignalisierung, den Proteintransport und die Wechselwirkungen. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der phototraumatischen Hirnverletzung, um die molekularen Mechanismen zu erklären, die der Bildung axonaler Varikosität in lebenden Neuronen zugrunde liegen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Experimente zur Untersuchung der Mechanoempfindungen zentraler Neuronen durchführen.