Transplantation von Fettgewebe-Derived Stem Cell Blatt, Leckage nach teilweiser Colectomy in einem Rattenmodell zu reduzieren
11. August 2018
Die Vorbereitung und die Transplantation von abgeleitet Fettgewebe Stammzellen (ASC) Blätter auf unzureichend genähten kolorektalen Anastomosen in einem Rattenmodell wird vorgestellt. Diese neuartige Anwendung zeigt, dass ASC Blätter kolorektalen Anastomose Leckage reduziert werden können.
Da sie eine positive Wirkung auf die Gewebeheilung haben, wurden ASC-Blätter in vielen Krankheitsmodellen, wie z.B. beim Myokardinfarkt, getestet. Dieses Experiment zeigt, dass ASC-Blätter intraabdominal verwendet und auf den Darm aufgetragen werden können. Der Hauptvorteil von ASC-Platten besteht darin, dass keine synthetischen Materialien benötigt werden.
Darüber hinaus ist die ASC-Blatttransplantation mit nur wenig Übung relativ einfach durchzuführen. Diese neuartige Anwendung der ASC-Blatttransplantation wurde entwickelt, um Leckagen nach einer Darmresektion zu verhindern, und bietet einen ersten Schritt, zu dem eine neue therapeutische Strategie entwickelt wird. ASC-Blätter, die auf die Darmanastomose aufgetragen werden, haben sich als vielversprechend erwiesen, um Leckagen zu verhindern.
ASC-Blätter können auch auf andere intraabdominale Organe, wie z. B. die Harnwege, aufgetragen werden. Beginnen Sie mit der Präparierung des subkutanen Bauchfettgewebes des Menschen in 0,5 cm große Stücke mit einer sterilen chirurgischen Klinge der Größe 10, einer Adson-Brown-Gewebezange und einer Metzenbaum-Schere. Wiegen Sie die Gesamtmenge des präparierten Gewebes in einer sterilen Glasflasche.
Geben Sie 30 ml Isoliermedium pro Flasche hinzu. Und verdauen Sie das präparierte Fettgewebe in einem Shaker-Inkubator bei 150 U/min und 37 Grad Celsius für eine Stunde. Nach einer Stunde wird die verdaute Gewebelösung in 50-ml-Röhrchen aufgeteilt und die Röhrchen 10 Minuten lang bei 390 g zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wird der Überstand entfernt.
Fügen Sie Medium hinzu, um die Zellpellets zu resuspendieren, und fügen Sie weiteres Kulturmedium hinzu, bis zu 45 ml. Zentrifugieren Sie die kombinierten Zellen fünf Minuten lang bei 390 g und entfernen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie das Zellpellet mit 10 ml Nährmedium.
Und filtern Sie die Zellsuspension durch einen 100-Mikron-Filter. Geben Sie 50 l 3%ige saure Methylenblaulösung zu 50 l Zellsuspension zu den roten Blutkörperchen der Läuse. Nach dem Mischen der Lösung 10 l auf ein Hämozytometer pipettieren und die Zellen zählen.
Die Zellen werden mit einer Dichte von 40000 Zellen pro Quadratzentimeter in einen T175-Kolben mit Nährmedium eingebracht. Und inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius in einer feuchten Atmosphäre mit 5% CO2 für 24 Stunden. Waschen Sie die Zellen am nächsten Tag mit warmer, phosphatgepufferter Kochsalzlösung, um Zelltrümmer zu entfernen.
Ersetzen Sie dann das Medium durch 10 % FBS-Kulturmedium plus frisch hinzugefügtes Ascorbinsäure-2-phosphat und humanen rekombinanten Fibroblasten-Wachstumsfaktor zwei. Inkubieren, bis die Zellen eine Konfluenz von 90 % erreichen. Subkultivieren Sie die Fettstammzellen bei 90 % Konfluenz unter Verwendung einer 0,25 %igen Standard-Trypsin-EDTA-Lösung.
Nach drei bis fünf Minuten neutralisieren Sie die 0,25%ige Trypsin-EDTA-Lösung mit 10 ml Nährmedium. In ein Zentrifugenröhrchen umfüllen und die Zellen acht Minuten lang bei 250 G zentrifugieren. Den Überstand entfernen und die Zellen in 1 ml Kulturmedium resuspendieren. Nach der Zählung der Zellen mit einem Hämozytometer werden die Zellen in T175-Kulturflaschen mit einer Dichte von 8000 Zellen pro Quadratzentimeter plattiert.
Die restlichen ASCs werden vor der weiteren Verwendung in flüssigem Stickstoff mit 10 % Dimethylsulfoxid in Kulturmedium eingefroren. Thermoempfindliche Kulturschalen mit einem Durchmesser von 3,5 cm mit 1 ml fötalem Rinderserum anschwemmen. Stellen Sie dann die Schalen vor der Aussaat mindestens 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in einen Inkubator.
Um die ASC-Adhäsion an der thermoresponsiven Schale zu unterstützen und das Risiko einer vorzeitigen ASC-Blattablösung in Kultur zu verringern, sollte die thermoresponsive Schale vor der Zellaussaat mit fötalem Rinderserum vorbeschichtet werden. Trypsinisieren Sie ASCs wie zuvor, wenn nach der Trypsinisierung Zellklumpen vorhanden sind, filtern Sie die Zellen vor der Zählung durch einen 100-Mikron-Filter. Nehmen Sie die Schalen aus dem Inkubator und geben Sie sie auf eine Warmhalteplatte bei 37 Grad Celsius.
FBS aus der Schale nehmen. Nachdem Sie das Zellpellet in LG DMEM mit 10 % FBS resuspendiert und die Zellen gezählt haben, verdünnen Sie 3,52 mal 10 auf das 6. ASCs in 2 ml Kulturmedium pro Schale, um 400000 Zellen pro Quadratzentimeter in jeder 3,5 cm großen Schale zu säen. Verteilen Sie die Zellen vorsichtig so gleichmäßig wie möglich, indem Sie die Schale leicht schwingen.
Kultivieren Sie dann ASC-Blätter 48 Stunden lang bei 37 Grad Celsius in einer feuchten Atmosphäre mit 5 % CO2. Lassen Sie die Kulturschalen am Tag der Transplantation 40 Minuten vor der In-vivo-Transplantation auf Raumtemperatur abkühlen, um die Ablösung der ASC-Folie zu erleichtern. Entfernen Sie nach dem Abkühlen das Nährmedium und ersetzen Sie es durch 1 ml serumfreies LG DMEM.
Um das Zellblatt zu transplantieren, greifen Sie vorsichtig mit einer atraumatischen Pinzette nach dem Rand des ASC-Blattes und legen Sie die Schalenseite des ASC-Blattes auf die Anastomosenlinie. Eine schonende Handhabung der Platten und die korrekte Platzierung der Platten sind für eine erfolgreiche Transplantation intakter Platten unerlässlich. Dehnen Sie das ASC-Blatt vorsichtig bis ca. 0,25 cm über und unter der Anastomosenlinie aus.
Wickeln Sie das Blatt um den Dickdarm und heben Sie den Dickdarm an, um das ASC-Blatt um die dorsale Seite zu wickeln. Kontrolltiere, die keine transplantierten ASC-Blätter erhielten, wiesen Stuhlleckagen in der Nähe der Anastomosenlinie auf, was durch den weißen Pfeil am dritten postoperativen Tag angezeigt wird. Die Tiere mit transplantierten ASC-Blättern, die durch den schwarzen Pfeil gekennzeichnet sind, zeigten am dritten postoperativen Tag einen verminderten Stuhlaustritt und eine verminderte Abszessbildung.
Das gleiche Ergebnis wurde sieben Tage nach der Operation beobachtet. Dieses Bild zeigt einen repräsentativen Querschnitt der kolorektalen Anastomosenstelle bei einem transplantierten Tier, das mit H und E gefärbt war. Die Blattstruktur konnte an der Anastomosenstelle bis zu sieben Tage postoperativ identifiziert werden. Einmal gemeistert, kann diese Technik in wenigen Minuten durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.
Das ASC-Blatt haftet spontan an der Nullzelloberfläche des Dickdarms, es ist nicht erforderlich, Klebstoff oder Naht zu verwenden, um das ASC-Blatt anzupassen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie ASC-Blätter bei Ratten vorbereitet und auf kolorektale Anastomose transplantiert werden, um Leckagen nach einer partiellen Kolektomie zu verhindern.
Sehen Sie sich das vollständige Transkript an und erhalten Sie Zugang zu Tausenden wissenschaftlicher Videos
Übersicht
Diese Studie beschreibt die Herstellung und Transplantation von aus Fettgewebe stammenden Stammzell-(ASC-)Schichten auf unzureichend genähten kolorektalen Anastomosen in einem Rattenmodell. Die Ergebnisse zeigen, dass ASC-Schichten das Durchsickern an kolorektalen Anastomosen signifikant reduzieren können.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Regenerative Medizin
- Viszeralchirurgie
Hintergrund
- ASC-Blätter wurden in verschiedenen Krankheitsmodellen auf ihre positiven Effekte bei der Gewebeheilung getestet.
- Sie können intraabdominal, auch am Darm, angewendet werden.
- ASC-Blätter benötigen keine synthetischen Materialien und stellen somit eine natürlichere Option für die Heilung dar.
- Die Transplantationstechnik ist relativ einfach und erfordert nur minimale Übung.
Zweck der Studie
- Untersuchung der Verwendung von ASC-Blättern zur Verhinderung von Leckagen nach Darmresektion.
- Entwicklung einer neuen therapeutischen Strategie für die colorektale Anastomosierung.
- Beurteilung der Wirksamkeit von ASC-Blättern bei der Verbesserung der Gewebeheilung im intestinalen Bereich.
Verwendete Methoden
- Herstellung von ASC-Schichten aus Fettgewebe.
- Transplantation von ASC-Schichten auf kolorektale Anastomosen in einem Rattenmodell.
- Beurteilung von Anastomoseleckagen nach der Operation.
- Vergleich der Ergebnisse mit und ohne Anwendung von ASC-Schichten.
Hauptergebnisse
- ASC-Blätter verringerten signifikant das Auftreten von Anastomosenleckagen im kolorektalen Bereich.
- Das Transplantationsverfahren erwies sich als einfach und wirksam.
- Die Ergebnisse stützen das therapeutische Potenzial von ASC-Blättern bei kolorektalen Operationen.
- Es werden weitere Studien empfohlen, um langfristige Ergebnisse und Anwendungen zu untersuchen.
Schlussfolgerungen
- ASC-Schichten stellen einen aussichtsreichen Ansatz zur Verbesserung der Heilung bei kolorektalen Anastomosen dar.
- Diese Studie legt den Grundstein für zukünftige Forschungen zu ASC-Anwendungen in chirurgischen Settings.
- Die Ergebnisse könnten zu besseren Patientenergebnissen bei kolorektalen Operationen führen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die anastomotische Leckage bleibt eine kritische Herausforderung in der kolorektalen Chirurgie, die die Genesung der Patienten direkt beeinträchtigt und die Belastung des Gesundheitssystems erhöht. Die Transplantation von aus Fettgewebe stammenden Stammzellblättern (ASC) bietet einen biologisch basierten Ansatz, um die Gewebeheilung an Anastomosenstellen ohne synthetische Materialien zu verbessern. Dieses präklinische Modell ermöglicht die frühe Bewertung regenerativer Strategien zur Minderung chirurgischer Komplikationen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung der Mechanismen der stammzellvermittelten Gewebereparatur in einem klinisch relevanten Verletzungsmodell.
- Operativer Wert: Bietet ein standardisiertes System zur Beurteilung der parakrinen und immunmodulatorischen Beiträge zur Anastomoseintegrität.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt quantifizierbare histologische und funktionelle Endpunkte zur Beurteilung der Anastomoseheilung und zur Verhinderung von Leckagen.
- Operativer Wert: Ermöglicht die Überprüfung der Reproduzierbarkeit der Zellblattadhäsion und -einarbeitung unter physiologischen Bedingungen.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Demonstriert die Krankheitsrelevanz in einem Nagetiermodell der kolorektalen Anastomose und schließt die Lücke zwischen in-vitro-Befunden und in-vivo-Ergebnissen.
- Operativer Wert: Ermöglicht eine risikoadjustierte Bewertung der Wirksamkeit von ASC-Blättern vor umfangreicheren präklinischen Studien.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Transplantationsmethode mittels ASC-Blättern fügt sich in den Übergang von der Entdeckung zur präklinischen Phase ein und unterstützt die Zielvalidierung sowie die mechanistische Entlastung regenerativer Therapeutika in der gastrointestinale Chirurgie.
- Entdeckungsbiochemie: Ermöglicht die Hypothesenprüfung zur Sekretion trophischer Faktoren durch ASCs und deren immunmodulatorische Wirkung in Gewebeheilungsprozessen.
- Screening: Ermöglicht die Beurteilung der Zellblattqualität, Haftfestigkeit und Biokompatibilität für nachfolgende Anwendungen.
- Analytik: Stellt Leckageereignisse, Abszessbildung und histopathologische Bewertung als quantitative Endpunkte für vergleichende Analysen bereit.
- Translationale Forschung: Schafft ein präklinisches Modell zur Bewertung regenerativer Maßnahmen vor der Übertragung auf Großtiere oder klinische Anwendungen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Stellt eine anpassbare Plattform zur Bewertung zellbasierter Therapien über verschiedene intraabdominale Organsysteme hinweg dar.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verringert die mechanistische Unklarheit bei der stammzellvermittelten Heilung, indem Variablen in einem kontrollierten chirurgischen Modell isoliert werden.
- Operativer Wert: Bietet eine nähte- und klebefreie Transplantationstechnik, die die prozedurale Standardisierung vereinfacht.
- Strategischer Wert: Unterstützt Go/No-Go-Entscheidungen, indem frühzeitige Wirksamkeitssignale für regenerative Ansätze bei chirurgischen Indikationen mit hohen Komplikationsraten bereitgestellt werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht die risikobasierte Priorisierung von ASC-basierten Kandidaten anhand von Ergebnissen funktionaler Gewebereparatur.
Durchführungsaspekte
- Setzt Fachkenntnisse in der Isolierung, Expansion und Bildung von Zellschichten aus adipogenen Stammzellen mittels temperatursensitiver Kultursysteme voraus.
- Hängt vom Zugang zu sterilen chirurgischen Instrumenten, Inkubatoren und Einrichtungen für die histologische Analyse zur Beurteilung der Ergebnisse ab.
- Benötigt standardisierte Zellaussaatdichten und Kulturzeiten, um eine gleichbleibende Qualität der Zellschichten und deren Ablöseeigenschaften sicherzustellen.
- Erfordert Anpassungsüberlegungen, wenn das Modell auf andere anatomische Regionen oder größere Tiermodelle übertragen wird.
- Eingeschränkt durch das kurze Beobachtungsfenster in Nagetiermodellen, das eine Erfassung der langfristigen Umbildung oder funktionellen Integration möglicherweise nicht ermöglicht.
