Name: In vivo fasergekoppelte präklinische konfokale Laser-Scanning-Endomikroskopie (pCLE) von Hippocampus-Kapillaren bei wachen Mäusen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: Erfahren Sie die präklinische konfokale Laser-Scanning-Endomikroskopie zur Untersuchung mikrovaskulärer Dynamik im Hippocampus wacher Mäuse. Diese Methode ermöglicht hochauflösende Bildgebung in beliebiger Tiefe für neurologische Forschung.

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Das Projekt wurde durch einen Research Initiative Award der American Epilepsy Society und einen Preis der Arizona Biomedical Research Commission an S.L.M. sowie durch einen Challenge Grant von Research to Prevent Blindness Inc. an die Abteilung für Ophthalmologie an der SUNY Downstate Health Sciences University, das New York State Empire Innovation Program, finanziert. und weitere Zuschüsse von der National Science Foundation (0726113, 0852636, & 1523614), der Barrow Neurological Foundation, Mrs. Marian Rochelle, Mrs. Grace Welton und Dignity Health SEED Awards sowie von Bundeszuschüssen der National Science Foundation (0726113, 0852636, & 1523614) und des National Institute of Health (Auszeichnungen R01EY031971 UND R01CA258021) an S.L.M. und S.M.C. <span lang="EN-US" style="font-size: 12pt; line-height: 107%; font-family: Calibri, sans-serif; color: rgb(34, 34, 34); background-image: initial; background-position: initial; background-size: initial; background-repeat: initial; background-attachment: initial; background-origin: initial; background-clip: initial;">Diese Arbeit wurde auch vom Office of the Assistant Secretary of Defense for Health Affairs unter Award No. W81XWH-15-1-0138, nach S.L.M..<span lang="EN-US" style="font-size: 12pt; line-height: 107%; font-family: Calibri, sans-serif; color: red; background-image: initial; background-position: initial; background-size: initial; background-repeat: initial; background-attachment: initial; background-origin: initial; background-clip: initial;"> <span lang="EN-US" style="font-size: 12pt; line-height: 107%; font-family: Calibri, sans-serif; color: rgb(34, 34, 34); background-image: initial; background-position: initial; background-size: initial; background-repeat: initial; background-attachment: initial; background-origin: initial; background-clip: initial;">L.-C. wurde durch ein José Castillejo-Stipendium des spanischen Bildungsministeriums unterstützt. Wir danken O. Caballero und M. Ledo für ihre technische Beratung und Unterstützung.

Das Protokoll folgt den NIH-Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren. Alle Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee des Barrow Neurological Institute genehmigt.
1. Stereotaktische Positionierung bei der Kraniotomie
<ol><li>Die Maus wird gewogen und dann mit einem Ketamin-Xylazin-Cocktail (100 mg/kg–10 mg/kg i.p.) betäubt. Stellen Sie sicher, dass das Tier vollständig betäubt ist, indem Sie seine mangelnde Reaktion auf das Einklemmen von Schwanz und/oder Zehen beobachten.</li>
	<li>Legen Sie ein Heizkissen unter die Maus und verwenden Sie ein Rektalthermometer, um die Körpertemperatur während der ersten anästhesierten Implantationsoperation kontinuierlich zu überwachen (Abbildung 2A).</li>
	<li>Tragen Sie Augensalbe auf, um Augentrockenheit zu verhindern.</li>
	<li>Stabilisieren Sie den Kopf des Tieres in einem stereotaktischen Nagetierrahmen, der mit einem Mausadapter ausgestattet ist. Um die Maus im stereotaktischen Rahmen richtig auszurichten, werden die Zähne des Tieres in das Loch der Beißleiste eingesetzt (Abbildung 2A und Abbildung 3A, Punkt g). Ziehen Sie die Nasenklemme fest, bis sie fest sitzt (Abbildung 2A, B und Abbildung 3A, Punkt h). Die Körperhaltung der Maus sollte so gerade wie möglich sein (wie in Abbildung 2A).<ol><li>Sichern Sie den Kopf des Tieres weiter mit Maus-Ohrbügeln mit Kieferhaltermanschetten (Abbildung 2A und Abbildung 3A, Punkt i), um die Jochbeinfortsätze des Schädels fest einzuklemmen. HINWEIS: Nach dem Befestigen sollte der Kopf der Maus keinen horizontalen Bewegungsbereich mehr haben.</li>
	</ol></li>
	<li>Sobald die Maus auf den stereotaktischen Rahmen eingestellt ist (Abbildung 3B, Punkt j), reinigen und sterilisieren Sie die Kopfhaut, indem Sie sie 2-3 Mal mit einem Chlor-Hexedin-Peeling abwischen, gefolgt von einer Alkoholspülung. Tragen Sie dann topisches Lidocain auf den Kopf auf.</li>
	<li>Machen Sie einen Schnitt entlang der Mittellinie von hinten nach vorne (beginnen Sie den Schnitt an der Schädelbasis und schließen Sie ihn zwischen den Augen; 12-15 mm) entlang der sagittalen Mittellinie des Schädels, entweder mit einer feinen Schere oder einer Klinge. Ziehen Sie die Ränder der Kopfhaut mit vier 28-mm-Bulldoggen-Serrefine-Klemmen zurück, um den Schädel freizulegen und den Arbeitsbereich zu maximieren (Abbildung 2B und Abbildung 3C).</li>
	<li>Verwenden Sie ein Skalpell oder einen Mikrospatel (Abbildung 3C), um das Periost bis zu den Rändern des Einschnitts abzukratzen. Verwenden Sie eine gewebetrennende Schere oder Pinzette (Abbildung 3C), um die Muskeln im Nacken vorsichtig zurückzuziehen (Abbildung 2B).</li>
	<li>Trocknen Sie die Oberseite des Schädels mit einem Applikator mit Wattespitze, der mit Alkohol oder 30%igem Wasserstoffperoxid angefeuchtet ist, um die Visualisierung der Schädelnähte zu optimieren. Tragen Sie Kochsalzlösung auf den Schädel auf, sobald das Bindegewebe entfernt wurde.</li>
	<li>Sobald der Kopf der Maus im stereotaktischen Gerät stabilisiert ist, wird eine Spritzennadelspitze (21 G) in den Elektrodenhalter (Abbildung 3B, Punkt l) eingesetzt und der Elektrodenhalter am stereotaktischen Mikromanipulator befestigt, wobei die Nadelspitze auf die Höhe des Schädels abgesenkt wird (Abbildung 2D).</li>
	<li>Passen Sie die medial-laterale Richtung des Schädels an, indem Sie die Höhe des Schädels in einem beliebigen Abstand hinter dem Bregma (d. h. -2,0 mm) und zwei gleiche seitliche Abstände von der Mittellinie auf beiden Seiten des Schädels (d. h. ± 1,5 mm) messen (Abbildung 2D). Streben Sie einen Höhenunterschied zwischen den Stellen an, der weniger als 0,05 mm in dorsal-ventraler Richtung beträgt.<ol><li>Bei einer Größe von mehr als 0,05 mm drehen Sie den Schädel der Maus mit der Beißstange oder positionieren Sie den Kopf der Maus neu, indem Sie die Ohrbügel vorsichtig lösen, den Kopf und die Ohrbügel nach Bedarf seitlich verschieben und dann die Ohrstangen wieder anziehen.</li>
	</ol></li>
	<li>Sobald der Schädel im stereotaktischen Gerät positioniert ist, bestimmen und zeichnen Sie die stereotaktischen Koordinaten der Bregma- und Lambda-Schädelnähte entlang der anteroposterioren (AP), medialen lateralen (ML) und dorsalen ventralen (DV) Achsen auf.</li>
	<li>Identifizieren Sie den Zielpunkt (rechter Hippocampus) mit Hilfe eines stereotaktischen Atlas. Dann finden Sie auf dem Schädel die Zielpunktkoordinaten relativ zum Bregma (AP: -2,7 mm, ML: -2,7 mm) (Abbildung 2E).</li>
	<li>Markieren Sie mit einem chirurgischen Marker vier Ecken eines 1,4 mm x 2 mm großen Bildgebungsfensters auf dem Schädel mit Punkten, die um den Zielpunkt direkt über dem Hippocampus zentriert sind (Abbildung 2F), für die anschließende Kraniotomie.</li>
	<li>Verwenden Sie die chirurgische Markierung, um zwei zusätzliche Punkte zu zeichnen: einen über dem oberen linken Scheitelknochen (Abbildung 2G) und einen weiteren über dem rechten Stirnknochen (Abbildung 2H), um die zukünftige Platzierung von zwei Knochenschrauben (Abbildung 3A, Punkt b) anzuzeigen, die die Kopfkappe (Abbildung 3B, Punkt m) am Schädel verankern werden.</li>
	<li>Verwenden Sie die chirurgische Markierung, um drei weitere Punkte zu zeichnen, die anzeigen, wo die Epidural-EEG-Aufzeichnungselektroden eingeführt werden: ein Punkt, der 1 mm auf jeder Seite der Mittellinie positioniert ist, und ein zusätzlicher Punkt auf der Mittellinie, der 1 mm hinter Lambda positioniert ist (Abbildung 2E, Abbildung 4A und Abbildung 5B).</li>
</ol>2. Einbau der Head-Cap
<ol><li>Bohren Sie mit einem Fräser mit einem Durchmesser von 0,7 mm (Abbildung 3C) vorsichtig zwei kleine Löcher in den Schädel an den Punktpositionen, die die Platzierung der Knochenschrauben anzeigen (siehe Schritt 1.15 oben). Dann nehmen Sie zwei Knochenschrauben (Edelstahl mit Schlitz, Länge: 4 mm; Durchmesser: 0,85 mm), die zuvor zu 70-80 % mit Ethanol desinfiziert wurden, und schrauben Sie sie an den Schädel, um die Stabilität der Kopfkappe zu erhöhen (Abbildung 2I-J und Abbildung 3A, Punkt b).<ol><li>Achten Sie darauf, dass die Schraubenspitzen nicht über die Unterseite des Knochens hinaus in die Schädelhöhle ragen, wodurch eine Schädigung des Gehirns riskiert wird. Beachten Sie, dass sich eine der beiden Knochenschrauben vor den beiden Kopfschrauben und die andere hinter ihnen befindet (Abbildung 2G-J).</li>
	</ol></li>
	<li>Spritzen Sie Kochsalzlösung über den Schädel, um ihn abzukühlen und zu reinigen. Trocknen Sie dann den Schädel vollständig ab und tragen Sie eine dünne Schicht Cyanacrylat um die Schrauben auf.</li>
	<li>Verwenden Sie ein benutzerdefiniertes Ausrichtungsstück (Abbildung 3A, Punkt c), das an das Mikrolaufwerk geklemmt ist, das an dem stereotaktischen Gerät montiert ist (Abbildung 2F-J und Abbildung 3A, Punkt d), so dass die Position der Kopfkappe entlang der Mittellinie ausgerichtet ist, wobei der vordere Grat über dem Bregma liegt. Dieses maßgefertigte Edelstahlstück ist L-förmig (um 90° abgewinkelt) und hat zwei Löcher im Abstand von 4 mm (Abbildung 2F-J und Abbildung 3A, Punkt c).<ol><li>Verwenden Sie den stereotaktischen Manipulator, um das L-förmige Ausrichtungsstück zu positionieren, wobei zwei Schlitzschrauben mit Füllkopf angebracht sind (M1,6 x 0,35 Metrisch grob, 12 mm Länge; Abbildung 3A, Punkt a) über das Bregma legen, bis die Basis der Schrauben flach auf dem Schädel aufliegt, wobei darauf zu achten ist, keinen Druck auf den Schädel auszuüben (Abbildung 2I-J).</li>
	</ol></li>
	<li>Tragen Sie Cyanacrylat gefolgt von Zahnzement auf, um die Basis der Schrauben am Schädel zu befestigen. Achten Sie darauf, dass die Referenzmarken des Bildfensters über dem Hippocampus nicht verdeckt werden (Abbildung 2K).</li>
</ol>3. Bildgebende Fensterkraniotomie
<ol><li>Bohren Sie an jeder Position der Kraniotomie-Referenzmarken, die die Ecken des Bildgebungsfensters anzeigen (siehe Schritt 1.14 oben), ein Gratloch mit einem Durchmesser von 0,7 mm, gefolgt von einer vorsichtigen Abgrenzung des Umfangs des 1,4 mm x 2 mm großen Kraniotomiefensters mit dem Bohrer mit iterativ tieferen Schnitten (Abbildung 2L).</li>
	<li>Achten Sie darauf, nicht zu tief oder mit zu viel Kraft auf den Schädel zu bohren, der dünn und zerbrechlich ist und eine Dicke von ca. 300 μm hat. Sobald der Knochenlappen vollständig ist, hebeln Sie den losen Lappen mit der Spitze eines Skalpells nach oben und achten Sie darauf, die darunter liegende Dura mater nicht zu beschädigen.</li>
	<li>Bedecken Sie das geöffnete Fenster mit Knochenwachs (Abbildung 2M).</li>
	<li>Bohren Sie mit einem Fräser mit einem Durchmesser von 0,9 mm drei Löcher für die zukünftige Platzierung der epiduralen EEG-Elektroden (siehe Schritt 1.15 oben) und achten Sie darauf, die Dura mater nicht zu durchtrennen (Abbildung 2E,L).</li>
	<li>Die drei Löcher mit Knochenwachs bedecken.</li>
	<li>Tragen Sie Cyanacrylat vorsichtig an den Rändern des mit Knochenwachs bedeckten Bildgebungsfensters und der EEG-Löcher auf und achten Sie darauf, die Kraniotomien nicht zu versiegeln (Abbildung 2L).</li>
	<li>Bauen Sie eine Wand aus Zahnzement, die das Bildgebungsfenster und die EEG-Löcher umschließt und mit der zuvor zementierten Kopfkappe verbindet (Abbildung 2M und Abbildung 3B, Punkt m).</li>
	<li>Lassen Sie den Zement mindestens 10 Minuten trocknen.</li>
	<li>Schließen Sie lose Wundränder mit einfachen unterbrochenen Nähten mit 4-0 oder 5-0 schwarz geflochtener Seide (Abbildung 2N und Abbildung 3C).</li>
</ol>4. Nach der Operation
<ol><li>Verwenden Sie einen Applikator mit Wattespitze, um Lidocain-Salbe auf die freiliegende Haut aufzutragen, um das Gefühl am Rand der Wunde zu dämpfen.</li>
	<li>Verwenden Sie einen sterilen Applikator mit Wattespitze, um Neosporin auf die exponierte Haut aufzutragen.</li>
	<li>Entfernen Sie das Tier aus dem stereotaktischen Rahmen (Abbildung 2N).</li>
	<li>Injizieren Sie Ketoprofen (5 mg/kg) IP oder IM zur postoperativen Analgesie.</li>
	<li>Beobachte das Tier, bis es wach ist und sich bewegt (dies geschieht in der Regel innerhalb von Minuten).</li>
	<li>Setzen Sie das Tier in einen warmen Käfig und beobachten Sie seine Genesung, bis es trinkt oder frisst und bereit ist, in den Tierstall gebracht zu werden.</li>
	<li>Kontrollieren Sie das Tier mindestens einmal täglich für etwa eine Woche nach der Operation und achten Sie auf Anzeichen von lustlosem Verhalten und/oder unzureichendem Fressen/Trinken (Abbildung 2O).</li>
</ol>5. Farbstoffinjektion und EEG-Aufzeichnung
<ol><li>Warten Sie mindestens einen Tag nach der Kopfkappenimplantation, bevor Sie mit den Aufnahmen beginnen.</li>
	<li>Legen Sie die Maus in eine schaumfixierende Vorrichtung, die an ihren Körper angepasst ist, innerhalb des stereotaktischen Rahmens (Abbildung 3B, Punkte n und j).</li>
	<li>Befestigen Sie die Kopfkappe (Abbildung 3 B-I, Punkt m) an einer speziellen Montagestange, die am stereotaktischen Rahmen befestigt ist (Abbildung 3A, B, Punkte e und j sowie Abbildung 4A). Der lange Abschnitt von Punkt e (Abbildung 3A,B) sollte eine Länge zwischen 9,4 und 13 mm haben. Befestigen Sie Artikel f (eine Montageplatte mit den Maßen 1,5 cm x 0,5 cm, mit zwei Löchern im Abstand von 4 mm von Mitte zu Mitte) an Artikel e (Bild 3A,B, Artikel e, f und k). Dieses Ausrichtungssystem positioniert die wache Maus während der gesamten Bildgebungssitzungen sicher am stereotaktischen Rahmen (Abbildung 4).</li>
	<li>Setzen Sie die Epidural-EEG-Aufzeichnungselektroden (Abbildung 5A) ein, indem Sie die Masseelektroden (weiße Drähte) in das hintere zentrale Loch und die Aufzeichnungselektroden (rote Drähte) in das vordere linke und rechte Loch (Abbildung 2E, Abbildung 4E und Abbildung 5E) legen. Positionieren Sie jeden der Drähte L-förmig zwischen dem Schädel und der Dura mater (Abbildung 5C), um den elektrischen Kontakt zu optimieren.</li>
	<li>Injizieren Sie die Schwanzvene mit grünem Fluorescein-Lysin-fixierbarem Dextran (0,2 ml/25 g Körpergewicht Fluorescein 5 % w/w), um den Blutfluss innerhalb des Hippocampus zu visualisieren.<ol><li>Um die Erweiterung der zentralen Vena des Mausschwanzes vor der Injektion zu verbessern, wenden Sie eine oder mehrere der folgenden Strategien an: a) Tragen Sie 70%iges Ethanol mit einem Applikator mit Wattespitze auf die zentrale Vene auf; b) Tauchen Sie den Schwanz für 1-3 Minuten in warmes Wasser (35-40 °C); c) Setzen Sie den Schwanz einige Minuten lang einer Heizlampe aus.</li>
		<li>Befestigen Sie den Schwanz der Maus mit zwei Fingern und lokalisieren Sie die zentrale Vene, die direkt unter der Haut liegt. Führen Sie die Nadel (ultrafeine Insulinspritze mit integrierter Nadel 30G) mit der Abschrägung nach oben etwa zur Hälfte bis zu zwei Dritteln vom Schwanzansatz in die Vene ein. Halten Sie die Nadel während der Injektion parallel zum Schwanz.</li>
		<li>Injizieren Sie den Farbstoff langsam und gleichmäßig und achten Sie darauf, dass sich die Position der Nadel oder des Schwanzes nicht verändert. HINWEIS: Beim Drücken des Spritzenkolbens sollte kein Widerstand auftreten.</li>
		<li>Nach Beendigung der Injektion ziehen Sie die Nadel zurück und üben Sie sanften Druck auf die Einstichstelle aus, um das Gefäß zu versiegeln.</li>
		<li>Lassen Sie die Gerinnung zu.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Präklinische konfokale Laser-Scanning-Endomikroskopie (pCLE) in vivo mit faseroptischen Bündeln gekoppelt
<ol><li>Direkt nach der Schwanzveneninjektion (Schritt 5.5.3 oben) klemmen Sie das 300 μm lange, abgeschrägte Glasfaserbündel (mit 5000–7000 3-μm-Fasern in jedem Bündel) in der Abwärtsausrichtung an den beweglichen Arm des stereotaktischen Roboterantriebs.</li>
	<li>Entfernen Sie das Knochenwachs aus der Kraniotomie.</li>
	<li>Entfernen Sie die Dura mit der gebogenen Spitze einer Spritzennadel.</li>
	<li>Bewegen Sie mit dem Roboter-Positionierungssystem zunächst das Faserobjektiv an die entsprechende stereotaktische Stelle anterior-posterior und links-rechts, wobei die Spitze in der z-Achse auf der Oberfläche des Kortex auf Null gestellt wird.</li>
	<li>Initiieren Sie die EEG-Aufzeichnung (Abbildung 5D).</li>
	<li>Initiieren Sie ein konfokales Laserscanning der Rückwand des Faserobjektivs, gefolgt von einem langsamen Absenken des Objektivs in der z-Achse mit den Z-Steuerungen des Roboter-Mikroantriebs, bis es die Zieltiefe im Gehirn erreicht (Abbildung 4C). Sehen Sie sich die Bildgebungsergebnisse in der mikroskopischen Software an, während Sie absteigen.<ol><li>Wenn sich die Faserspitze innerhalb des X-Y-Z-Aufzeichnungsbereichs des Ziels befindet und zwei oder mehr Schiffe in das Sichtfeld des Bildfensters gelangen, stoppen Sie den Sinkflug und starten Sie die Videoaufzeichnungen. Erhalten Sie Live-Zeitrafferfilme des Blutflusses bei 11,7 Hz mit der Bildgebungssoftware von Cellvizio Lab. (Höhere Geschwindigkeiten können mit einem kleineren Sichtfeld erreicht werden). Die Aufzeichnungen können jeweils 4-5 Stunden dauern, bei Bedarf auch an aufeinanderfolgenden Tagen.</li>
	</ol></li>
	<li>Füttern Sie das Tier während der Aufzeichnungen mit einer 10-ml-Spritze mit abgeschrägtem Silikonschlauch, der an der Spitze der Nadel befestigt ist, indem Sie regelmäßig Paste aus mit Wasser gemahlenen Mäusepellets verabreichen.</li>
	<li>Beenden Sie am Ende der Bildbearbeitungssitzung die Aufzeichnungen.</li>
	<li>Entfernen Sie vorsichtig die EEG-Elektroden und reinigen Sie sie mit Tergazyme.</li>
	<li>Entferne das Glasfaserbündel langsam aus dem Gehirn des Tieres, indem du die Faser entlang der z-Eintrittsachse umkehrst.</li>
	<li>Befreien Sie das Tier von der Kopfstütze und den Körperfesseln.</li>
	<li>Befolgen Sie gegebenenfalls die erforderlichen Euthanasie- und Gewebeaufbereitungsprotokolle, um Blutgefäße sichtbar zu machen und Immunhistochemie durchzuführen.</li>
	<li>Wenn Sie planen, in einer zukünftigen Sitzung mit demselben Tier aufzunehmen, decken Sie das Bildgebungsfenster mit Knochenwachs oder Silastik ab.</li>
</ol>

<ol><li>Denk, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+and+functional+imaging+of+neurons+using+2-photon+laser+scanning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Anatomical and functional imaging of neurons using 2-photon laser scanning microscopy.</a> Journal of Neuroscience Methods. 54 (2), 151-162 (1994).</li>
<li>Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluctuations+and+stimulus-induced+changes+in+blood+flow+observed+in+individual+capillaries+in+layers+2+through+4+of+rat+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 15741-15746 (1998).</li>
<li>Helmchen, F., Fee, M. S., Tank, D. W., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+miniature+head-mounted+two-photon+microscope.+High-resolution+brain+imaging+in+freely+moving+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A miniature head-mounted two-photon microscope. High-resolution brain imaging in freely moving animals.</a> Neuron. 31, 903(2001).</li>
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<li>Smart, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+of+the+K%28V%291.1+potassium+channel+causes+epilepsy+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Deletion of the K(V)1.1 potassium channel causes epilepsy in mice.</a> Neuron. 20, 809-819 (1998).</li>
<li>Zuberi, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+mutation+in+the+human+voltage-gated+potassium+channel+gene+%28Kv1.1%29+associates+with+episodic+ataxia+type+1+and+sometimes+with+partial+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">A novel mutation in the human voltage-gated potassium channel gene (Kv1.1) associates with episodic ataxia type 1 and sometimes with partial epilepsy.</a> Brain. 122, 817-825 (1999).</li>
</ol>

Wir haben nichts zu verraten.

Wir haben ein Kopfkappen-Rückhaltesystem für simultane elektrophysiologische und faseroptische pCLE-Experimente an wachen Mäusen entwickelt, um eine mögliche Kontamination durch Anästhetika zu reduzieren. Die Kopfkappe und die Montagevorrichtung sind einfach zu konstruieren und für chronische Bildgebungsexperimente im Wachzustand wiederverwendbar. Wir überprüften die Qualität der Aufnahmen anhand des Goldstandards für die mikroskopische Blutflussbildgebung in vivo, TPLSM.
Kompetente chirurgisc...

Im Gegensatz zu anderen mikroskopischen bildgebenden Verfahren 1,2,3,4,5,6,7,8 ermöglicht die faseroptische konfokale In-vivo-Mikroskopie die Messung der Blutflussdynamik in jeder Hirnregion, in jeder Tiefe, mit hoher Geschwindigkeit (bis zu 240 Hz je nach Sichtfeldgröße9). Eine faseroptische Sonde ermöglicht konfokale In-vivo-Laserscanning-Bildgebung mit einer Auflösung von 3 μm, da die Spitze der Sonde (ein linsenloses Objektiv, das aus einem Bündel von 5000-6000 einzelnen Fasern mit einem Durchmesser von 3 μm besteht) mit der Genauigkeit einer Mikroelektrode innerhalb von 15 μm vom interessierenden Fluoreszenzziel positioniert werden kann. Wie bei der In-vivo-Zwei-Photonen-Bildgebung müssen zuvor Fluorophore in das Bildgebungsziel eingebracht werden. Zum Beispiel können Fluorescein-Dextran (oder Quantenpunkte) in das Gefäßsystem injiziert werden, oder genetisch kodierte fluoreszierende Proteine können in Zellen transfiziert werden, oder Fluoreszenzfarbstoffe wie Oregon Green BAPTA-1 können vor der Bildgebung in Zellen geladen werden.
Neuere Forschungen mit diesen Techniken haben ergeben, dass die motorische Aktivität von Wandzellen, die zu iktalen kapillaren Vasospasmen führt – plötzliche Verengungen, die während der Anfälle an der Position der Wandzellen auftreten9 – zur Neurodegeneration im iktalen Hippocampus beitragenkann 9. Während frühere bildgebende Studien in vitro und in vivo Perizytenverengungen im Zusammenhang mit der Anwendung von Medikamentenzeigten 6,7,10,11,12, fanden Leal-Campanario et al. den ersten Hinweis auf in vivo spontane Kapillarverengungen im murinen Gehirn. Um die Relevanz für die menschliche Temporallappenepilepsie zu ermitteln, untersuchten sie männliche (P30-40 alte) Kv1.1 (kcna1-null) Mäuse 14,15 (JAX stock #003532), ein genetisches Modell der menschlichen episodischen Ataxie Typ 115. Perizyten führten sowohl zu pathologischen als auch zu physiologischen Vasokonstriktionen im Hippocampus9 bei den spontan epileptischen Tieren und ihren Wildtyp-Wurfgeschwistern. Diese Beobachtungen wurden in WT-Tieren repliziert, die mit Kainsäure epileptisch gemacht wurden, was auf ihre Generalisierung auf andere Formen der Epilepsie hindeutet. Leal-Campanario et al. stellten außerdem mit Hilfe neuartiger sterelogischer Mikroskopie-Ansätze fest, dass apoptotische, aber nicht gesunde Neuronen bei epileptischen Tieren räumlich an das hippocampale Mikrogefäßsystem gekoppelt waren. Da die Exzitotoxizität keine bekannte räumliche Assoziation mit dem Gefäßsystem hat, deutet dieses Ergebnis darauf hin, dass eine abnorme kapillare vasospasmische Ischämie-induzierte Hypoxie zur Neurodegeneration bei Epilepsie beiträgt. Abbildung 1 zeigt eine schematische Darstellung des allgemeinen Aufbaus.

<table><tbody><tr><td>Frässtift mit 0,7 mm Durchmesser</td><td>Fine Science Tools</td><td>19007-07</td><td>Für Schrauben Nr. 19010-00</td></tr><tr><td>Frässtift mit 0,9 mm Durchmesser</td><td>Fine Science Tools</td><td>19007-09</td><td></td></tr><tr><td>ASEPTICO AEU-12C TORQUE PLUS</td><td>von Handstücklösung</td><td>AEU12C</td><td></td></tr><tr><td>Bull dog serrifine Klumpen</td><td>Fine Science Tools</td><td>18050-28</td><td></td></tr><tr><td>CellVizio Dualband</td><td>Mauna Kea Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellVizio Einband-Mikrosonde</td><td>Mauna Kea Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Konfokale Mikrosonde 300 Mikrometer (Serie S)</td><td>Mauna Kea Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maßgeschneidertes Ausrichtungsstück</td><td>L-förmig (abgewinkelt bei 90 Grad) und aus Edelstahl mit zwei gebohrten Löchern, mit einem Abstand von 4 mm von Mitte zu Mitte</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maßgeschneiderte Montagestange</td><td>Das lange Stück der Montagestange sollte zwischen 9,4 und 13 mm liegen. Befestigen Sie an diesem Teil der Montagestange eine 1,5 cm lange und 0,5 cm breite Edelstahlplatte mit zwei Löchern, die 4 mm von der Mitte zur Mitte gebohrt wurden, im gleichen Abstand wie das L-förmige Ausrichtungsstück.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cyanacrylat-Klebstoff-Sekundenkleber</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont Pinzette #5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>DuraLay Inlay Harz &ndash; Standardpaket</td><td>Reliance Dental Mfg Co.</td><td>602-7395 (von patterson dental)</td><td></td></tr><tr><td>Füllkopf, Schlitzantrieb, M1,6x0,35 metrisch grob, 12mm Länge Unterkopf, Maschinenschraube</td><td>MSC industrial direct co.</td><td></td><td></td>2834117</tr><tr><td>Fine Point Schere</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-09</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein 5% w/w Lysin-fixierbares Dextran (2MD)</td><td>Invitrogen, USA</td><td>D7137</td><td></td></tr><tr><td>Halsey glatter Nadelhalter</td><td>Fine Science Tools</td><td>12001-13</td><td></td></tr><tr><td>Kalt Nahtnadel 3/8 gebogen</td><td>Fine Science Tools</td><td>12050-03</td><td></td></tr><tr><td>Laborstandard stereotaktisch, Ratte und Maus</td><td>Stoelting Co. 51704</td><td>51670</td><td></td></tr><tr><td>Methocel 2%</td><td>Omnivision GmbH</td><td>PZN: 04682367</td><td>Augensalbe gegen Trockenheit.</td></tr><tr><td>Maus Temperaturregler, Sonde (YSI-451), kleines Heizkissen-TC-1000 Maus</td><td>CWE Inc.</td><td>08-13000</td><td></td></tr><tr><td>PhysioTel F20-EET Sender</td><td>DSI</td><td>270-0124-001</td><td></td></tr><tr><td>Roboter Stereotaxie, Manipulatorarm, ADD-ON, 3 Achsen, LINKS</td><td>Stoelting Co.C13</td><td>51704</td><td></td></tr><tr><td>Sel-Tapping Knochenschrauben</td><td>Fine Science Tools</td><td>19010-10</td><td></td></tr><tr><td>Standard-Ohrbügel und Gummispitzen für Maus Stereotaktisch</td><td>Stoelting Co</td><td>51648</td><td></td></tr><tr><td>Naht Faden - Geflochtene Seide/Größe 4/0</td><td>Fine Science Tools</td><td>18020-40</td><td></td></tr><tr><td>Gewebetrenn-Mikrospatel</td><td>Fine Science Tools</td><td>10091-121</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo fasergekoppelte präklinische konfokale laser-scanning-endomikroskopie (pcle) von hippocampus-kapillaren bei wachen mäusen

In Vivo Fiber-Coupled Pre-Clinical Confocal Laser-scanning Endomicroscopy (pCLE) of Hippocampal Capillaries in Awake Mice

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die präklinische konfokale Laser-Scanning-Endomikroskopie (pCLE) in ihrer spezifischen Anwendung zur Aufklärung von kapillaren Blutflusseffekten während Anfällen, die von Wandzellen angetrieben werden, zu beschreiben. Die kortikale Bildgebung in vitro und in vivo hat gezeigt, dass Kapillarverengungen, die durch Perizyten ausgelöst werden, sowohl durch funktionelle lokale neuronale Aktivität als auch durch die Anwendung von Medikamenten bei gesunden Tieren verursacht werden können. Hier wird ein Protokoll vorgestellt, wie mit Hilfe von pCLE die Rolle der mikrovaskulären Dynamik bei der neuronalen Degeneration bei Epilepsie in jeder Gewebetiefe (insbesondere im Hippocampus) bestimmt werden kann. Wir beschreiben eine Kopfstützentechnik, die angepasst wurde, um pCLE bei wachen Tieren aufzuzeichnen, um mögliche Nebenwirkungen von Anästhetika auf die neuronale Aktivität zu adressieren. Mit diesen Methoden können elektrophysiologische und bildgebende Aufnahmen über mehrere Stunden in tiefen neuronalen Strukturen des Gehirns durchgeführt werden.

Wir haben diese Methoden entwickelt, um zu beurteilen, ob abnorme perizytengetriebene kapillare Vasospasmen im Hippocampus – die als Folge von Anfällen auftreten – eine offene Hypoxie verursachen können, die zum Zelltod im iktalen Fokus beiträgt 9,13.
Die Entwicklung der Kopfkappe und ihre korrekte Installation sorgten für eine hohe Stabilität in den Aufnahmen, die eine gleichzeitige Aufzeichnung von EEG und Blutfluss tief im Hippocamp...

Während die Multiphotonen-Bildgebung nur in begrenzten Tiefen von der Gewebeoberfläche aus effektiv ist, ist es möglich, eine Bildgebung mit einer Auflösung von 3 μm in jeder Tiefe über pCLE zu erreichen. In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll zur Durchführung von pCLE-Bildgebung zur Messung der mikrovaskulären Dynamik im Hippocampus von iktalen und Wildtyp-Mäusen vor.

In vivo fasergekoppelte präklinische konfokale Laser-Scanning-Endomikroskopie (pCLE) von Hippocampus-Kapillaren bei wachen Mäusen

The goal of this protocol is to describe fiber-optic-bundle-coupled pre-clinical confocal laser-scanning endomicroscopy (pCLE) in its specific application ...

Dieses Protokoll ermöglichte es uns, das konfokale Laser-Scanning-faseroptische Endoskop zu verwenden, um simultane Bildgebung und elektrophysiologische Aufzeichnungen in vivo über mehrere Stunden von neuronalen Strukturen in jeder Tiefe des Gehirns im wachen oder relativ anästhesierten Tier durchzuführen. Wir haben eine schmerzfreie Fixierungsmethode entwickelt, die eine tiefe Bildgebung des Gehirns bei wachen Tieren mit Methoden ermöglicht, wie sie bisher für elektrophysiologische Ableitungen verwendet wurden. Diese Methode wurde verwendet, um funktionelle Gefäßanomalien in Nagetiermodellen für Epilepsie und altersbedingte Makuladegeneration zu untersuchen.Es ist eine praktikable Technik, um den Beitrag der Blutflusspathologie in vielen, wenn nicht sogar den meisten Organen der Krankheit zu bewerten. Während diese Technik für eine Echtzeitstudie der Blutflussdynamik im Gehirn entwickelt wurde, haben wir sie verwendet, um den Blutfluss in der In-vivo-Netzhaut zu untersuchen. Sie ist nicht auf vaskuläre Untersuchungen im Nervengewebe beschränkt.Das Verfahren wird von Jose Maria González Martin, einem hochqualifizierten Techniker aus meinem Labor, demonstriert. Nachdem Sie eine mang

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Quelle: Maruoka, H., et. al. Gleichzeitige Bildgebung der Mikrogliadynamik und der neuronalen Aktivität bei wachen Mäusen. J. vis. exp.,  (2022) Dieses Video zeigt ein Zwei-Photonen-Mikroskopieverfahren zur Abbildung der neuronalen Aktivität und der Mikrogliadynamik bei einer wachen Maus während der visuellen Stimulation, wobei Kalziumtransienten und zelluläre Wechselwirkungen hervorgehoben werden.

Gleichzeitige Bildgebung der Mikrogliadynamik und der neuronalen Aktivität bei einer wachen Maus

Quelle: Ulivi, A. F., et. al. Longitudinale Zwei-Photonen-Bildgebung von dorsalem Hippocampus CA1 in lebenden Mäusen. J. Vis. exp. (2019) Dieses Video zeigt die longitudinale Zwei-Photonen-Bildgebung von fluoreszenzmarkierten pyramidalen Neuronen in einer lebenden Maus und zeigt die Vorbereitung, Kanülenausrichtung und Bildgebung von Dendriten und dendritischen Dornen zur Untersuchung der neuronalen Struktur in der hippokampalen CA1-Region.

Längsschnittliche Zwei-Photonen-Bildgebung von fluoreszenzmarkierten Neuronen in einem lebenden Maus-Hippocampus 

Quelle: Kamei, R., et. al., In Vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocampus. J. Vis. Exp. (2022)Das Video zeigt den Aufbau und den Bildgebungsprozess für die in vivo Zwei-Photonen-Mikroskopie der Mikrogliadynamik im hippokampalen CA1 (Cornu ammonis 1) und im Gyrus dentatus, um eine optimale optische Ausrichtung und Beurteilung der strukturellen Integrität zu gewährleisten.

In vivo Zwei-Photonen-Bildgebung der Mikrogliadynamik im Hippocampus der Maus

Diese Methode beschreibt eine chronische Zubereitung, die den optischen Zugang zum Hippocampus lebender Mäuse ermöglicht. Dieses Präparat kann verwendet werden, um längsinale optische Bildgebung der neuronalen strukturellen Plastizität und aktivitätsbeschworenen zellulären Plastizität über einen Zeitraum von mehreren Wochen durchzuführen.

Längs-Zwei-Photon-Bildgebung des Dorsal Hippocampal CA1 in lebenden Mäusen

Die transkranielle optische Bildgebung ermöglicht eine Großfeld-Bildgebung des Zerebrospinalflüssigkeitstransports im Kortex lebender Mäuse durch einen intakten Schädel.

In Vivo Imaging von Cerebrospinalfluid Transport durch den intakten Mausschädel mittels Fluoreszenz-Makroskopie

Dieser Artikel zeigt die Vorbereitung eines maßgeschneiderten Bildgebungsfensters, ergänzt mit Infusionskanüle und deren Implantation in die CA1-Region des Hippocampus bei Mäusen.

Kraniotomie-Verfahren zur Visualisierung neuronaler Aktivitäten im Hippocampus von sich benehmenden Mäusen

Wir stellen ein Protokoll für den Einsatz der faseroptischen konfokalen Lasermikroendoskopie (CLM) vor, um die räumlich-zeitliche Verteilung von Liposomen im Auge nach subkonjunktivaler Injektion nicht-invasiv zu untersuchen.

Räumlich-zeitliche In-vivo-Bildgebung von okulären Wirkstoffabgabesystemen mittels faseroptischer konfokaler Lasermikroendoskopie

Diese Arbeit beschreibt eine Methode zur chronischen in vivo Beobachtung der ruhenden Mikroglia im Hippocampus CA1 der Maus mittels präzise kontrollierter Chirurgie und Zwei-Photonen-Mikroskopie.

Im lebenden Organismus Chronische Zwei-Photonen-Bildgebung von Mikroglia im Hippocampus der Maus

In dieser Arbeit beschreiben wir ein Protokoll, das die Adeno-assoziierte Virusinjektion mit der Implantation eines Schädelfensters kombiniert, um die Dynamik der Mikroglia und die neuronale Aktivität in wachen Mäusen simultan abzubilden.

Simultane Bildgebung von Mikrogliadynamik und neuronaler Aktivität in wachen Mäusen

Unter Verwendung eines rein optischen Ansatzes wird ein ischämischer Schlaganfall induziert, während gleichzeitig die neuronaleCa2+ -Aktivität mit einem fluoreszierenden Biosensor im entstehenden Schlaganfallkern einer wachen, sich verhaltenden Maus aufgezeichnet wird.

Gleichzeitige Photothrombose und Faserphotometrie zur Induktion und Überwachung eines ischämischen Schlaganfalls bei Mäusen, die sich verhalten

Dieses Protokoll bietet eine umfassende Beschreibung einer Methode zur gleichzeitigen Aufzeichnung von Kalziumsignalen von Neuronen und Astrozyten über mehrere gedächtnisbezogene Hirnregionen hinweg und demonstriert deren Anwendung während eines Lern- und Gedächtnisverhaltensparadigmas.

Eine zweifarbige Faserphotometriemethode zur Aufzeichnung der Aktivität von Astrozytenneuronen über mehrere Gehirnregionen während des Lern- und Gedächtnisverhaltens

Erfahren Sie die präklinische konfokale Laser-Scanning-Endomikroskopie zur Untersuchung mikrovaskulärer Dynamik im Hippocampus wacher Mäuse. Diese Methode ermöglicht hochauflösende Bildgebung in beliebiger Tiefe für neurologische Forschung.

In vivo fasergekoppelte präklinische konfokale Laser-Scanning-Endomikroskopie (pCLE) von Hippocampus-Kapillaren bei wachen Mäusen (Video) | JoVE Journal

In vivo fasergekoppelte präklinische konfokale Laser-Scanning-Endomikroskopie (pCLE) von Hippocampus-Kapillaren bei wachen Mäusen

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