In vivo fasergekoppelte präklinische konfokale Laser-Scanning-Endomikroskopie (pCLE) von Hippocampus-Kapillaren bei wachen Mäusen

Dieses Protokoll ermöglichte es uns, das konfokale Laser-Scanning-faseroptische Endoskop zu verwenden, um simultane Bildgebung und elektrophysiologische Aufzeichnungen in vivo über mehrere Stunden von neuronalen Strukturen in jeder Tiefe des Gehirns im wachen oder relativ anästhesierten Tier durchzuführen. Wir haben eine schmerzfreie Fixierungsmethode entwickelt, die eine tiefe Bildgebung des Gehirns bei wachen Tieren mit Methoden ermöglicht, wie sie bisher für elektrophysiologische Ableitungen verwendet wurden. Diese Methode wurde verwendet, um funktionelle Gefäßanomalien in Nagetiermodellen für Epilepsie und altersbedingte Makuladegeneration zu untersuchen.

Es ist eine praktikable Technik, um den Beitrag der Blutflusspathologie in vielen, wenn nicht sogar den meisten Organen der Krankheit zu bewerten. Während diese Technik für eine Echtzeitstudie der Blutflussdynamik im Gehirn entwickelt wurde, haben wir sie verwendet, um den Blutfluss in der In-vivo-Netzhaut zu untersuchen. Sie ist nicht auf vaskuläre Untersuchungen im Nervengewebe beschränkt.

Das Verfahren wird von Jose Maria González Martin, einem hochqualifizierten Techniker aus meinem Labor, demonstriert. Nachdem Sie eine mangelnde Reaktion auf den Blütenreflex bestätigt haben, setzen Sie die Zähne in das Loch der Beißstange und stabilisieren Sie den Kopf der Maus in einem stereotaktischen Nagetierrahmen. Ziehen Sie die Nasenklemme fest, bis sie fest sitzt.

Die Körperhaltung sollte möglichst gerade sein. Verwenden Sie Ohrbügel mit Kieferhaltermanschetten, um den Kopf so zu sichern, dass sich die Jochbeinfortsätze des Schädels innerhalb der Klemme befinden. Nachdem Sie die Kopfhaut gereinigt und sterilisiert haben, machen Sie einen 12 bis 15 Millimeter langen Schnitt entlang der Mittellinie von der Schädelbasis bis zwischen die Augen entlang der sagittalen Mittellinie des Schädels und verwenden Sie vier 28-Millimeter-Bulldog-Serrefine-Klammern, um die Ränder der Kopfhaut zurückzuziehen, den Schädel freizulegen und den Arbeitsbereich zu maximieren.

Kratzen Sie die Knochenhaut bis zu den Rändern des Einschnitts ab und trocknen Sie die Oberseite des Schädels. Messen Sie die Höhe des Schädels in einem beliebigen Abstand hinter dem Bregma und zwei gleiche Abstände seitlich von der Mittellinie auf beiden Seiten des Schädels. Identifizieren Sie den Zielpunkt, den rechten Hippocampus, mit Hilfe eines stereotaktischen Atlasses.

Ermitteln Sie auf dem Schädel die Zielpunktkoordinaten relativ zum Bregma mit der Stereotaxe und markieren Sie mit einer chirurgischen Markierung vier Ecken eines 1,4 mal zwei Millimeter großen Bildfensters, das um den Zielpunkt direkt über dem Hippocampus zentriert ist. Zeichnen Sie mit dem chirurgischen Marker eine zusätzliche Markierung über das obere linke Scheitelbein und eine weitere über den rechten Stirnknochen für die Knochenschrauben. Zeichnen Sie mit der Markierung einen Millimeter auf jeder Seite der Mittellinie und einen Punkt auf der Mittellinie einen Millimeter hinter Lambda, um die Einführpunkte der Epidural-EEG-Aufzeichnungselektrode anzuzeigen.

Um die Kopfkappe zu installieren, statten Sie einen Dentalbohrer mit einem Fräser mit einem Durchmesser von 0,7 Millimetern aus und bohren Sie vorsichtig zwei kleine Löcher in den Schädel an den Platzierungspunkten der Knochenschrauben. Als nächstes wird eine 70 bis 80 % Ethanol sterilisierte, vier Millimeter große geschlitzte Knochenschraube aus Edelstahl mit einem Durchmesser von 0,85 mm in jedes Loch eingesetzt, wobei darauf zu achten ist, dass die Schraubenspitzen nicht über den Boden des Knochens hinaus in die Schädelhöhle ragen. Verwenden Sie dann ein L-förmiges Ausrichtungsstück, das an das Mikrolaufwerk geklemmt ist, das an der stereotaktischen Vorrichtung montiert ist, um die Kopfkappe entlang der Mittellinie mit dem vorderen Grat über dem Bregma auszurichten, und führen Sie zwei Schlitzantriebsschrauben mit Fillister-Kopf über das Bregma ein, bis die Schrauben flach auf dem Schädel aufliegen, wobei darauf zu achten ist, dass nicht zu viel Druck auf den Schädel ausgeübt wird.

Um das Bildgebungsfenster einzurichten, bohren Sie ein Gratloch mit einem Durchmesser von 0,7 Millimetern an jeder der Positionen der Kraniotomie-Referenzmarken für die Ecken des Bildgebungsfensters, bevor Sie mit dem Bohrer die Peripherie des 1,4 mal zwei Millimeter großen Kraniotomiefensters vorsichtig mit iterativ tieferen Schnitten abgrenzen. Bedecken Sie das offene Fenster mit Knochenwachs und bohren Sie mit einem Grat von 0,9 Millimeter Durchmesser die Löcher der Epidural-EEG-Elektrode, wobei Sie darauf achten sollten, den Duramater nicht zu durchschneiden. Decken Sie die drei Löcher mit Knochenwachs ab und bauen Sie eine Wand aus Zahnzement, die das Bildgebungsfenster und die EEG-Löcher umfasst, um die Wand mit der Kopfkappe zu verbinden.

Wenn der Zement getrocknet ist, verwenden Sie 4,0 oder 5,0 schwarz geflochtene Seide und einfache unterbrochene Nähte, um lose Wundränder zu schließen, und verwenden Sie einen Applikator mit Wattespitze, um Lidocain und antibakterielle Salben auf die freiliegende Haut aufzutragen. Legen Sie die Maus dann in einen warmen Käfig und überwachen Sie sie, bis sie sich vollständig erholt hat. Befestigen Sie die Kopfkappe einen Tag nach der Implantationsuntersuchung der Kopfkappe an einer speziellen Montagestange, die am stereotaktischen Rahmen befestigt ist, um die wache Maus während der gesamten Bildgebungssitzung sicher am Rahmen zu positionieren.

Führen Sie die geerdeten epiduralen EEG-Aufzeichnungselektroden in das hintere zentrale Loch ein und führen Sie die Aufzeichnungselektroden in das vordere linke und rechte Loch ein. Die Spitzen der Drähte sind L-förmig und befinden sich zwischen Schädel und Duramater. Um den Blutfluss innerhalb des Hippocampus sichtbar zu machen, befestigen Sie den Schwanz mit zwei Fingern, um die zentrale Vene zu lokalisieren, und halten Sie eine ultrafeine Insulinspritze, die mit einer integrierten 30-Gauge-Nadel parallel zum Schwanz ausgestattet ist, und führen Sie die Nadel mit der abgeschrägten Seite nach oben in die Vene ein, etwa auf halbem Weg zu zwei Dritteln von der Basis des Schwanzes, um 200 Mikroliter 5%iges grünes Fluorescein-Lysin-fixierbares Dextran abzugeben.

Verwenden Sie dann die gebogene Spitze einer Spritzennadel, um die Dura zu entfernen und die konfokale Laserscanning-Aufnahme zu starten. Direkt im Anschluss an die Schwanzveneninjektion klemmen Sie das 300 Mikrometer große, abgeschrägte Glasfaserbündel nach unten an den beweglichen Arm des stereotaktischen Roboterantriebs. Das Rückhaltesystem ermöglicht stabile Blutflussaufzeichnungen von tiefen Hirnmikrogefäßen, einschließlich Kapillaren und ihrer proximalen Wandzellen über viele Stunden.

In dieser repräsentativen Analyse ganzer Mikrogefäße kam es zu Blutflussstörungen an den markierten Wandzellen. Die Anzahl der Faserableitungen kann durch den Vergleich von hochauflösenden Zwei-Photonen-Bildaufnahmen des Blutflusses mit äquivalenten Vasospasmen innerhalb kortikalem Gewebe bestimmt werden. Immunhistochemische Analysen an den Aufnahmestellen zeigen, dass die Wandzellen des Hippocampus mit dieser Methode korrekt angesteuert werden, indem sie sich nicht nur als Reaktion auf die Behandlung verengen, sondern auch räumlich mit Strikturen in Mikrogefäßen fernab der Arterien assoziieren.

Die Beherrschung der stereotaktischen Chirurgie und der lateralen Schwanzveneninjektion ist für die Durchführung dieses Protokolls von entscheidender Bedeutung. Gründliches Üben ist unerlässlich, um Fehler zu reduzieren und die Genauigkeit zu verbessern. Die Technik ermöglicht die Echtzeit-Bildgebung der Blutflussdynamik in tiefen Hirnstrukturen, wodurch sie sich für die Untersuchung von Pathologien des Gefäßsystems und die Bewertung der Wirksamkeit von Behandlungen, die auf sie abzielen, eignet.