Isolierung von Mastzellen Bauchfell abgeleitet und deren funktionelle Charakterisierung mit Ca^{2 +}-imaging und Degranulation Assays

Diese Methoden können dazu beitragen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der intrazellulären Signalübertragung auf erregbaren Zellen zu beantworten, z. B. welche Ionenkanäle für die Aktivierung von Immunzellen und die Freisetzung von Mediatoren entscheidend sind. Die Hauptvorteile dieser Techniken sind ihre relative Einfachheit und die Möglichkeit der gleichzeitigen Analyse einer großen Anzahl von Zellen. Kathrin Ohlenschlager, eine Doktorandin aus meinem Labor, wird die Fura-2-Kalzium-Bildgebung in Mastzellen demonstrieren.

Um diesen Vorgang zu starten, besprühen Sie die euthanasierte Maus mit 70%igem Ethanol und befestigen Sie sie mit Stecknadeln mit der Rückenseite nach unten auf einem Schaumstoffblock. Entfernen Sie mit einer stumpfen Schere die Haut über dem Bauch der Maus und vermeiden Sie eine Beschädigung der Bauchhöhle. Als nächstes injizieren Sie sieben Milliliter eiskaltes RPMI-Medium in die Bauchhöhle, indem Sie eine 27-Gauge-Nadel vorsichtig in das Peritoneum einführen.

Perforieren Sie keine Organe und verwenden Sie einen Fleck im Bereich des Nebenhodenfetts, um das Risiko einer Organperforation zu verringern. Schütteln Sie die Maus nach der Injektion eine Minute lang, um die Peritonealzellen in das RMPI-Medium zu lösen. Schütteln Sie die Maus nicht zu stark, um eine Schädigung der inneren Organe und eine Verunreinigung der Bauchhöhle mit dem Blut zu vermeiden.

Verwenden Sie dann die Spritze wieder, indem Sie sie mit einer neuen 20-Gauge-Kanüle ausstatten. Verschieben Sie die inneren Organe auf eine Seite, indem Sie den Schaumstoffblock kippen und vorsichtig auf die Bank klopfen, um die Absaugung des Mediums von der anderen Seite aus zu erleichtern. Führen Sie anschließend eine 20-Gauge-Nadelabschrägung ein, um die Flüssigkeit sanft und langsam aus dem Bauch abzusaugen, um eine Verstopfung der inneren Organe zu vermeiden.

Sammeln Sie so viel Flüssigkeit wie möglich. Entfernen Sie dann die Nadel von der Spritze und überführen Sie die gesammelte Zellsuspension in einem Sammelröhrchen auf Eis. Entsorgen Sie ein Probenröhrchen, wenn eine sichtbare Blutkontamination vorliegt.

Das Röhrchen wird fünf Minuten lang mit einer sauberen Zellsuspension bei 300 g zentrifugiert. Unter einer sterilen Haube den Überstand ansaugen. Die Probenpellets werden wieder in kaltem PMC-Medium suspendiert und die Zellsuspension in einen 25 Quadratzentimeter großen Zellkulturkolben überführt.

Anschließend fügen Sie die Wachstumsfaktoren IL-3 und SCF zu den Endkonzentrationen von 10 Nanogramm pro Milliliter bzw. 30 Nanogramm pro Milliliter hinzu. Inkubieren Sie die Zellen für ca. 48 Stunden bei 37 Grad Celsius bis zum nächsten Eingriff. Wenn an den Tagen 12 bis 15 Experimente mit der Stimulation plasmalemmaler IgE-Rezeptoren geplant sind, behandeln Sie die Zellen über Nacht mit 300 Nanogramm pro Milliliter IgE-Anti-DNP in Standardkulturmedium.

Zur Vorbereitung der Fura-2-Bildgebung Fura-2, AM-Stammlösung in Calcium-HBSS auf eine Endkonzentration von fünf Mikromolaren verdünnen, um den Ladepuffer vorzubereiten. Mischen Sie dann 500 Mikroliter des Ladepuffers mit 500 Mikrolitern der PMC-Zellsuspension. Pipettieren Sie die Mischung in die Bildgebungskammer und inkubieren Sie die Zellen 20 bis 30 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln.

Richten Sie das Schwerkraft-Applikationssystem mit verschiedenen Lösungen entsprechend dem Stimulationsprotokoll ein. Montieren Sie anschließend das Applikationssystem auf dem Tisch des inversen Mikroskops. Bereiten Sie ein 40-faches Ölimmersionsobjektiv mit hoher Apertur vor, indem Sie einen kleinen Tropfen Immersionsöl darauf geben.

Platzieren Sie die Bildgebungskammer mit den geladenen Zellen im Applikationssystem und sichern Sie sie, um eine Bewegung während der Aufzeichnung zu verhindern. Schalten Sie dann das Durchlicht ein und fokussieren Sie sich auf die Zellen. Starten Sie anschließend das Bildgebungsaufnahmeprogramm im physiologischen Erfassungsmodus.

Öffnen Sie das Setup-Fenster und stellen Sie den Fokus und die optimale Aufnahmezeit ein. Stellen Sie sich ein Referenzbild vor, und markieren Sie die Zellen als ROIs. Markieren Sie den letzten ROI in einem Bereich, in dem keine Zellen vorhanden sind, und definieren Sie ihn als Hintergrund.

Schließen Sie dann die Einrichtung ab und starten Sie die Messung mit einer Erfassungsrate von fünf Sekunden. Fügen Sie als Nächstes Lösungen mit der richtigen Zyklusnummer entsprechend dem Versuchsplan hinzu. Um die antigeninduzierte Erhöhung der intrazellulären Kalziumkonzentration zu messen, tragen Sie die Spritzen-Zwei-Lösung nach Zyklus 20 auf und beenden Sie die Aufzeichnung nach Zyklus 150.

Um die durch Verbindung 48/80 induzierte Erhöhung der intrazellulären Calciumkonzentration zu messen, tragen Sie die Spritzen-Drei-Lösung nach Zyklus 20 auf und beenden Sie die Aufzeichnung nach Zyklus 150. Um die durch SOCE hervorgerufene Erhöhung der intrazellulären Kalziumkonzentration zu messen, tragen Sie die Spritzen-Vier-Lösung nach Zyklus 10 auf, tragen Sie die Spritzen-Fünf-Lösung nach Zyklus 70 auf, tragen Sie die Spritzen-Vier-Lösung nach Zyklus 120 auf, tragen Sie die Spritzen-Eins-Lösung nach Zyklus 150 auf und stoppen Sie die Aufzeichnung nach Zyklus 220. Drücken Sie im Erfassungsprogramm nacheinander die Tasten Start Cutter, Mark All, Convert All, Physiology Measurements, OK und dann wieder OK.

Speichern Sie die Dateien als Tabellen und Bildstapel für die Offline-Analyse. Um die Beta-Hexosaminidase-Freisetzung zu messen, übertragen Sie 100 Mikroliter der Zellsuspension pro Well auf eine 96-Well-Well-Platte mit V-Boden. Geben Sie 25 Mikroliter Stimulations- oder Kontrolllösung in jede Vertiefung

Inkubieren Sie die Zellen dann 45 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Stoppen Sie anschließend die Reaktion, indem Sie die 96-Well-Platte fünf Minuten lang auf Eis legen. Dann zentrifugieren Sie die Platte vier Minuten lang bei 120 g bei vier Grad Celsius.

Übertragen Sie 120 Mikroliter des Überstands auf eine 96-Well-Platte mit flachem Boden und legen Sie sie auf Eis. Vermeiden Sie es, die Zellpellets zu berühren, sondern saugen Sie den Überstand vollständig an. Geben Sie anschließend 125 Mikroliter Lysepuffer zu den Zellpellets.

Inkubieren Sie die Zellpellets fünf Minuten lang bei Raumtemperatur und suspendieren Sie sie nach der Inkubation durch wiederholtes Pipettieren wieder. Pipettieren Sie 25 Mikroliter der vier Millimolare pNAG-Lösung in die erforderlichen Vertiefungen einer neuen 96-Well-Platte mit flachem Boden. 25 Mikroliter jedes Überstands und 25 Mikroliter jedes Zelllysats werden separat in die vorbereitete pNAG-Lösung gegeben.

Inkubieren Sie die Reaktionschargen eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Pipettieren Sie nach der Inkubation 150 Mikroliter Stopplösung in jede Vertiefung, um die Reaktion zu stoppen. Analysieren Sie als Nächstes die Lichtabsorption der Plattenprobe mit einem Mikroplatten-Reader bei 405 Nanometern mit einer Referenz von 630 Nanometern für die automatische Hintergrundsubtraktion.

Aktivieren Sie im Erfassungsprogramm das Kontrollkästchen Referenz und wählen Sie im Menü des Absorptionsprogrammelements 630 Nanometer für die automatische Hintergrundsubtraktion. Ein Beta-Hexosaminidase-Freisetzungsassay wurde durchgeführt, um die Fähigkeit der isolierten PMCs zu testen, die bei Vernetzung der plasmalemmalen IgE-Rezeptoren mit hoher Affinität oder Stimulation der Mrg PRB2-Rezeptoren einer Degranulation unterzogen werden. Die Zellen wurden auf eine 96-Well-Platte mit V-Boden gegeben und nach diesem Schema 45 Minuten lang bei 37 Grad Celsius stimuliert.

Nach dem Zentrifugieren und Entfernen des Überstands wurden die Pellets lysiert. Der Beta-Hexosaminidase-Gehalt einzelner Überstände und Pelletlysate wurde dann durch ihre Reaktionen mit pNAG während einer einstündigen Inkubation bei 37 Grad Celsius analysiert. Die Menge der Reaktionsprodukte wurde kolorimetrisch detektiert und der prozentuale Anteil der freigesetzten Beta-Hexosaminidase berechnet.

Die spontane Freisetzung war sehr gering, während die Reaktionen auf starke Degranulationsstimuli, wie z. B. 10 mikromolares Ionomycin und Verbindung 48/80 bei 50 Mikrogramm pro Milliliter, über 40 % bzw. 60 % lagen. Die Degranulationsreaktionen auf DNP-Stimulation waren dosisabhängig über den Konzentrationsbereich von 10 bis 300 Milligramm pro Milliliter. Zusammengenommen deuten diese Daten eindeutig auf einen guten Funktionszustand der isolierten PMCs hin.

Mit dieser Technik erhalten Sie innerhalb von zwei Wochen eine hochreine Population von reifen Bindegewebsmastzellen der Maus, die aus dem Peritoneum gewonnen werden. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, während der Zellisolierung und -kultivierung sterile Bedingungen aufrechtzuerhalten, um eine bakterielle Kontamination zu vermeiden. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden, wie z.B. elektrophysiologische Patch-Clamp-Ionenstrommessungen, durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu den Kalziumeintrittswegen in Mastzellen zu beantworten.

Nach ihrer Entwicklung ebnete die intrazelluläre Kalzium-Bildgebungstechnik Fura-2 den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Massenzellphysiologie, um die Kalziumabhängigkeit der Mastzelldegranulation zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Fura-2-Kalzium-Bildgebungsexperimente und Beta-Hexosaminidase-Degranulationsassays mit Mastzellen durchführt. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit UV-Strahlung für Augen und Haut gefährlich sein kann und unnötige Exposition bei der Durchführung dieses Verfahrens vermieden werden sollte.