Name: Kombination von Optogenetik mit künstlichen Mikro-RNAs, die Effekte gen Knockdown präsynaptischen Funktion innerhalb intakte neuronale Schaltkreise zu charakterisieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-14T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Lernen Sie die Kombination von Optogenetik mit künstlichen Mikro-RNAs zur Charakterisierung genetischer Knockdown-Effekte auf präsynaptische Funktionen in neuronalen Schaltkreisen. Diese Methode ermöglicht präzise Untersuchungen synaptischer Übertragung in akuten Hirnschnitten.

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Wir danken F. Benfenati (Istituto Italiano di Tecnologia, IIT) für Unterstützung und Carmela Vitale für die Hilfe bei der Demonstration. Diese Arbeit wurde von IIT und die Compagnia San Paolo (Grant Nr. 9734 Lac) finanziert.

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Co Ausdruck einer optogenetische-Sonde und eine MiR gegen ein präsynaptischen gen des Interesses bietet einen leistungsfähigen Ansatz um die Auswirkungen von gen-Knockdown auf präsynaptischen Funktion innerhalb intakte neuronale Schaltkreise zu charakterisieren. Für diesen experimentellen Ansatz ist es wichtig, zu identifizieren und zu charakterisieren, MiRs, die höchst effizient und selektiv in das gen des Interesses an nativen Systemen umzuwerfen. Wenn möglich, sollten zwei oder mehr unabhängige MiRs gegen die gleichen mRNA von Interesse zu steuern für eventuelle Ziel Effekte verwendet werden. Rettung-Experimente, in denen ein MiR beständig gen in das System wieder eingeführt wird als ein Steuerelement Spezifität einsetzbar.
Das gleiche Konstrukt ermöglicht ein optogenetische ausdrücken Sonde und eine MiR anregende optisch nur die präsynaptischen Neuronen, die manipuliert worden sind. Dies ist nicht möglich mit elektrischen Stimulationen, weil sie nicht zwischen infizierten und nicht infizierten Nervenzellen, wodurch gemischt und verdünnt Ergebnisse unterscheiden. Da optische Reize mehrere Aktionspotentiale15induzieren können, ist es wichtig, nur die schnellste optogenetische Sonden unter einer wachsenden Palette15,19,20,21zu wählen. Darüber hinaus ist es wichtig sicherzustellen, dass die optische Stimulation nicht dazu veranlassen, eine direkte Depolarisation der präsynaptischen Boutons, um zu vermeiden, einige der Schritte der synaptischen Übertragung unter Umgehung einer22untersuchen möchte.
Der experimentelle Ansatz, den wir hier beschreiben macht es möglich, parallel die physiologische Relevanz mehrere präsynaptischen Gene des Interesses innerhalb eines begrenzten Zeitraums (4 – 6 Monate) zu bewerten. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass Niederschlägen selten 100 % erreichen. Darüber hinaus müssen rAAVs ausgedrückt werden, für mindestens zwei Wochen zu ermöglichen maximale Knockdown und vollen Ausdruck der optogenetische Sonde, die eine zeitliche Begrenzung darstellen können, wenn Sie frühe Entwicklungsprozesse zu untersuchen. Obwohl mehr zeitaufwendig, bedingte Knockout-Mäusen beschränkt auf präsynaptischen Neuronen führen in der Regel vollständige Entfernung des Gens von Interesse und bieten somit einen gültigen komplementären Ansatz.
Ein besonderen Vorteil der MiR-Technologie ist, dass dadurch die Expression von mehreren MiRs vom gleichen Veranstalter. Diese Eigenschaft wurde hauptsächlich zur Knockdown Effizienz zu steigern, indem Sie mehrere Kopien der gleichen MiR oder verschiedene MiRs gegen das gleiche Zielgen einfügen. Jedoch kann es auch verwendet, um Zuschlag mehrere Gene MiRs gegen unterschiedliche Zielgruppen Gene7,23zum Ausdruck zu bringen. Diese Eigenschaft kann verwendet werden, um mehrere präsynaptischen Proteine um präsynaptischen Signalwege sezieren zum Schweigen zu bringen.
Hier haben wir Optogenetik mit künstlichen MiRs zu charakterisieren die Auswirkungen von gen-Knockdown präsynaptischen Funktion im akuten hippocampal Scheiben kombiniert. Ein ähnlicher Ansatz könnte auch verwendet werden, zu manipulieren und Sonde neuronale Schaltkreise in Vivo. Darüber hinaus würde künstliche MiRs mit Chemogenetic kombinieren Ansätze einer neuronalen Schaltkreise auf längeren Zeitskalen Verhören ermöglichen.

Dieses Protokoll beschreibt einen neuen Ansatz, um die Auswirkungen von gen-Knockdown auf präsynaptischen Funktion innerhalb intakte neuronale Schaltkreise zu charakterisieren. Untersuchung von präsynaptischen Funktion in intakte neuronale Schaltkreise ist schwierig, weil viele präsynaptischen Boutons zu klein sind und weit entfernt von der Soma kombinierte molekulare und elektrophysiologische Interventionen zu ermöglichen. RNA-Interferenz bietet ein leistungsstarkes und flexibles Mittel, um Knockdown synaptischen Proteine1, wurde dieser Ansatz sparsam verwendet, um präsynaptischen Funktion zu untersuchen, denn es schwer ist zu erkennen, die Auswirkungen der Zuschlag mit herkömmlichen elektrische Stimulationen, die nicht zwischen unterscheiden manipuliert und naiv präsynaptischen Boutons2. Wir beschreiben hier, wie künstliche MicroRNA (MiR) zu kombinieren-vermittelten RNA-Interferenz mit neu entwickelten optogenetische-Technologie, selektive Stimulierung der manipulierten präsynaptischen Boutons in akuten Hirnschnitten zu erreichen.
Während bedingte Knockout-Mäusen in Kombination mit Elektrophysiologie auch genutzt werden, könnte zu untersuchen, die Funktion der präsynaptischen Proteine3,4, erfordert unsere Strategie der Entwicklung und Wartung von genetisch keine Mauslinien geändert und kann auch leicht abzureißen spezifische Isoformen eines Gens eingesetzt werden. Relativ zum häufiger verwendeten kurze Haarnadel RNAs (ShRNAs), künstliche MiRs, die wir hier einsetzen, bieten entscheidende Vorteile für Zuschlag in Neuronen. Im Gegensatz zu ShRNAs können sie unter der Kontrolle einer Polymerase II Förderer1ausgedrückt werden. So kann einzelne Förderer verwendet werden, um den Ausdruck von MiR und eine optogenetische Sonde, zusammen mit einem fluoreszierenden Reporter zu fahren. Auf diese Weise kann die Größe des Konstrukts Verpackungen im Rahmen der recombinant Adeno-assoziierten Viren (rAAV, Abb. 1A) gehalten werden. Die Verwendung einer einzigen Konstrukt und einzelne Förderer verringert ebenfalls experimentelle Variabilität, weil sie Ausdruck der MiR, die optogenetische-Sonde und der fluoreszierenden Reporter in einem festen Verhältnis ermöglicht.
Vor kurzem haben wir diese Technologie, um die Rolle der alternativ gespleißten Isoformen von präsynaptischen Kalziumkanäle in den Hippocampus5untersuchen eingesetzt. Eine solche Strategie ist generell für die physiologische Relevanz anderer presynaptically exprimierten Proteine in jedem Gehirn Schaltung von Interesse zu studieren.

<table><tbody><tr><td>Acrylamid</td><td>Sigma</td><td>Acrylamid / Bis-Acrylamid, 30%ige Lösung</td><td></td></tr><tr><td>Temperaturregler für toxische Tiere mit Wärmekissen</td><td>WPI</td><td>ATC2000</td> BCA-Protein-Assay-Kit <td></td></tr><tr><td></td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>BLOCK-iT Pol II miR RNAi-Expressionsvektor-Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>K4936-00</td><td></td></tr><tr><td>Vorkammer für Gehirnschnitte</td><td>Harvard Apparat</td><td>BSC-PC</td><td></td></tr><tr><td>CCD-Kamera-basierter Imager</td><td>Bio-Rad</td><td>ChemiDoc&trade; </td><td></td>MP</tr><tr><td>Zellkulturreagenzien</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chemilumineszenzsubstrat</td><td>GE Helthcare</td><td>ECL Western Blotting Reagenzien RPN2106</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma</td><td>C2432</td><td></td></tr><tr><td>Toxisches Cytosin &beta;-D-Arabinofuranosid</td><td>Sigma</td><td>C6645</td><td></td></tr><tr><td>Bohrerforedom</td><td>K.1030</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin Salbe</td><td>Apotheke</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td></td><td>Sigma G7021</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma</td><td>54459</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipetten für Injektionen</td><td>Narishige</td><td>GD1</td><td></td></tr><tr><td>Anorganische Salze und Reinigungsmittel</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>K2- Kreatinphosphat</td><td>Calbiochem</td><td>237911</td><td></td></tr><tr><td>KGluconat</td><td>Fluka</td><td>60245</td><td></td></tr><tr><td>Laser</td><td>Laserglow Technologies</td><td>LRS-0473-GFM-00100-03</td><td></td></tr><tr><td>Membran</td><td>Amersham</td><td>Protran&trade; 0,2 &micro; m NC</td><td></td></tr><tr><td>MgATP</td><td>Sigma</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipettenhalter</td><td>Narishige</td><td>IM-H1</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipettenabzieher</td><td>Narishige</td><td>PC-100</td><td></td></tr><tr><td>Na3GTP</td><td>Sigma</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>NaPyruvat</td><td>Sigma</td><td>P5280</td><td></td></tr><tr><td>Augengleitmittel</td><td>Lokale Apotheke</td><td>Lacrigel</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatinhibitoren</td><td>Sigma</td><td>P0044, P5726</td><td></td></tr><tr><td>Proteasehemmer</td><td>Sigma</td><td>cOmplete&trade;, EDTA-freie Proteasehemmer Cocktail</td><td></td></tr><tr><td>Proteingelelektrophorese und Blottinggeräte</td><td>Bio-Rad</td><td>Mini-Protean III Zellprovidon</td><td></td></tr><tr><td>Jod</td><td>Lokale Apotheke</td><td>Betadin</td><td></td></tr><tr><td>Qiazol Lysereagenz</td><td>Qiagen</td><td>79306</td><td>Toxisches</td></tr><tr><td>QuantiTect Reverse Transkriptionskit</td><td>Qiagen</td><td>205311</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Micro Kit</td><td>Qiagen</td><td>74004</td><td></td></tr><tr><td>Spektralphotometer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Nanodrop 2000</td><td></td></tr><tr><td>Stereotaktisches Gerät</td><td>WPI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tetrodotoxin</td><td>Tocris</td><td>1069</td><td>Giftig</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1200S</td><td></td></tr></tbody></table>

kombination von optogenetik mit künstlichen mikro-rnas, die effekte gen knockdown präsynaptischen funktion innerhalb intakte neuronale schaltkreise zu charakterisieren

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

Dieses Protokoll soll die Auswirkungen von gen-Knockdown auf präsynaptischen Funktion innerhalb intakte neuronale Schaltkreise zu charakterisieren. Wir beschreiben einen Workflow wie künstliche MicroRNA (MiR) zu kombinieren-vermittelten RNA-Interferenz mit Optogenetik, selektive Stimulierung der manipulierten präsynaptischen Boutons in akuten Hirnschnitten zu erreichen. Der experimentelle Ansatz beinhaltet die Verwendung einer einzigen virale Konstrukt und einzelne Neuron-spezifische Förderer, den Ausdruck einer optogenetische Sonde und künstliche MiR(s) gegen präsynaptischen ursächlich zu fahren. Wenn hierbei in der Hirnregion Interesse injiziert, macht das ausdrückliche Konstrukt es möglich mit Licht ausschließlich die Neuronen mit reduzierten Ausdruck der Gene untersucht zu stimulieren. Diese Strategie erfordert die Entwicklung und Wartung von gentechnisch veränderten Mauslinien und kann im Prinzip auf andere Organismen und gelten alle neuronalen gen Wahl. Wir haben vor kurzem angewendet, um zu untersuchen, wie die Knockdown von alternativen Spleiß Isoformen von präsynaptischen P/Q-Typ Voltage-gated Calciumkanäle (VGCCs) kurzfristige synaptische Plastizität bei CA3, CA1 exzitatorischen Synapsen in akuten hippocampal Scheiben regelt. Ein ähnlicher Ansatz könnte auch verwendet werden, zu manipulieren und Sonde die neuronalen Schaltkreise in Vivo.

Die oben beschriebenen Verfahren bieten eine robuste Methode zu beurteilen, wie synaptische Übertragung von Knockdown von synaptischen Proteine in den präsynaptischen Neuronen betroffen ist. Repräsentative Ergebnisse auf wie die Knockdown von Alternative splice Isoformen von präsynaptischen CaV2.1 (P/Q-Typ) VGCCs regelt kurzfristige synaptische Plastizität bei CA3, CA1 exzitatorische Synapsen unten als Beispiel angegeben sind.
CaV2.1 (P/Q-Typ) Kanäle sind die vorherrschenden präsynaptischen VGCCs an die meisten schnellen Synapsen im zentralen Nervensystem. Alternatives Spleißen von sich gegenseitig ausschließenden Exons 37a und 37 b der Pore-forming α-1 -Untereinheit von CaV2.1 (α1A) produziert zwei große Varianten, CaV2.1 [EFa] und CaV2.1 [EFb]16,17 ,18. Um festzustellen, ob CaV2.1 [EFa] und CaV2.1 [EFb] differentiell synaptische Übertragung und Plastizität im Hippokampus pyramidale Rattenneuronen regulieren, wir zuerst entwickelt Isoform-spezifische MiRs, Knockdown selektiv CaV 2.1 [EFa] oder CaV2.1 [EFb]5. Trotz der kurzen Größe (97 bp) und hohe Ähnlichkeit (61.86 % Identität auf der Nukleotid-Ebene) zwischen Exons 37a und 37 b, wir könnten design drei MiR Sequenzen gegen Ratte CaV2.1 [EFa] (MiR EFa1: TCCTTATAGTGAATGCGGCCG; MiR EFa2: ATGTCCTTATAGTGAATGCGG; MiR EFa3: TTGCAAGCAACCCTATGAGGA) und zwei gegen Ratte CaV2.1 [EFb] (MiR EFb1: ATACATGTCCGGGTAAGGCAT; MiR EFb2: ATCTGATACATGTCCGGGTAA) mit einem prognostizierten hohen Knockdown Wirkungsgrad. Als Negativkontrolle (MiR Kontrolle) haben wir das pcDNA6.2-GW/EmGFP-MiR-Neg-Plasmid enthält eine Sequenz, die keines bekannte Wirbeltier gen gerichtet ist. Basierend auf einer ersten Bildschirm in HEK-293-Zellen gegen heterologe Kanäle, wir MiR EFa1, MiR EFa3 und MiR EFb2 ausgewählt und in der 3' UTR des Vektors pAAV-Syn-ChETA-TdT-miR-X, die für die Produktion von rAAVs soll ihre Expressionskassetten kloniert und wo die Wirbeltiere Promotor treibt Ausdruck von ultraschnellen Channelrhodopsin ChETA, das rot fluoreszierende Protein TdTomato und der eingefügten MiR (Abbildung 1). Der Expressionskassette der MiR EFb2, Knockdown Effizienz der dieser MiR dupliziert
Als nächstes wir bereit rAAV1/2 für die oben genannten vier Konstrukte und quantifiziert Knockdown Effizienz und Selektivität in primären Ratte neuronalen Kulturen mittels Isoform-spezifische qRT-PCR. MiR EFa1 und MiR reduziert EFa3 mRNA von native CaV2.1 [EFa] ~ 70 % aber nicht, dass der CaV2.1 [EFb], während MiR EFb mRNA von native CaV2.1 [EFb] von ~ 60 % aber nicht, dass der CaV2.1 [EFa] (Abbildung 2) reduziert.
Wir dann hierbei injiziert jeder der vier rAAV1/2 Bereich CA3 des Hippocampus P18 Ratten (Abb. 3A-C), mit den Koordinaten (A-P/M-L/D-V von Bregma) −2.6 / ± 2,9 / −2.9. Fünfzehn bis zwanzig-vier Tage nach der Injektion, wir akute hippocampale Scheiben aus rAAV1/2-injiziert Ratten vorbereitet und TdTomato Fluoreszenz verwendet, um den Ausdruck und die Lokalisierung von rAAVs (Abb. 3 b) bestätigen. Um zu untersuchen, ob präsynaptischen Knockdown von CaV2.1 [EFa] oder CaV2.1 [EFb] kurzfristige synaptische Plastizität bei CA3, CA1 Synapsen betroffen, stimulieren wir gezielt infizierte CA3 Neuronen mit kurzen 473 nm Laser Lichtpulse (2 ms langen ; Abbildung 3), und die sich daraus ergebenden EPSCs von Patchen pyramidale Neuronen in den proximalen mit medialen Trakt der CA1-Region (Abbildung 3) aufgenommen. Wir fanden, dass der Zuschlag von CaV2.1 Spleiß Isoformen Antworten gepaart-Puls-Stimulation in entgegengesetzte Richtungen betroffen: Knockdown von CaV2.1 [EFa] (MiR EFa1 oder MiR EFa3) verstärkt gepaart-Pulse Facilitation (PPF), während Knockdown von Ca V2.1 [EFb] (MiR EFb2) abgeschafft (Abbildung 3D, E).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57223/57223fig1.jpg"> Abbildung 1: Schema der Konstrukte für kombinierte Ausdruck von ultraschnellen optogenetische Sonde ChETA und Isoform-spezifische MiRs gegen CaV2.1 [EFa] und CaV2.1 [EFb]. (A) Karte von den rAAV konstruieren pAAV-Syn-ChETA-TdT-miR-X, mit synapsin Förderer (Syn), die ultraschnelle Channelrhodopsin ChETA verschmolzen, TdTomato und in den proximalen 3' UTR, eine CaV2.1 Spleiß Isoform-spezifische MiR. Restriktionsenzyme gezeigt werden einzelne Messer. (B) oben, Schema der Expressionskassette. Die synapsin Promotor treibt Ausdruck ChETA-TdTomato und eine Isoform-spezifische MiR. Unten, umgekehrte Ergänzung des 21-Nukleotid Zielsequenzen, die Teil der MiR Kassette. Für MiR EFb2 wurden zwei identische MiR Kassetten im Tandem, einer nach dem anderen ausgedrückt. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57223/57223fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57223/57223fig2.jpg"> Abbildung 2. Bewertung der Knockdown Effizienz und Selektivität der Isoform-spezifische MiRs für CaV2.1 [EFa] und CaV2.1 [EFb]. Isoform-spezifische qRT-PCR-Analyse auf RNA isoliert vom 17. / 18. DIV Primärkulturen bei 6 DIV mit rAAVs mit dem Ausdruck MiRs Ausrichtung entweder CaV2.1 [EFa] (MiR EFa1 und MiR EFa3) infiziert oder CaV2.1 [EFb] (MiR EFb2). Daten sind auf die negativ-Kontrolle (MiR Kontrolle) normalisiert. MiR EFa1 und MiR EFa3 deutlich und selektiv reduzieren mRNA von CaV2.1 [EFa] (n = 8 und 7 Kulturen bzw.), während MiR EFb deutlich und selektiv mRNA von CaV2.1 [EFb] reduziert (n = 4 Kulturen; *** p &lt; 0,001; One-Way-Analyse Varianz Test gefolgt von der Tukey-Kramer Post-Test). Daten werden als ± SEM bedeuten präsentiert Diese Zahl wurde angepasst von Thalhammer, A. Et al. 5. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57223/57223fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57223/57223fig3.jpg"> Abbildung 3. Bewertung der Rolle von CaV2.1 [EFa] und CaV2.1 [EFb] im nativen Hippocampus durch gezielte Stimulation der geworfen Neuronen mit Optogenetik. (A) Regelung der Expressionskassette der rAAV Konstrukte zur in-Vivo -Infektion. (B) Hippocampal Abschnitt zeigen, dass TdTomato Fluoreszenz beschränkt sich der CA3-Region und seine Prognosen. (C) experimentelle Konfiguration: Laserstrahl richtete sich auf CA3 Somata und Patch-Clamp-Aufnahmen wurden von CA1 pyramidale Neuronen durchgeführt. (D) 2 ms langen blau (473 nm) Licht Laserpulse glänzte bei 20 Hz evozieren EPSCs deren PPF ist MiRs targeting CaV2.1 [EFa] gestiegen und von MiR für CaV2.1 [EFb] abgeschafft. (E) Zusammenfassung der gepaart-Puls-Verhältnis für Experimente wie in (D), mit einem Anstieg in PPF MiR EFa1 und MiR EFa3 und einen Rückgang bei MiR EFb2, im Verhältnis zu MiR Kontrolle (n = 9 / 11 Aufnahmen; * p = 0,02; ** p = 0,01; *** p &lt; 0,0004; Analyse der Kovarianz). Daten werden als ± SEM bedeuten präsentiert Diese Zahl wurde angepasst von Thalhammer, A. Et al. 5. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57223/57223fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

Dieses Protokoll enthält einen Workflow, künstliche MicroRNA-vermittelten RNA-Interferenz mit Optogenetik Förderung insbesondere präsynaptischen Boutons mit reduzierten Expression von selektiven-Gens in intakte neuronale Schaltkreise zu kombinieren.

Kombination von Optogenetik mit künstlichen Mikro-RNAs, die Effekte gen Knockdown präsynaptischen Funktion innerhalb intakte neuronale Schaltkreise zu charakterisieren

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...

Das übergeordnete Ziel der Kombination von künstlicher microRNA-vermittelter RNA-Interferenz mit Optogenetik ist es, den Effekt des Gen-Knockdowns auf die präsynaptische Funktion innerhalb intakter neuronaler Schaltkreise zu charakterisieren. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der synaptischen Physiologie zu beantworten, wie z.B. die physiologische Rolle präsynaptischer Proteine in intakten Gehirnschaltkreisen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie es ermöglicht, die synaptische Übertragung selektiv an Neuronen mit reduzierter Expression des untersuchten präsynaptischen Proteins zu überwachen.Wir haben diese Methode auch verwendet, um die präsynaptische Funktion in akuten Hirnschnitten zu untersuchen. Es kann auch zur Manipulation und Untersuchung der neuronalen Sicherheit in vivo eingesetzt werden. Das Verfahren wird von Carmela Vitale, einer Doktorandin aus unserem Labor, demonstriert.Nach dem Design der microRNAs und der Konstruktion eines rekombinanten Vektors zur Expression der microRNAs und der optogenetischen Sonde bereiten Sie primäre neuronale Kulturen aus der interessierenden Gehirnregion vor. Um dies zu erreichen, befolgen Sie ein etabliertes Kortikokulturprotokoll von L.A.Cingolani and Company mit den folgenden Änderungen. Verwenden Sie zunächst Sechs-Well-Platten, plattieren Sie eine halbe Million Neuronen pro Well und verwenden Sie 2,5 Milliliter Attachment-Medium pro Well.Nachdem Sie die Platte vier Stunden lang inkubiert haben, wechseln Sie zu 3,3 Millilitern Erhaltungsmedium pro Vertiefung, und wenn eine Überwucherung der Astrozyten beobachtet wird, fügen Sie 0,5 Milliliter Erhaltungsmedium hinzu, ergänzt mit 7,5 Mikromolar AraC bei drei bis vier DIVs. Infizieren Sie bei fünf bis sechs DIVs drei Vertiefungen für jede zu testende microRNA. Verwenden Sie die niedrigste infektiöse Dosis, die mindestens 99 % der Neuronen infiziert.Geben Sie das Virus direkt zu den Neuronen, mischen Sie vorsichtig und stellen Sie die Platten wieder bei 37 Grad Celsius in den Inkubator. Bei 17 bis 18 DIVs lysieren Sie die Neuronen für eine RNA-Extraktion. Kippen Sie die Platten und verwenden Sie Glaspipetten, um das gesamte Medium aus jeder Vertiefung zu entfernen.Geben Sie dann sofort 700 Mikroliter Lysereagenz in jede Vertiefung. Nach einem kurzen Mischen wird das Zelllysat aus jeder Vertiefung in separate 1,5-Milliliter-Röhrchen überführt. Fügen Sie dann jedem Lysat 140 Mikroliter Chloroform hinzu.Verschließen Sie die Röhrchen schnell und schütteln Sie sie 15 Sekunden lang kräftig, um den Inhalt zu emulgieren. Als nächstes zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 12.000 mal G für 15 Minuten bei vier Grad Celsius. Übertragen Sie dann vorsichtig die obere wässrige Phase, die die RNA enthält, in ein neues Röhrchen.Lassen Sie die Pipettenspitze nicht die organische Phase berühren. In die wässrige Phase geben Sie 1,5 Volumen 100%iges Ethanol und pipettieren Sie die Lösung langsam dreimal, um sie zu mischen. Aufreinigen Sie dann die RNA mit einem kommerziell erhältlichen Kit und quantifizieren Sie die Ausbeuten.Rechnen Sie mit mindestens 3,5 Mikrogramm pro Probe. Die Verhältnisse für die Reinheit gegenüber Proteinen und organischen Verbindungen sollten beide mindestens 1,9 betragen. Verwenden Sie als Nächstes ein Kit, um 250, 500 oder 1.000 Nanogramm RNA zu retrotranskribieren.Quantifizieren Sie dann die Knockdown-Effizienz für das endogene Gen von Interesse durch quantitative RTPCR. Streben Sie eine Knockdown-Effizienz von mindestens 60 % anFür dieses Protokoll verwenden Sie ein Tier, dem vor 15 Tagen oder länger RAAV12 in das Gehirn injiziert wurde, gemäß einem zuvor veröffentlichten Protokoll von A.Cetin and Company. Isolieren Sie das Gehirn und machen Sie akute Hirnschnitte mit einem Vibratom und gasförmigem eiskaltem ACFF.Sammeln Sie die Scheiben der interessierenden Region und minimieren Sie deren Lichteinwirkung, um eine Aktivierung der optogenetischen Sonde zu vermeiden. Lassen Sie die Scheiben 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius im selben ACFF ziehen. Verwenden Sie eine Kammer, die speziell für die Aufnahme von Hirnschnitten entwickelt wurde.Bringen Sie die Scheiben dann wieder auf Raumtemperatur, wo sie sechs bis acht Stunden lang gesund bleiben. Um fortzufahren, übertragen Sie eine Scheibe in die Aufnahmekammer und überfusionieren Sie sie mit zwei Millilitern ACFF pro Minute. Überprüfen Sie anschließend kurz das Signal des exprimierten fluoreszierenden Reporters, um die Lokalisation und Intensität der Infektion zu ermitteln.Füllen Sie dann eine Patch-Elektrode mit der intrazellulären Lösung. Unter Infrarotbeleuchtung erhalten Sie nun eine dicht verschlossene Großhandelskonfiguration auf einem Neuron, das synaptische Eingaben von den infizierten Neuronen empfängt. Der Serienwiderstand kann nicht kompensiert werden, sollte aber konstant und gering sein.Wenn beispielsweise CA3-Pyramidenneuronen infiziert wurden, patchen Sie die Pyramidenneuronen im proximalen bis medialen Trakt der CA1-Region. Wenn die Zellen geschrumpft oder geschwollen aussehen, wenn das Patchen schwierig wird oder die Chargen instabil sind, sind die ausgewählten Schichten nicht mehr gesund genug, um von ihnen aufzunehmen. Verwenden Sie als Nächstes die Pharmakologie, um die zu untersuchenden synaptischen Ströme zu isolieren.Wenn das Ziel beispielsweise darin besteht, die exzitatorische synaptische Übertragung zu untersuchen, blockieren Sie die inhibitorische synaptische Übertragung, indem Sie Bicucullin in das Bad geben. Rufen Sie dann synaptische Ströme, wie z. B. exzitatorische postsynaptische Ströme, mit einem 473 Nanometer großen blauen Laser hervor, der an eine optische Faser gekoppelt ist, die auf den Somata der infizierten Neuronen positioniert ist. Richten Sie den Laser nicht auf die Axone der Neuronen.Vermeiden Sie es beispielsweise, die Shaffer-Sicherheiten ins Dunkel zu bringen. Eine direkte Depolarisation der Axone ist nicht erwünscht. Passen Sie dann die Stimulationslänge auf ein Minimum an, um die Möglichkeit zu verringern, mehr als ein Aktionspotential pro Lichtimpuls hervorzurufen.Verfeinern Sie als Nächstes die Intensität des Lasers, um einen kleinen, aber deutlich nachweisbaren synaptischen Strom hervorzurufen. Passen Sie beispielsweise für die exzitatorische synaptische Übertragung zwischen CA3- und CA1-Pyramidenneuronen die Intensität des Lasers so an, dass synaptische Ströme von 20 bis 50 Pikoampere hervorgerufen werden. Am Ende des Experiments wird Tetrodotoxin in einer Konzentration von 0,5 Mikromolaren aufgetragen, um die Natriumkanäle zu blockieren.Die Empfindlichkeit der optisch evozierten Ströme gegenüber Tetrodotoxin deutet darauf hin, dass sie vom Aktionspotential gesteuert werden. Sammeln Sie so lange Daten, bis mindestens acht Neuronen von mindestens drei verschiedenen Tieren für eine bestimmte Erkrankung gepatcht wurden. Dies sind die Mindestdaten, die für die Analyse der Ergebnisse erforderlich sind.Mit Hilfe des beschriebenen Verfahrens wurden alternative Spleißisoformen der präsynaptischen P/Q-Typ spannungsgesteuerten Calciumkanäle abgeschaltet. Es wird angenommen, dass diese Kanäle die kurzfristige synaptische Plastizität an erregenden Synapsen von CA3 bis CA1 regulieren. Es wurden vier verschiedene Konstrukte hergestellt, die isoformspezifische microRNAs exprimieren; Jede wurde zusammen mit einem ultraschnellen Kanal Rhodopsin zusammen mit dem fluoreszierenden Protein Td-Tomato exprimiert.Zunächst wurde bestätigt, dass jedes Konstrukt eine ausreichende Knockdown-Effizienz und Selektivität in primären neuronalen Rattenkulturen unter Verwendung der isoformspezifischen quantitativen RTPCR aufweist. Als nächstes wurde jedes Konstrukt in den Hippocampus von P18-Ratten injiziert. Letztendlich wurde der Effekt der Konstrukte auf die kurzfristige synaptische Plastizität an CA3- bis CA1-Synapsen untersucht, indem infizierte CA3-Pyramidenneuronen mit kurzen Impulsen von 473-Nanometer-Licht stimuliert und die resultierenden EPSCs in Großkonfiguration aus pyramidalen Neuronen der CA1-Region aufgezeichnet wurden.Der Knockdown verschiedener Spleiß-Isoformen beeinflusste die Reaktionen auf die gepaarte Pulsstimulation in entgegengesetzte Richtungen. Knockdown der A-Isoform verstärkte gepaarte Impulserleichterung; während sie durch das Ausschalten der B-Isoform abgeschafft wurde. Die Kombination von RNA-Interferenzen Die Optogenetik ermöglicht die Forschung auf dem Gebiet der synaptischen Physiologie, um zu untersuchen, wie präsynaptische Proteine die kurzfristige synaptische Plastizität in intakten Schaltkreisen regulieren.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man microRNAs auf RNA-Interferenz validiert und wie man sie mit der Optogenetik kombiniert, um die synaptische Übertragung in akuten Hirnschnitten zu untersuchen.

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Neurowissenschaften

Dieses Video zeigt die microRNA-vermittelte Hemmung von exzitatorischen synaptischen Strömen in Hippocampus-Hirnschnitten von Mäusen. Die CA3-Neuronen wurden mit einem rekombinanten viralen Vektor infiziert, der ein Konstrukt zur Expression eines fluoreszierenden Reporters, einen lichtaktivierten Membrankanal und eine microRNA enthält, die die Expression von spannungsgesteuerten Kalziumkanälen herunterreguliert. Nach dem Platzieren einer Scheibe in einer Aufnahmekammer und dem Patchen eines...

MicroRNA-vermittelte Hemmung exzitatorischer postsynaptischer Ströme in Hippocampusschnitten der Maus

MicroRNAs haben eine bedeutende Rolle in der Struktur des Gehirns und Funktion. Hier beschreiben wir eine Methode, um durchzusetzen Hippocampus miRNA-Überexpression mit stereotaktische Injektion eines gentechnisch miRNA-Expression lentivirus. Dieser Ansatz kann als eine relativ schnelle Weg zu der Beurteilung...

Stereotaktische Injektion von microRNA-exprimierenden Lentiviren der Maus Hippocampus CA1 Region und Beurteilung der Behavioral Outcome

Die jüngste Entwicklung der Neurowissenschaften Tools, die Genetik und Optik zu kombinieren, die als "Optogenetik", ermöglicht die Kontrolle über die neuronalen Schaltkreis-Aktivität mit einem beispiellosen Maß an räumlicher und zeitlicher Auflösung. Hier bieten wir ein Protokoll für die Integration von In-vivo-Aufnahme mit optogenetischen Manipulation von genetisch definierte Untergruppen von präfrontalen kortikalen und subicular Pyramidenzellen.

Eine Methode zur High Fidelity optogenetische Kontrolle der Einzelpyramidenzellen<em&gt; In-vivo-</em

Wir beschreiben eine Methode zur Charakterisierung der funktionellen Topographie und der synaptischen Eigenschaften von Vorderhirnschaltkreisen unter Verwendung eines optogenetischen Ansatzes zur Photostimulation neuronaler Populationen in vitro.

Laser-Scanning-Photostimulation von optogenetisch ausgerichteten Vorderhirn-Schaltkreisen

Optogenetik ist zu einem mächtigen Werkzeug für den Einsatz in verhaltensneurowissenschaftlichen Experimenten geworden. Dieses Protokoll bietet eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für das Design und die Einrichtung von Lasersystemen und bietet ein vollständiges Protokoll für die Durchführung mehrerer und gleichzeitiger optogenetischer In-vivo-Stimulationen, die mit den meisten Verhaltenstestparadigmen von Nagetieren kompatibel sind.

In vivo optogenetische Stimulation des Nager Central Nervous System

Ein Protokoll zur Generierung eines Co-Kultursystems, bestehend aus Neuronen, die von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) abstammen, primären kortikalen Neuronen und Astrozyten wird beschrieben. Dieses Co-Kultursystem ermöglicht den Nachweis der Bildung von synaptischen Kontakten und Schaltkreisen zwischen neuen, iPSC-abgeleiteten Neuronen und bereits vorhandenen kortikalen Neuronen, die Channelrhodopsin-2 exprimieren.

Ein optogenetische Ansatz zur Abschätzung Bildung neuronaler Verbindungen in einer Co-Kultursystem

Hier beschreiben wir Methoden der optogenetischen Manipulation bestimmter Arten von Neuronen bei der Überwachung von Schlaf-/Wachzustanden bei Mäusen und stellen unsere jüngsten Arbeiten am Bettkern der Stria terminalis als Beispiel vor.

Optogenetische Manipulation von neuronalen Schaltkreisen während der Überwachung von Schlaf-/Wachzustanden bei Mäusen

Das Ziel dieses Protokolls ist es, einen Ansatz zur Analyse des Verhaltens von adulten neuronalen Stamm-/Vorläuferzellen als Reaktion auf die chemogenetische Manipulation eines bestimmten lokalen neuronalen Schaltkreises zu beschreiben.

Assaying Circuit Spezifische Regulation von adulthippocampal neuralen Vorläuferzellen

Mit optogenetischer Manipulation bestimmter neuronaler Populationen oder Hirnregionen kann das Verhalten bei frei beweglichen Tieren mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung verändert werden. Durch den Einsatz verschiedener optogenetischer Werkzeuge in Kombination mit chronisch implantierten optischen Fasern kann eine Vielzahl neuronaler Modulationen und Verhaltenstests durchgeführt werden.

Optogenetische Manipulation der neuronalen Aktivität, um das Verhalten bei frei beweglichen Mäusen zu modulieren

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das die virale Transduktion diskreter Hirnregionen mit optogenetischen Konstrukten beschreibt, um eine synapsenspezifische elektrophysiologische Charakterisierung in akuten Nagetierhirnschnitten zu ermöglichen.

Ex vivo Optogenetische Befragung der synaptischen Übertragung und Plastizität über große Entfernungen vom medialen präfrontalen Kortex zum lateralen entohinalen Kortex

In dieser Arbeit beschreiben wir ein Protokoll, das die Adeno-assoziierte Virusinjektion mit der Implantation eines Schädelfensters kombiniert, um die Dynamik der Mikroglia und die neuronale Aktivität in wachen Mäusen simultan abzubilden.

Simultane Bildgebung von Mikrogliadynamik und neuronaler Aktivität in wachen Mäusen

Lernen Sie die Kombination von Optogenetik mit künstlichen Mikro-RNAs zur Charakterisierung genetischer Knockdown-Effekte auf präsynaptische Funktionen in neuronalen Schaltkreisen. Diese Methode ermöglicht präzise Untersuchungen synaptischer Übertragung in akuten Hirnschnitten.

Kombination von Optogenetik mit künstlichen Mikro-RNAs, die Effekte gen Knockdown präsynaptischen Funktion innerhalb intakte neuronale Schaltkreise zu charakterisieren (Video) | JoVE Journal

Kombination von Optogenetik mit künstlichen Mikro-RNAs, die Effekte gen Knockdown präsynaptischen Funktion innerhalb intakte neuronale Schaltkreise zu charakterisieren

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