Kombination von Optogenetik mit künstlichen Mikro-RNAs, die Effekte gen Knockdown präsynaptischen Funktion innerhalb intakte neuronale Schaltkreise zu charakterisieren

Das übergeordnete Ziel der Kombination von künstlicher microRNA-vermittelter RNA-Interferenz mit Optogenetik ist es, den Effekt des Gen-Knockdowns auf die präsynaptische Funktion innerhalb intakter neuronaler Schaltkreise zu charakterisieren. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der synaptischen Physiologie zu beantworten, wie z.B. die physiologische Rolle präsynaptischer Proteine in intakten Gehirnschaltkreisen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie es ermöglicht, die synaptische Übertragung selektiv an Neuronen mit reduzierter Expression des untersuchten präsynaptischen Proteins zu überwachen.

Wir haben diese Methode auch verwendet, um die präsynaptische Funktion in akuten Hirnschnitten zu untersuchen. Es kann auch zur Manipulation und Untersuchung der neuronalen Sicherheit in vivo eingesetzt werden. Das Verfahren wird von Carmela Vitale, einer Doktorandin aus unserem Labor, demonstriert.

Nach dem Design der microRNAs und der Konstruktion eines rekombinanten Vektors zur Expression der microRNAs und der optogenetischen Sonde bereiten Sie primäre neuronale Kulturen aus der interessierenden Gehirnregion vor. Um dies zu erreichen, befolgen Sie ein etabliertes Kortikokulturprotokoll von L.A.Cingolani and Company mit den folgenden Änderungen. Verwenden Sie zunächst Sechs-Well-Platten, plattieren Sie eine halbe Million Neuronen pro Well und verwenden Sie 2,5 Milliliter Attachment-Medium pro Well.

Nachdem Sie die Platte vier Stunden lang inkubiert haben, wechseln Sie zu 3,3 Millilitern Erhaltungsmedium pro Vertiefung, und wenn eine Überwucherung der Astrozyten beobachtet wird, fügen Sie 0,5 Milliliter Erhaltungsmedium hinzu, ergänzt mit 7,5 Mikromolar AraC bei drei bis vier DIVs. Infizieren Sie bei fünf bis sechs DIVs drei Vertiefungen für jede zu testende microRNA. Verwenden Sie die niedrigste infektiöse Dosis, die mindestens 99 % der Neuronen infiziert.

Geben Sie das Virus direkt zu den Neuronen, mischen Sie vorsichtig und stellen Sie die Platten wieder bei 37 Grad Celsius in den Inkubator. Bei 17 bis 18 DIVs lysieren Sie die Neuronen für eine RNA-Extraktion. Kippen Sie die Platten und verwenden Sie Glaspipetten, um das gesamte Medium aus jeder Vertiefung zu entfernen.

Geben Sie dann sofort 700 Mikroliter Lysereagenz in jede Vertiefung. Nach einem kurzen Mischen wird das Zelllysat aus jeder Vertiefung in separate 1,5-Milliliter-Röhrchen überführt. Fügen Sie dann jedem Lysat 140 Mikroliter Chloroform hinzu.

Verschließen Sie die Röhrchen schnell und schütteln Sie sie 15 Sekunden lang kräftig, um den Inhalt zu emulgieren. Als nächstes zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 12.000 mal G für 15 Minuten bei vier Grad Celsius. Übertragen Sie dann vorsichtig die obere wässrige Phase, die die RNA enthält, in ein neues Röhrchen.

Lassen Sie die Pipettenspitze nicht die organische Phase berühren. In die wässrige Phase geben Sie 1,5 Volumen 100%iges Ethanol und pipettieren Sie die Lösung langsam dreimal, um sie zu mischen. Aufreinigen Sie dann die RNA mit einem kommerziell erhältlichen Kit und quantifizieren Sie die Ausbeuten.

Rechnen Sie mit mindestens 3,5 Mikrogramm pro Probe. Die Verhältnisse für die Reinheit gegenüber Proteinen und organischen Verbindungen sollten beide mindestens 1,9 betragen. Verwenden Sie als Nächstes ein Kit, um 250, 500 oder 1.000 Nanogramm RNA zu retrotranskribieren.

Quantifizieren Sie dann die Knockdown-Effizienz für das endogene Gen von Interesse durch quantitative RTPCR. Streben Sie eine Knockdown-Effizienz von mindestens 60 % anFür dieses Protokoll verwenden Sie ein Tier, dem vor 15 Tagen oder länger RAAV12 in das Gehirn injiziert wurde, gemäß einem zuvor veröffentlichten Protokoll von A.Cetin and Company. Isolieren Sie das Gehirn und machen Sie akute Hirnschnitte mit einem Vibratom und gasförmigem eiskaltem ACFF.

Sammeln Sie die Scheiben der interessierenden Region und minimieren Sie deren Lichteinwirkung, um eine Aktivierung der optogenetischen Sonde zu vermeiden. Lassen Sie die Scheiben 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius im selben ACFF ziehen. Verwenden Sie eine Kammer, die speziell für die Aufnahme von Hirnschnitten entwickelt wurde.

Bringen Sie die Scheiben dann wieder auf Raumtemperatur, wo sie sechs bis acht Stunden lang gesund bleiben. Um fortzufahren, übertragen Sie eine Scheibe in die Aufnahmekammer und überfusionieren Sie sie mit zwei Millilitern ACFF pro Minute. Überprüfen Sie anschließend kurz das Signal des exprimierten fluoreszierenden Reporters, um die Lokalisation und Intensität der Infektion zu ermitteln.

Füllen Sie dann eine Patch-Elektrode mit der intrazellulären Lösung. Unter Infrarotbeleuchtung erhalten Sie nun eine dicht verschlossene Großhandelskonfiguration auf einem Neuron, das synaptische Eingaben von den infizierten Neuronen empfängt. Der Serienwiderstand kann nicht kompensiert werden, sollte aber konstant und gering sein.

Wenn beispielsweise CA3-Pyramidenneuronen infiziert wurden, patchen Sie die Pyramidenneuronen im proximalen bis medialen Trakt der CA1-Region. Wenn die Zellen geschrumpft oder geschwollen aussehen, wenn das Patchen schwierig wird oder die Chargen instabil sind, sind die ausgewählten Schichten nicht mehr gesund genug, um von ihnen aufzunehmen. Verwenden Sie als Nächstes die Pharmakologie, um die zu untersuchenden synaptischen Ströme zu isolieren.

Wenn das Ziel beispielsweise darin besteht, die exzitatorische synaptische Übertragung zu untersuchen, blockieren Sie die inhibitorische synaptische Übertragung, indem Sie Bicucullin in das Bad geben. Rufen Sie dann synaptische Ströme, wie z. B. exzitatorische postsynaptische Ströme, mit einem 473 Nanometer großen blauen Laser hervor, der an eine optische Faser gekoppelt ist, die auf den Somata der infizierten Neuronen positioniert ist. Richten Sie den Laser nicht auf die Axone der Neuronen.

Vermeiden Sie es beispielsweise, die Shaffer-Sicherheiten ins Dunkel zu bringen. Eine direkte Depolarisation der Axone ist nicht erwünscht. Passen Sie dann die Stimulationslänge auf ein Minimum an, um die Möglichkeit zu verringern, mehr als ein Aktionspotential pro Lichtimpuls hervorzurufen.

Verfeinern Sie als Nächstes die Intensität des Lasers, um einen kleinen, aber deutlich nachweisbaren synaptischen Strom hervorzurufen. Passen Sie beispielsweise für die exzitatorische synaptische Übertragung zwischen CA3- und CA1-Pyramidenneuronen die Intensität des Lasers so an, dass synaptische Ströme von 20 bis 50 Pikoampere hervorgerufen werden. Am Ende des Experiments wird Tetrodotoxin in einer Konzentration von 0,5 Mikromolaren aufgetragen, um die Natriumkanäle zu blockieren.

Die Empfindlichkeit der optisch evozierten Ströme gegenüber Tetrodotoxin deutet darauf hin, dass sie vom Aktionspotential gesteuert werden. Sammeln Sie so lange Daten, bis mindestens acht Neuronen von mindestens drei verschiedenen Tieren für eine bestimmte Erkrankung gepatcht wurden. Dies sind die Mindestdaten, die für die Analyse der Ergebnisse erforderlich sind.

Mit Hilfe des beschriebenen Verfahrens wurden alternative Spleißisoformen der präsynaptischen P/Q-Typ spannungsgesteuerten Calciumkanäle abgeschaltet. Es wird angenommen, dass diese Kanäle die kurzfristige synaptische Plastizität an erregenden Synapsen von CA3 bis CA1 regulieren. Es wurden vier verschiedene Konstrukte hergestellt, die isoformspezifische microRNAs exprimieren; Jede wurde zusammen mit einem ultraschnellen Kanal Rhodopsin zusammen mit dem fluoreszierenden Protein Td-Tomato exprimiert.

Zunächst wurde bestätigt, dass jedes Konstrukt eine ausreichende Knockdown-Effizienz und Selektivität in primären neuronalen Rattenkulturen unter Verwendung der isoformspezifischen quantitativen RTPCR aufweist. Als nächstes wurde jedes Konstrukt in den Hippocampus von P18-Ratten injiziert. Letztendlich wurde der Effekt der Konstrukte auf die kurzfristige synaptische Plastizität an CA3- bis CA1-Synapsen untersucht, indem infizierte CA3-Pyramidenneuronen mit kurzen Impulsen von 473-Nanometer-Licht stimuliert und die resultierenden EPSCs in Großkonfiguration aus pyramidalen Neuronen der CA1-Region aufgezeichnet wurden.

Der Knockdown verschiedener Spleiß-Isoformen beeinflusste die Reaktionen auf die gepaarte Pulsstimulation in entgegengesetzte Richtungen. Knockdown der A-Isoform verstärkte gepaarte Impulserleichterung; während sie durch das Ausschalten der B-Isoform abgeschafft wurde. Die Kombination von RNA-Interferenzen Die Optogenetik ermöglicht die Forschung auf dem Gebiet der synaptischen Physiologie, um zu untersuchen, wie präsynaptische Proteine die kurzfristige synaptische Plastizität in intakten Schaltkreisen regulieren.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man microRNAs auf RNA-Interferenz validiert und wie man sie mit der Optogenetik kombiniert, um die synaptische Übertragung in akuten Hirnschnitten zu untersuchen.