Ein Kaninchen-Modell der dauerhafte Transgene Ausdruck in Halsschlagader, gemeinsame Halsschlagader Interposition Grafts

Diese Methode kann wichtige Fragen zur Pathogenese des Versagens von Venentransplantaten beantworten. So könnten beispielsweise Vermittler des Transplantatversagens identifiziert und Strategien zur Verhinderung des Transplantatversagens getestet werden. Der Hauptvorteil dieser Technik ist ihre Fähigkeit, eine dauerhafte, stabile Transgenexpression im Endothel des Venentransplantats zu erreichen.

Nachdem Sie ein Kaninchen gemäß dem Textprotokoll betäubt haben, rasieren Sie das Tier von der sternalen Kerbe bis zum Rand des Unterkiefers. Nach Abschluss des chirurgischen Aufbaus wird die Haut entlang der Mittellinie zwischen der sternalen Kerbe und dem Unterkiefer mit Elektrokauter durchtrennt, die etwa sieben bis neun Zentimeter lang ist. Befestigen Sie dann Handtuchklammern, um den Schnitt offen zu halten.

Präparieren Sie stumpf unter der Faszie entlang der gesamten Mittellinie. Verwende dann einen Elektrokauter, um die präparierte Faszienschicht entlang der Mittellinie zu durchtrennen. Beginnen Sie dann auf der rechten Seite und präparieren Sie zwischen dem Musculus zungenbeins, der über der Luftröhre liegt, und dem Musculus sternoephalicas, um die Arteria carotis communis freizulegen.

Präparieren Sie dann vorsichtig ein vier bis fünf Zentimeter langes Segment der Arteria carotis communis und ihre größeren Äste, die vom umgebenden Gewebe befreit sind. Verwenden Sie 5-0-Seidennähte, um die größeren Äste der Arteria carotis communis zu ligieren, bevor Sie jeden Ast distal der Naht durchtrennen. Nach Wiederholung der Dissektion an der linken Halsschlagader wird die subkutane Gewebeschicht mit einer Gewebehaltezange vorübergehend verschlossen.

Präparieren Sie dann die oberflächliche Faszie auf der rechten Seite von der Haut, bis die Vena jugularis externa freiliegt. Präparieren Sie ein vier bis fünf Zentimeter großes Segment der Vena jugularis externa und befreien Sie deren Äste vom umgebenden Gewebe. Verwenden Sie 5-0 Seidennähte, um die Äste zu ligieren, und schneiden Sie dann die Äste ab.

Als nächstes ligatieren Sie die isolierte Vene an beiden Enden, schneiden Sie das Schädelende ab und spülen Sie das Lumen mit heparinisierter Kochsalzlösung. Um eine Venentransplantation durchzuführen, verwenden Sie einen Gefäßclip, um die rechte Arteria carotis communis am kranialen Ende des isolierten Segments zu klemmen. Platzieren Sie dann einen Gefäßclip am kaudalen Ende.

Führen Sie nun eine kaudale Arteriotomie direkt kranial zur Schwanzklemme durch, die in der Länge dem Durchmesser des kranialen Endes des Venensegments entspricht. Führen Sie dann einen IV-Katheter ein, der mit einer Spritze mit heparinisierter normaler Kochsalzlösung durch die kaudale Arteriotomie verbunden ist, und spülen Sie das Lumen der Halsschlagader. Die Flüssigkeit tritt über die Arteriotomie aus.

Wenn Sie zur Halsvene zurückkehren, entfernen Sie die Vene und legen Sie sie neben die Arteria caroticus. Mit Einzelstichen aus 7-0 Polypropylen wird das kaudale Ende der kaudalen Arteriotomie mit dem kranialen Ende des Venensegments vernäht. Platzieren Sie dann einen zweiten Stich um 180 Grad vom ersten Stich entfernt, um den Schädelrand der kaudalen Arteriotomie mit dem kranialen Ende des Venensegments zu vernähen.

Platzieren Sie einen dritten Stich an einem Punkt, der gleich weit von den ersten beiden Maschen auf der lateralen Seite der Anastomose entfernt ist. Platzieren Sie dann einen vierten Stich auf der medialen Seite der Anastomose in gleichem Abstand zu den ersten beiden Maschen und gegenüber dem dritten Maschen. Zwischen den Maschen eins bis vier jeweils vier zusätzliche Maschen platzieren.

Führen Sie die kraniale Arteriotomie auf der kaudalen Seite des distalen Clips durch. Der Abstand zwischen dem kranialen Ende der kranialen Arteriotomie und dem kaudalen Ende der kaudalen Arteriotomie sollte der Länge des Venensegments entsprechen. Die Länge der kranialen Arteriotomie entspricht dem Durchmesser des kaudalen Endes des Venensegments.

Wenn die Vene von der Anastomose entlang der Halsschlagader nach kranial verlängert ist, stellen Sie sicher, dass die Vene nicht verdreht ist. Verwenden Sie dann heparinisierte normale Kochsalzlösung, um die Halsschlagader und die Vene über die kraniale Arteriotomie zu spülen. Als nächstes legen Sie einen ersten Stich an, um das kaudale Ende der kranialen Arteriotomie mit dem kaudalen Ende des Venensegments zu vernähen.

Platzieren Sie dann einen zweiten Stich in einem Winkel von 180 Grad vom ersten Stich, um den Schädelrand der Schädelarteriotomie mit dem kaudalen Ende des Venensegments zu vernähen. Schließen Sie die Anastomose ab, wie weiter oben im Video gezeigt. Lassen Sie den Schädelclip vorübergehend los, damit sich das Venentransplantat mit Blut füllen kann, und üben Sie sanften Druck mit trockener Gaze aus, um Blutungen zu stoppen.

Wiederholen Sie diesen Schritt, bis die Anastomose nicht mehr blutet. Entfernen Sie dann sowohl die Schädel- als auch die Schwanzklammern. Verwenden Sie Gaze, um zusätzliche Blutungen an den Anastomosen zu stoppen.

Verwenden Sie eine 3-0-Seidennaht, um beide Enden des Segments der Arteria carotis communis zwischen den Anastomosen zu ligieren. Teilen Sie dann die Halsschlagader zur Hälfte zwischen den Ligaturen. Lebhafte Pulsationen sollten im Venentransplantat zu sehen sein.

Wiederholen Sie die Platzierung des Venentransplantats auf der linken Seite. Mit einer 5-0 PGA-Naht verschließen Sie das Unterhautgewebe mit einem kontinuierlichen Muster. Verwenden Sie dann eine 3-0 PGA-Naht, um die Haut mit einem intradermalen Muster zu schließen und die Knoten an beiden Enden zu vergraben.

Führen Sie die postoperative Betreuung und den transkutanen Ultraschall gemäß dem Textprotokoll durch. Um einen Gentransfer durchzuführen, isolieren Sie vorsichtig das rechte Venentransplantat, einschließlich 1,5 bis zwei Zentimeter der an das Transplantat angrenzenden Halsschlagader, sowohl auf der kranialen als auch auf der kaudalen Seite. Wiederholen Sie die Dissektion auf der linken Seite auf die gleiche Weise.

Verwenden Sie normale Kochsalzlösung, um die chirurgische Wundhöhle auf der rechten Seite zu füllen, um die Übertragung von Schallwellen zu ermöglichen. Schließen Sie eine zwei Millimeter lange perivaskuläre Durchflusssonde an einen Volumenstrommesser an und tauchen Sie die Sonde in die Kochsalzlösung in der Wundhöhle ein. Stellen Sie die Durchflussmenge auf Null.

Platzieren Sie die Durchflusssonde um die Halsschlagader, entweder kaudal oder kranial zum Venentransplantat. Verwenden Sie dann ein elektronisches Datenerfassungssystem, um die Daten von der Durchflusssonde aufzuzeichnen. Nachdem Sie dem Kaninchen Heparin über den IV-Katheter injiziert und mit Kochsalzlösung gespült haben, verwenden Sie einen Gefäßclip, um die Arteria carotis communis am kranialen Ende des Venentransplantats zu klemmen.

Und dann legen Sie einen zweiten Clip auf die Halsschlagader, etwa 10 Millimeter kaudal zur kaudalen Anastomose, um Platz für die Arteriotomie zu schaffen. Legen Sie dann zwei Seidenbinder locker um die Halsschlagader, direkt kaudal des Venentransplantats. Als nächstes stechen Sie mit einer zuvor vorbereiteten gebogenen 21-Gauge-Nadel die Halsschlagader kaudal zum Transplantat und nur kranial zum kaudalen Gefäßclip.

Schieben Sie die Nadel zweimal in das Lumen hin und her, um sicherzustellen, dass das Lumen klar ist. Ziehen Sie dann die Nadel vorsichtig heraus. Nachdem Sie eine Spritze und einen IV-Katheter mit DMEM gemäß dem Textprotokoll vorbereitet haben, führen Sie es bis zum Beugepunkt in die Arteriotomie carotis communis ein und waschen Sie das Lumen des Venentransplantats, indem Sie es zweimal mit 0,5 Millilitern DMEM füllen.

Entfernen Sie das DMEM aus dem Transplantat, indem Sie mit einem behandschuhten Finger leicht auf das kraniale Ende des Transplantats drücken. Schieben Sie dann vorsichtig den Finger entlang des Transplantats in Richtung des kaudalen Endes des Transplantats, um den luminalen Inhalt über die Arteriotomie auszuspülen. Entfernen Sie die DMEM-Spritze aus dem Katheter und lassen Sie den Katheter im Gefäß.

Schließen Sie die Spritze mit der Viruslösung an und stellen Sie sicher, dass keine Luft in den Katheter eindringt. Bewegen Sie die locker verknoteten Seidenbinder in der Arterie nach unten, bis sie um die Katheterspitze herum sind, aber ziehen Sie sie nicht fest. Infusion von 0,03 Millilitern Viruslösung, um das restliche DMEM aus dem Katheter zu drücken.

Entfernen Sie dann mit einem Finger die gesamte Flüssigkeit aus dem Lumen des Venentransplantats, indem Sie sanft von kranial nach kaudal drücken. Ziehen Sie die beiden Bänder um die Arterie und die Katheterspitze fest, um das Lumen abzudichten. Ziehen Sie dann die Viruslösung, bis die Vene aufgebläht ist.

Legen Sie die Spritze vorsichtig auf ein Nest aus Gaze. Verwenden Sie nach 20 Minuten eine leere Spritze, um die virushaltige Lösung vorsichtig aus dem Transplantat zu aspirieren, bis das Gefäß kollabiert. Entfernen Sie die Spritze und lassen Sie den Katheter an Ort und Stelle.

Schneiden und lösen Sie dann die Seidennähte und ziehen Sie den Katheter aus dem Gefäß. Verwenden Sie nun 7-0 Polypropylen-Naht in einem X-Muster, um den Arteriotom zu schließen. Ziehen Sie dann vorsichtig an den Nahtenden und binden Sie sie mit zwei quadratischen Knoten zusammen.

Nach Wiederherstellung des Blutflusses im rechten Venentransplantat, wie im Textprotokoll beschrieben, wiederholen Sie die Virusinfusion auf der linken Seite. Um die transduzierten Transplantate zu entnehmen, präparieren Sie die Venentransplantate und die Arteria carotis communis und führen Sie Flussmessungen sowohl auf der linken als auch auf der rechten Seite durch, wie zuvor gezeigt. Verwenden Sie eine 3-0-Seidennaht, um den rechten Schädel der Arteria carotis communis zum Transplantat zu ligieren.

Verwenden Sie dann eine 3-0-Seidennaht, um die Halsschlagader kaudal mit dem Transplantat zu verbinden. Exzitieren Sie das rechte Venentransplantat, indem Sie die benachbarte Halsschlagader zwischen jeder der Ligaturen und der angrenzenden Anastomose aufteilen. Entfernen Sie dann das Venentransplantat vom Kaninchen und verwenden Sie Kochsalzlösung, um das Lumen zu spülen.

Der erste Meilenstein, den ein neuer Bediener erreichen muss, ist die konsistente Durchgängigkeit des Venentransplantats sowohl nach der ersten Venentransplantation als auch nach der anschließenden verzögerten Transduktionsoperation. Wenn ein Venentransplantat patentiert ist, zeigt die Ultraschalluntersuchung ein großes Blutgefäß mit einem lebhaften Blutfluss von kaudal zu kranial. Die Transplantate wurden drei Tage nach der Transduktion entnommen, in Abschnitte geschnitten und mit X-Gal gefärbt.

Die En-Face-Bildgebung der luminalen Oberflächen zeigte Venentransplantate mit effizienter Transduktion und schlechter Transduktion. Wie in diesem Diagramm gezeigt, unterschieden sich die Spiegel der Beta-Galactosidase-mRNA in Venentransplantaten, die vom neuen Operateur transduziert wurden, nicht signifikant von den Spiegeln der Beta-Galactosidase-mRNA in Venentransplantaten, die von einem erfahrenen Operateur transduziert wurden. Bei der Durchführung dieses Protokolls ist es wichtig, daran zu denken, das Venentransplantat kranial zu kaudal umzukehren, bevor die Anastomose kontrahiert wird.

Dies ist notwendig, um eine Behinderung des Blutflusses durch venösen Bolus zu vermeiden. Sobald diese Operationen gemeistert sind, können sie in etwa drei Stunden für die Venentransplantation, zwei Stunden für das Gentransferverfahren für die Venentransplantation und 45 Minuten für die Entnahme abgeschlossen werden. Vergessen Sie nicht, dass, da dieses Protokoll die Arbeit mit viralen Vektoren und scharfen Gegenständen erfordert, die richtigen Biosicherheits- und scharfen Sicherheitsvorkehrungen befolgt werden müssen.