Name: Herstellung von Zunge extrazellulären Matrix und Rekonstitution der Zunge Squamous Zelle Krebsgeschwür In-vitro- (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Erfahren Sie die Herstellung von Zungen-Extrazellulärmatrix durch Dezellularisierung und deren Nutzung als 3-D-Scaffold für ein Zungenplattenepithelkarzinom-Modell. Diese Methode ermöglicht realistischere In-vitro-Studien zur Krebsbiologie.

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Die Autoren erkennen die Unterstützung von Forschungsstipendien von National Natural Science Foundation of China (31371390), das Programm des staatlichen Hightech-Development Project (2014AA020702) und das Programm von Guangdong Wissenschaft und Technik (2016B030231001).

Alle tierische Arbeit war gemäss Tierschutzgesetz, institutionellen Richtlinien durchgeführt und durch institutionelle Animal Care and Use Committee, Sun Yat-Sen-Universität genehmigt.
1. Vorbereitung der TEM
<ol><li>Ausführen von Mäusen durch zervikale Dislokation und entfernen Sie die Zungen mit sterile chirurgische Scheren und Pinzetten.</li>
	<li>Tauchen Sie die Zungen in 75 % Ethanol für 3 min, dann setzen jede Zunge in 1,5 mL Eppendorf (EP)-Röhrchen mit 1 mL 10 mM steril Phosphat gepufferte Lösung (PBS). Hinweis: Die Konzentration der PBS in den folgenden Schritten ist identisch mit der Konzentration in diesem Schritt.</li>
	<li>Zell-Lyse durch Frost-Tau-wechseln: Einfrieren der Zungen in EP-Rohre bei-80 ° C für 1 h, und dann auftauen die Zungen bei Raumtemperatur für 45 min 3 Zyklen.</li>
	<li>Laden Sie jede Zunge auf ein Stück der chirurgischen Naht mit einer chirurgischen Nadel und wickeln Sie das Ende der Naht mit einem kleinen Stück sterile Alufolie. Führen Sie den Vorgang in der Kulturschale 3,5 cm oder 6 cm mit 75 % igem Ethanol unter sterilen Bedingungen. Hinweis: Die entsprechende Länge der einzelnen chirurgischen Naht ist ca. 20 cm und die entsprechende Größe der jedes Stück Alufolie ist etwa 0,3 cm2 (1 cm × 0,3 cm). Die Zunge sollte in der Nähe der Alufolie geladen werden.</li>
	<li>Spülen Sie jede Zunge mit 3 mL sterile PBS 30 S. führen diese Operation unter sterilen Bedingungen in der Kulturschale 3,5 cm oder 6 cm.</li>
	<li>Waschen Sie die Zungen mit Reinstwasser: eine Endkonzentration von 90 µg/mL Ampicilin in eine breit-Mund-Flasche mit 250 mL steriles ultrapure Wasser hinzufügen. Legen Sie die Zungen in die Flasche mit einer Stir Bar. Ziehen Sie die Kronkorken mit Bestandteil der Naht bleibt außerhalb der Flaschenhals. Führen Sie diesen Vorgang unter sterilen Bedingungen. Hinweis: Bis zu 5 Sprachen können in der gleichen Flasche unter Berücksichtigung des Nahtmaterials Schlinger genommen werden. Die Alufolie ist am Ende der Naht in der Flasche zu verhindern, dass die Zunge rutscht. Die Zungen sollte 2 cm hoch vom Boden der Flasche durch Einstellen der Länge des Nahtmaterials in der Flasche verbleibende platziert werden. Dieser Hinweis ist auch für Schritte 1,8, 1.10 und 1.12 1.16.</li>
	<li>Setzen Sie die Flasche auf einen Magnetrührer für 12 h.</li>
	<li>Waschen Sie die Zungen mit NaCl: Fügen Sie Ampicilin in einer breit-Mund-Flasche mit 250 mL sterile 1 M NaCl, eine Endkonzentration von 90 µg/mL. Bewegen Sie die Zungen und Stir Bar in der Flasche. Ziehen Sie die Kronkorken mit Bestandteil der Naht bleibt außerhalb der Flaschenhals. Führen Sie diesen Vorgang unter sterilen Bedingungen.</li>
	<li>Setzen Sie die Flasche auf einen Magnetrührer für 24 h.</li>
	<li>Zell-Lyse von Triton x-100: Ampicilin hinzufügen, eine Endkonzentration von 90 µg/mL in eine breit-Mund-Flasche mit 250 mL sterile 2 % Triton x-100 mit PBS-Puffer. Bewegen Sie die Zungen und Stir Bar in der Flasche. Ziehen Sie die Kronkorken mit Bestandteil der Naht bleibt außerhalb der Flaschenhals. Führen Sie diesen Vorgang unter sterilen Bedingungen.</li>
	<li>Setzen Sie die Flasche auf einen Magnetrührer für 48 h.</li>
	<li>Zungen mit CaCl2/MgCl2waschen: eine Endkonzentration von 90 µg/mL Ampicilin in eine breit-Mund-Flasche mit 250 mL sterile 5 mm CaCl2/MgCl2 hinzufügen. Bewegen Sie die Zungen und Stir Bar in der Flasche. Ziehen Sie die Kronkorken mit Bestandteil der Naht bleibt außerhalb der Flaschenhals. Führen Sie diesen Vorgang unter sterilen Bedingungen.</li>
	<li>Setzen Sie die Flasche auf einen Magnetrührer für 24 h.</li>
	<li>Verdauung durch DNase: Fügen Sie 1 mL Hank es ausgewogen Salzlösung (HBSS) zu jedem EP-Röhrchen. Fügen Sie DNase in HBSS bzw. um eine Endkonzentration von 300 µM. verschieben Sie jede Zunge in jedes EP-Rohr, mit einem Teil des Nahtmaterials außerhalb der Röhre. Führen Sie diesen Vorgang unter sterilen Bedingungen. Hinweis: Stellen Sie sicher, dass der Teil der Naht, die in die Flaschen in den vorherigen Schritten bleibt auch in der EP-Röhre in diesem Schritt bleibt, und stellen Sie sicher, dass der Teil der Naht, die außerhalb der Flaschen in den vorherigen Schritten bleibt auch außerhalb der EP-Rohr in diesem Schritt bleibt.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Zungen in EP-Röhrchen bei 37 ° C für 24 h.</li>
	<li>Die Zungen mit PBS waschen: Fügen Sie Ampicilin in einer breit-Mund-Flasche mit 250 mL sterile PBS, eine Endkonzentration von 90 µg/mL. Bewegen Sie die Zungen und Stir Bar in der Flasche. Ziehen Sie die Kronkorken mit Bestandteil der Naht bleibt außerhalb der Flaschenhals. Führen Sie diesen Vorgang unter sterilen Bedingungen.</li>
	<li>Setzen Sie die Flasche auf einen Magnetrührer für 24 h.</li>
	<li>Die vorbereitete TEM in sterilen PBS bei 4 ° C bis zur Verwendung aufbewahren.</li>
</ol>(2) dreidimensionale (3D) Rekonstitution von TSCC
<ol><li>
Statische TSCC-Modellbau
	<ol>
<li>1.0 x 106 einzelne TSCC Samenzellen (Cal27) in einer Kulturschale 3,5 cm. Fügen Sie 3 mL Dulbecco des Adlers Medium/F12 (DF12) mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS), 90 µg/mL Ampicilin und 90 µg/mL Kanamycin modifiziert.</li>
		<li>Kultur der Cal27 Zellen bei 37 ° C für 2 bis 3 Tage. Stellen Sie sicher, dass die Zellen von mindestens 60 % decken Bereich der unteren Schale.</li>
		<li>Laden Sie TEM auf der Cal27-Monolayer in der Kulturschale.</li>
		<li>Setzen Sie die Schale in eine CO2 Inkubator bei 37 ° C für 28 Tage.</li>
		<li>Aktualisieren Sie das Kulturmedium jeden Tag bei der Zelle Kultur. Die CO2 -Konzentration in den Inkubator beträgt 5 %.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Gerührten TSCC-Modellbau
	<ol>
<li>
Vorbereitung von einem selbstgebauten gerührten minibioreactor
		<ol>
<li>Nehmen Sie den Kolben aus einer 10 mL Spritze.</li>
			<li>Graben Sie ein Loch (Durchmesser von 1 cm) in der Nähe der Talstation des Stabes und Laden einer Stir Bar in das Loch.</li>
			<li>Graben Sie ein Loch (Durchmesser von 0,5 cm) in der Mitte der Deckel der Flasche eine Plastikflasche breit-Mund und legte die Kolbenstange durch die GAP.</li>
			<li>Schneiden Sie die Hälfte einer 50 mL Zentrifugenröhrchen und auf der äußeren Seite der Deckel der Flasche zu Schweißen.</li>
			<li>Legen Sie Angelhaken auf der Rute durch Umwickeln mit Angelschnüre, die an den Angelhaken gebunden sind. Hinweis: Können bis zu 4 Angelhaken zu einem Stab angebracht werden.</li>
			<li>Autoklaven der selbstgemachten Komplex vor Gebrauch. Hinweis: Führen Sie nicht Autoklaven die Plastikflasche breit-Mund. Verwenden Sie eine neue sterile Plastikflasche breit-Mund während der Kultivierung von Zellen.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Dynamische Zellkultur
	<ol>
<li>Samen 1.0 x 106 Cal27 Einzelzellen in selbstgebauten Minibioreactor. Hinzugeben Sie 150 mL DF12 Medium enthält 10 % FBS, 90 µg/mL Ampicilin und 90 µg/mL Kanamycin.</li>
		<li>Laden Sie TEM auf der Minibioreactor mit den Angelhaken an der Rute befestigt.</li>
		<li>Ziehen Sie den Deckel und legen Sie die Minibioreactor auf einen Magnetrührer. Aktivieren Sie die Minibioreactor bei 200 u/min in einem CO2 Inkubator bei 37 ° C für 7 bis 14 Tage. Hinweis: Die Konzentration von CO2 in die CO2 Inkubator beträgt 5 %.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Elfring, T., Boliek, C. A., Winget, M., Paulsen, C., Seikaly, H., Rieger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+between+lingual+and+hypoglossal+nerve+function+and+quality+of+life+in+head+and+neck+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Oral+Rehabil%22%5BJournal%5D)">The relationship between lingual and hypoglossal nerve function and quality of life in head and neck cancer.</a> J. Oral Rehabil. 41, 133-140 (2014).</li>
<li>Patel, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+incidence+of+oral+tongue+squamous+cell+carcinoma+in+young+white+women%2C+Age+18+to+44+Years%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Increasing incidence of oral tongue squamous cell carcinoma in young white women, Age 18 to 44 Years.</a> J. Clin. Oncol. 29, 1488-1494 (2011).</li>
<li>Zhao, L., Huang, L., Yu, S., Zheng, J., Wang, H., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+tongue+tissue+as+an+in+vitro.+model+for+studying+tongue+cancer+and+tongue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Decellularized tongue tissue as an in vitro. model for studying tongue cancer and tongue regeneration.</a> Acta Biomaterialia. 58, 122-135 (2017).</li>
<li>Ng, S. L., Narayanan, K., Gao, S., Wan, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+restricted+progenitors+for+the+repopulation+of+decellularized+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Lineage restricted progenitors for the repopulation of decellularized heart.</a> Biomaterials. 32, 7571-7580 (2011).</li>
<li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusion-decellularized+matrix%3A+using+nature%27s+platform+to+engineer+a+bioartificial+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart.</a> Nat. Med. 14, 213-221 (2008).</li>
<li>Remlinger, N. T., Wearden, P. D., Gilbert, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procedure+for+decellularization+of+porcine+heart+by+retrograde+coronary+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Procedure for decellularization of porcine heart by retrograde coronary perfusion.</a> J. Vis. Exp. (6), e50059(2012).</li>
<li>Wainwright, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+cardiac+extracellular+matrix+from+an+intact+porcine+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+C-ME%22%5BJournal%5D)">Preparation of cardiac extracellular matrix from an intact porcine heart.</a> Tissue Eng. Part C-ME. 16, 525-532 (2010).</li>
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<li>Soto-Gutierrez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+whole-organ+regenerative+medicine+approach+for+liver+replacement%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+C-ME%22%5BJournal%5D)">A whole-organ regenerative medicine approach for liver replacement.</a> Tissue Eng. Part C-ME. 17, 677-686 (2011).</li>
<li>Uygun, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+reengineering+through+development+of+a+transplantable+recellularized+liver+graft+using+decellularized+liver+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix.</a> Nat. Med. 16, 814-820 (2010).</li>
<li>Bonvillain, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nonhuman+primate+model+of+lung+regeneration%3A+detergent-mediated+decellularization+and+initial+in+vitro+recellularization+with+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Pt+A%22%5BJournal%5D)">A nonhuman primate model of lung regeneration: detergent-mediated decellularization and initial in vitro recellularization with mesenchymal stem cells.</a> Tissue Eng. Pt A. 18, 2437-2452 (2012).</li>
<li>Daly, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+binding+and+recellularization+of+decellularized+mouse+lung+scaffolds+with+bone+marrow-derived+mesenchymal+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Pt+A%22%5BJournal%5D)">Initial binding and recellularization of decellularized mouse lung scaffolds with bone marrow-derived mesenchymal stromal cells.</a> Tissue Eng. Pt A. 18, 1-16 (2012).</li>
<li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+and+orthotopic+transplantation+of+a+bioartificial+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung.</a> Nat. Med. 16, 927-933 (2010).</li>
<li>Petersen, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+lungs+for+in+vivo+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered lungs for in vivo implantation.</a> Science. 329, 538-541 (2010).</li>
<li>Price, A. P., England, K. A., Matson, A. M., Blazar, B. R., Panoskaltsis-Mortari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+decellularized+lung+bioreactor+system+for+bioengineering+the+lung%3A+the+matrix+reloaded%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Pt+A%22%5BJournal%5D)">Development of a decellularized lung bioreactor system for bioengineering the lung: the matrix reloaded.</a> Tissue Eng. Pt A. 16, 2581-2591 (2010).</li>
<li>Wallis, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+assessment+of+detergent-based+protocols+for+mouse+lung+de-cellularization+and+re-cellularization%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+C-ME%22%5BJournal%5D)">Comparative assessment of detergent-based protocols for mouse lung de-cellularization and re-cellularization.</a> Tissue Eng. Part C-ME. 18, 420-432 (2012).</li>
<li>Ross, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cells+proliferate+and+differentiate+when+seeded+into+kidney+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cells proliferate and differentiate when seeded into kidney scaffolds.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 20, 2338-2347 (2009).</li>
<li>Song, J. J., Guyette, J. P., Gilpin, S., Gonzalez, G., Vacanti, J. P., Ott, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+and+experimental+orthotopic+transplantation+of+a+bioengineered+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney.</a> Nat. Med. 19, 646-651 (2013).</li>
<li>Sullivan, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularization+methods+of+porcine+kidneys+for+whole+organ+engineering+using+a+high-throughput+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Decellularization methods of porcine kidneys for whole organ engineering using a high-throughput system.</a> Biomaterials. 33, 7756-7764 (2012).</li>
<li>Soto-Gutierrez, A., Wertheim, J. A., Ott, H. C., Gilbert, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+on+whole-organ+assembly%3A+moving+toward+transplantation+on+demand%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Perspectives on whole-organ assembly: moving toward transplantation on demand.</a> J. Clin. Invest. 122, 3817-3823 (2012).</li>
<li>Song, J. J., Ott, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+engineering+based+on+decellularized+matrix+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Organ engineering based on decellularized matrix scaffolds.</a> Trends Mol. Med. 17, 424-432 (2011).</li>
<li>Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-organ+tissue+engineering%3A+decellularization+and+recellularization+of+three-dimensional+matrix+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds.</a> Annu. Rev. Biomed. Eng. 13, 27-53 (2011).</li>
<li>Shamis, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ-specific+scaffolds+for+in+vitro+expansion%2C+differentiation%2C+and+organization+of+primary+lung+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+C-ME%22%5BJournal%5D)">Organ-specific scaffolds for in vitro expansion, differentiation, and organization of primary lung cells.</a> Tissue Eng. Part C-ME. 17, 861-870 (2011).</li>
<li>Nakayama, K. H., Batchelder, C. A., Lee, C. I., Tarantal, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+rhesus+monkey+kidney+as+a+three-dimensional+scaffold+for+renal+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Pt+A%22%5BJournal%5D)">Decellularized rhesus monkey kidney as a three-dimensional scaffold for renal tissue engineering.</a> Tissue Eng. Pt A. 16, 2207-2216 (2010).</li>
<li>Cortiella, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+acellular+natural+lung+matrix+on+murine+embryonic+stem+cell+differentiation+and+tissue+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Pt+A%22%5BJournal%5D)">Influence of acellular natural lung matrix on murine embryonic stem cell differentiation and tissue formation.</a> Tissue Eng. Pt A. 16, 2565-2580 (2010).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Ein gut etabliertes Protokoll für decellularized ECM-Herstellung sollten die native ECM Zusammensetzung beim Entfernen von zellulären Bestandteilen in Geweben behalten fast komplett21. Trotz aktuell gemeldete Decellularization Protokolle erfordern Perfusion durch das Gefäßsystem, zellulare Werkstoffe durch konvektiven Transport entfernen, mechanische Agitation hier, wurde bekannt als eine traditionelle einfache und preiswerte Methode22 , 23</sup...

Die Zunge hat verschiedene wichtige Funktionen wie Schlucken, Artikulation und Verkostung. Die Beeinträchtigung der Funktion der Zunge hat so großen Einfluss auf Patienten Lebensqualität1. Die häufigsten malignen Erkrankungen in der Mundhöhle ist Zunge Squamous Zelle Krebsgeschwür (TSCC), die in der Regel tritt bei Menschen, die Alkohol trinken oder Rauchen Tabak2.
In den letzten Jahren wurden in der Grundlagenforschung auf TSCC wenig Fortschritte erzielt. Der Mangel an effizienter in-vitro- Forschung Modelle bleibt eines der größten Probleme sein. So entpuppt sich die extrazelluläre Matrix (ECM) eine mögliche Lösung sein. Da ECM ein komplexes Netzwerk Frame hochorganisierte Matrix Komponenten zusammengesetzt ist, wäre eine ECM-artige Struktur und Zusammensetzung Gerüstmaterial zuständigen für die Krebsforschung. Decellularized ECM bieten perfekt die Nische für die Zellen aus der gleichen Herkunft in Vitro, die entpuppt sich als der wichtigste Vorteil von ECM.
ECM kann mit zellulären Komponenten aus dem Gewebe durch die Decellularization mit Wasch- und Enzyme entfernt wird einbehalten. Verschiedenen ECM-Komponenten, einschließlich Kollagen, Fibronektin und Laminin in decellularized Matrix bieten eine Native-Gewebe-Like Mikroumgebung für kultivierten Zellen, fördert das Überleben, Proliferation und Differenzierung von Zellen3. Darüber hinaus kann die Immunogenität zur Transplantation auf einem minimalen Niveau mit der Abwesenheit von zellulären Bestandteilen in ECM reduziert werden.
Bisher sind Fertigungsverfahren für decellularized ECM in verschiedenen Geweben und Organen, wie Herz4,5,6,7, Leber8,9,10 versucht worden ,11, Lunge12,13,14,15,16,17und Niere18,19 , 20. keine relevanten Forschung hat jedoch auf ähnliche Arbeiten in der Zunge nach bestem Wissen und gewissen gefunden werden.
In dieser Studie wurde decellularized Zunge extrazelluläre Matrix (TEM) durch eine Reihe von physikalischen, chemischen und enzymatischen Behandlung effizient und kostengünstig hergestellt. Dann wurde die TEM zur TSCC in Vitrorekapitulieren zeigt eine entsprechende Simulation für TSCC Verhalten und Entwicklung. TEM hat gute Biokompatibilität sowie die Fähigkeit, die Zellen der Gewebe-spezifische Nische zu führen gibt an, dass TEM ein großes Potenzial in TSCC Forschung3haben kann. Die hier gezeigte Protokoll bietet eine Auswahl für Forscher auf Pathogenese oder Therapien von TSCC.

<table><tbody><tr><td>C57-BL/6J Mäuse</td><td>Sun Yat-sen University Laboratory Animal Center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Guangzhou Chemische Reagenzienfabrik</td><td>HB15-GR-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Sangon Biotech</td><td>A501218</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Sangon Biotech</td><td>A100395</td><td></td></tr><tr><td>Dibasisches Natriumphosphat</td><td>Guangzhou Chemische Reagenzienfabrik</td><td>BE14-GR-500G</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumphosphat monobasisch&nbsp;</td><td>Sangon Biotech</td><td>A501211</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL EP-Röhrchen</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-A</td><td></td></tr><tr><td>Ultratiefkühlschrank&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3,5 cm Zellkulturschale</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>153066</td><td></td></tr><tr><td>6 cm Zellkulturschale</td><td>Greiner</td><td>628160</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V900502</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746495</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>449164</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumsulfat</td><td>Sangon Biotech</td><td>A601988</td><td></td></tr><tr><td>Glukose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158968</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9393</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PHR1487</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgisches Nahtmaterial</td><td>Shanghai Jinhuan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 mL Weithalsflasche</td><td>SHUNIU</td><td>1407</td><td></td></tr><tr><td>Magnetrührer</td><td>AS ONE</td><td>1-4602-32</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Inkubator</td><td>SHEL LAB</td><td>SCO5A</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Spritze</td><td>Hunan Pingan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL Zentrifugenröhrchen</td><td>Greiner</td><td>227270</td><td></td></tr><tr><td>Cal27-Zelle</td><td>Chinesische Akademie der Wissenschaften, Shanghai Zellbank</td><td></td><td>Zungenplattenepithelkarzinom-Zelllinie</td></tr><tr><td>U2OS-Zelle</td><td>Chinesische Akademie der Wissenschaften, Shanghai Zellbank</td><td></td><td>Humane Osteosarkom-Zelllinie</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0547</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyruvat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5280</td><td></td></tr><tr><td>Hepes freie Säure</td><td>BBI</td><td></td><td></td>A600264</tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30084.03</td><td></td></tr><tr><td>4 &deg; C Kühlschrank</td><td>Haier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wasserreiniger</td><td>ELGA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hämozytometer</td><td>BLAU</td><td>717805</td><td></td></tr></tbody></table>

herstellung von zunge extrazellulären matrix und rekonstitution der zunge squamous zelle krebsgeschwür in-vitro-

Fabrication of Tongue Extracellular Matrix and Reconstitution of Tongue Squamous Cell Carcinoma In Vitro

Um eine effektive und realistische Modell für Zunge Plattenepithelkarzinom Karzinom (TSCC) in Vitrozu konstruieren, die Methoden zu produzieren decellularized Zunge extrazelluläre Matrix (TEM) entstanden funktionelle Gerüste für TSCC Bau bietet. TEM bietet eine in-vitro- Nische für Zellwachstum und Differenzierung Zellmigration. Die Mikrostrukturen der native extrazelluläre Matrix (ECM) und biochemische Kompositionen aufbewahrt in der decellularized Matrix bieten gewebespezifischen Nischen für die Verankerung von Zellen. Die Herstellung von TEM kann durch Deoxyribonuclease (DNase) Verdauung begleitet mit einer schweren organischen oder anorganischen Vorbehandlung realisiert werden. Dieses Protokoll ist einfach zu bedienen und sorgt für hohe Effizienz für die Decellularization. Die TEM zeigte günstige Cytocompatibility für TSCC Zellen unter statischen oder gerührt Kulturbedingungen, ermöglicht den Bau des Modells TSCC. Ein self-made-Bioreaktor wurde auch für die anhaltende gerührt Bedingung für die Zellkultur verwendet. Rekonstruierte TSCC mit TEM zeigte die Merkmale und Eigenschaften ähnlich klinische TSCC Histopathologie, was darauf hindeutet das Potenzial in der TSCC Forschung.

Dieses Protokoll für die Vorbereitung der TEM entpuppt sich als effizient und angemessen. Die TEM zeigte perfekte Decellularization im Vergleich mit Muttersprache Gewebe. Hämatoxylin-Eosin (HE) Färbung (Abbildung 1A-B) bestätigte die Wirksamkeit von Decellularization. Die HE-Färbung Ergebnisse ergab völlige Verschwinden der nuklearen Färbung in TEM (Abbildung 1B). Darüber hinaus zeigten DNA Inhal...

Hier wird eine Methode für die Vorbereitung der Zunge extrazellulären Matrix (TEM) mit effizienten Decellularization angezeigt. Die TEM kann als funktionelle Gerüste für den Wiederaufbau eines Zunge Squamous Zelle Krebsgeschwür (TSCC) Modells unter statischen oder gerührt Kulturbedingungen verwendet werden.

Herstellung von Zunge extrazellulären Matrix und Rekonstitution der Zunge Squamous Zelle Krebsgeschwür In-vitro-

In order to construct an effective and realistic model for tongue squamous cell carcinoma (TSCC) in vitro, the methods were created to produce ...

Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen in der Mundkrebsforschung zu beantworten, z. B. wie man ein geeignetes T-Assist-Modell in vitro erstellt. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass rekonstruierte TSCC Tumormerkmale aufweisen, die eine starke Ähnlichkeit mit der klinischen TSCC-Histopathologie aufweisen. Als wir zum ersten Mal die Idee zu dieser Methode hatten, stellten wir fest, dass 2-D-kultivierte TSCC-Zellen den nativen Phänotyp von TSCC nicht richtig aufwiesen.Darüber hinaus erkannten wir die Bedeutung der extrazellulären Matrix für die Überlebensvermeidung und Differenzierung von Krebs. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Präparation der extrazellulären Zungenmatrix und die 3-D-Kultur mit einem Mini-Bioreaktor allein schwer zu erlernen sind und am besten zur Klärung geeignet sind. Nachdem Sie die Zungen von euthanasierten Mäusen gemäß dem Textprotokoll isoliert haben, tauchen Sie das Gewebe drei Minuten lang in 75%iges Ethanol.Übertragen Sie dann jede Zunge in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit einem Milliliter 10 Millimolar sterilem PBS. Um die Zelllyse durchzuführen, frieren Sie die Zunge

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Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Einen umfassenden Überblick über die Techniken bei der Erzeugung von einem Maus-Modell von Mundkrebs und quantitative Überwachung der Tumorinvasion in die Zunge durch Multi-Photonen-Mikroskopie markierter Zellen beteiligt wird vorgestellt. Dieses System kann als eine nützliche Plattform für die molekulare Beurteilung und Wirksamkeit von Medikamenten von anti-invasive Verbindungen dienen.

Multi-Photonen-Imaging der Tumorzellinvasion in einem orthotopen Mausmodell des oralen Plattenepithelkarzinoms

In diesem Video beschreiben wir die Isolierung von Epithelzellen aus einer Mauszunge. Diese Zellen können weiter kultiviert werden, um Zellkolonien zu bilden.

Isolierung und Kultivierung von murinen Zungenepithelzellen: Ein Verfahren zur Isolierung und Kultivierung von Zungenepithelzellen aus einem Mausmodell

Dieses Video zeigt die Präparation der extrazellulären Matrix der Mauszunge unter Verwendung der Dezellularisierungsmethode, bei der die entnommene Zunge einer Reihe von physikalischen, chemischen und enzymatischen Behandlungen ausgesetzt wird. Das resultierende TEM-Gerüst behält seine native extrazelluläre Matrixzusammensetzung bei, wodurch die zellulären Komponenten entfernt werden.

Herstellung einer extrazellulären Matrix aus einem Mausmodell: Ein effektives Verfahren zur Herstellung einer dezellularisierten extrazellulären Zungenmatrix aus der Mauszunge

Gewebezüchtungen Fibroblasten-nativen Matrix ist eine aufstrebende Werkzeug, um eine Stroma-Substrat, das epitheliale Zellproliferation und Differenzierung unterstützt generieren. Hier wird ein Protokoll gemäß dieser Methode die Auswirkung verschiedener stromalen Zelltypen auf Tumor Zellbiologie Beurteilung vorgelegt.

Tissue Engineering von Tumor-Stroma-Mikromilieu mit Anwendung auf die Invasion von Krebszellen

Hier präsentieren wir eine reproduzierbare Methode für die Entwicklung einer orthotopen Mausmodell von Kopf und Hals Squamous Zelle Krebsgeschwür. Tumoren zeigen klinisch relevante histopathologischen Merkmale der Krankheit, einschließlich der Nekrose, schlechte Differenzierung und Knotenpunkte Metastasen immun Infiltration. Tumor-tragenden Mäusen Symptome klinisch relevante wie Dysphagie, Kiefer Verschiebung und Gewichtsverlust.

Intramucosal Impfung des Plattenepithelkarzinom Zellen in Mäusen für Tumor immun Profilierung und Behandlung Antwort Bewertung

Für das Verständnis von Neoplasie ist die Entwicklung von murinen Modellen mit spezifischen Genen erforderlich, die bei Kopf- und Nackenkrebspatienten mutiert sind. Hier stellen wir ein Protokoll zur In-vitro-Transformation von primären murinen Zungenzellen unter Verwendung eines adeno-assoziierten Virus-Cas9-Systems vor, um murine HNC-Zelllinien mit spezifischen genomischen Veränderungen zu erzeugen.

In Vitro Einrichtung einer gentechnisch veränderten Murine Kopf- und Halskrebszelllinie mit einem Adeno-assoziierten Virus-Cas9-System

Wir haben ein verallgemeinertes Protokoll entwickelt, um eine große Menge hochwertiger Einzelzellen aus dem Epithel und Mesenchym/Bindegewebe embryonaler und erwachsener Mauszungen zu dissoziieren.

Zelldissoziation aus dem Zungenepithel und Mesenchym/Bindegewebe von embryonalen 12,5 und 8 Wochen alten Mäusen

Das Protokoll stellt eine Methode zur Kultivierung und Verarbeitung von lingualen Organoiden vor, die aus Geschmacksstammzellen gewonnen werden, die aus der hinteren Geschmackspapille erwachsener Mäuse isoliert wurden.

Erzeugung und Kultur von lingualen Organoiden aus adulten Mausgeschmacksstammzellen

Dieses Protokoll beschreibt die wichtigsten Schritte zur Erzeugung und Charakterisierung von murinen oral-ösophagealen 3D-Organoiden, die normale, präneoplastische und Plattenepithelkarzinomläsionen darstellen, die durch chemische Karzinogenese induziert werden.

Modellierung des oral-ösophagealen Plattenepithelkarzinoms in 3D-Organoiden

Eine einzigartige Methode zur chirurgischen Entfernung von oralen Plattenepithelkarzinomtumoren, die in der Mundhöhle etabliert wurden, wird hier gezeigt.

Translational relevantes Tumorresektionsmodell für murine präklinische Modelle des oralen Plattenepithelkarzinoms

Erfahren Sie die Herstellung von Zungen-Extrazellulärmatrix durch Dezellularisierung und deren Nutzung als 3-D-Scaffold für ein Zungenplattenepithelkarzinom-Modell. Diese Methode ermöglicht realistischere In-vitro-Studien zur Krebsbiologie.

Herstellung von Zunge extrazellulären Matrix und Rekonstitution der Zunge Squamous Zelle Krebsgeschwür In-vitro-

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