Ein In Ovo -Modell zum Testen Insulin-mimetischen Verbindungen
23. April 2018
In dieser Studie beschreiben wir eine in Ovo -System als ein viel versprechendes Instrument, Insulin-mimetischen Verbindungen in einem lebenden Organismus zu testen. Die Hauptvorteile sind angemessene Durchsatzraten und vertretbaren Kosten, die die Identifizierung von sekundären Pflanzenstoffen mit Insulin-mimetischen Eigenschaften ermöglichen.
Das übergeordnete Ziel des vorgestellten modifizierten Hühnerembryomodells ist es, Substanzen mit insulinmimetischen Eigenschaften in einem lebenden Organismus zu charakterisieren. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen im Bereich der Diabetikerforschung zu beantworten, z. B. die Suche nach pflanzlichen Extrakten mit insulinmimetischen Eigenschaften, die den Blutzuckerspiegel ohne Nebenwirkungen senken. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Wirksamkeit von Verbindungen in einem lebenden Organismus mit ausreichenden Durchsatzraten getestet werden kann und dass keine Genehmigung durch eine Ethikkommission erforderlich ist.
Dievisuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Vorbereitungs- und Schneidschritte schwer zu erlernen sind, da die Gefäße nicht leicht zu präparieren sind oder oft vollständig geschnitten werden und verloren gehen. Überprüfen Sie die Eier auf Befruchtung nach einer Inkubation bei 38 Grad Celsius und einer durchschnittlichen Luftfeuchtigkeit von 40 bis 60 Prozent für bis zu 11 Tage. Tauchen Sie dazu den Rand der Kerzenlampe in ein Stempelkissen und kerzen Sie dann die spitze Seite des Eies an.
Um die Luftblase zu identifizieren, prüfe die Oberseite des Eies auf Helligkeitsunterschiede. Die Luftblase erscheint als runde, transparentere Region, während das Albumin dunkler erscheint. Markieren Sie die Position der Luftblase, indem Sie die Lampe mit der zuvor aufgetragenen Tinte leicht gegen das Ei drücken.
Schließen Sie unbefruchtete Eizellen aus, die keinen Helligkeitsunterschied zwischen Albumin und Luftblase aufweisen. Bereiten Sie das Insulin-Mimetikum oder Insulin vor, indem Sie es in Hank's Balanced Salt Solution auf die gewünschte Konzentration verdünnen. Um die ausgewählte Verbindung aufzutragen, picken Sie die Eierschale mit einer spitzen Pinzette vorsichtig in den markierten Bereich der Luftblase, um ein Loch zu bilden, das dem Durchmesser der Nadelspritze entspricht.
Verwenden Sie eine sterile Ein-Milliliter-Spritze, um 300 Mikroliter der Pufferlösung zu injizieren, die die betreffende Substanz enthält. Um die blutzuckersenkende Wirkung einer Substanz zu bestimmen, legen Sie die Eier zurück in den Inkubator und messen Sie den Blutzucker nach 60, 120 und 180 Minuten. Entfernen Sie zum richtigen Zeitpunkt vorsichtig die Eierschale über der Luftblase und äquilibrieren Sie die Eierschalenmembran, indem Sie genügend PBS-Puffer hinzufügen, um die gesamte Membran zu bedecken.
Nachdem Sie überschüssiges PBS weggegossen haben, ziehen Sie die Eierschalenmembran vorsichtig mit einer spitzen Pinzette ab. Verwenden Sie eine Mikroschere, um die chorioallantoische Membran zu schneiden und zu entfernen, und vermeiden Sie dabei große Gefäße in der Membran. Lokalisieren Sie das große Gefäß, das aus dem Bauch des Embryos stammt.
Heben Sie dieses Gefäß mit einer geschlossenen Mikroschere aus dem Albumin und legen Sie es auf einen pH-Streifen aus Kunststoff. Schieben Sie den pH-Streifen unter das Gefäß und ziehen Sie die Mikroschere vorsichtig zurück. Es ist wichtig, die großen Blutgefäße, die aus dem Bauch kommen, vorzubereiten, da kleinere Gefäße zerreißen und die Blutentnahme unmöglich machen können.
Entfernen Sie mit einer Pipette alle Flüssigkeiten, die das Gefäß umgeben, um eine Verdünnung des Blutes zu vermeiden. Verwenden Sie dann Filterpapier, um das Gefäß und den pH-Streifen zu trocknen. Bei der Blutentnahme ist es wichtig, das Gefäß nicht vollständig zu durchtrennen, da es sonst verloren geht.
Schneiden Sie anschließend mit einer Mikroschere das Blutgefäß vorsichtig auf einer Seite auf. Schneiden Sie nicht mehr als die Hälfte des Gefäßes durch, um zu vermeiden, dass das Gefäß vollständig durchtrennt wird. Sammeln Sie das Blut, das auf den pH-Streifen austritt, mit einer Pipette.
10 Mikroliter Blut werden benötigt, um den Glukosespiegel mit dem Blutzuckermessgerät zu bestimmen. Nach dem Auftragen der ausgewählten Verbindung für 24 Stunden wird die Eierschalenmembran wie zuvor mindestens 30 Sekunden lang mit PBS äquilibriert. Entfernen Sie überschüssigen PBS-Puffer, indem Sie ihn wegschütten.
Ziehe dann die Eierschalenmembran vorsichtig mit einer spitzen Pinzette ab. Überprüfen Sie die Blutgefäße auf Läsionen und bestätigen Sie die Vitalität, indem Sie die Bewegung des Hühnerembryos beobachten. Für diese Versuche wurden Extrakte aus Combretum indicum oder dem Rangun-Kriechgang und ein nicht offenbarter Extrakt mit der Bezeichnung Extrakt 0845 verwendet.
Wie in dieser Abbildung angedeutet, führte der Extrakt aus dem Rangun-Kriecher nicht zu einer signifikanten Senkung des Blutzuckerspiegels in Ovo. Die Blutzuckerkonzentration wurde jedoch erfolgreich mit Extrakt 0845 gesenkt, wobei ein signifikanter Effekt beobachtet wurde, wenn die Inkubationszeit verlängert wurde. Im Vergleich zu unbehandelten Eiern führte die Behandlung von Eiern mit einem giftigen Kräuterextrakt am Tag 10 für 24 Stunden zu schweren Läsionen der Blutgefäße in der chorioallantoischen Membran.
Läsionen waren auch beim behandelten Embryo im Vergleich zur normalen Kontrolle sichtbar. Sobald zwei Eier gemeistert sind, können sie bei richtiger Durchführung innerhalb von fünf Minuten auf Glukosespiegel und Toxizität analysiert werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Blutgefäße vorbereitet und Blut im Hühnerembryo-Modell sammelt, um die blutzuckersenkende Wirkung natürlicher oder synthetischer Verbindungen zu quantifizieren.
Übersicht
Diese Studie stellt ein modifiziertes Hühnerembryomodell als Werkzeug zur Beurteilung insulinmimetischer Verbindungen vor. Das In-Ovo-System ermöglicht die Untersuchung pflanzlicher Extrakte, die den Blutglukosespiegel senken können, ohne unerwünschte Wirkungen hervorzurufen, und weist erhebliche Vorteile hinsichtlich Durchsatz und Kosten auf.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Diabetes-Forschung
- Phytochemische Untersuchung
- Insulinmimetische Verbindungen
Hintergrund
- Das Hühnerembryomodell bietet eine Plattform mit einem lebenden Organismus für Tests.
- Die Methode umgeht ethische Prüfverfahren und beschleunigt die Forschung.
- Sie trägt der Notwendigkeit von Alternativen zu chemischem Insulin Rechnung.
Zweck der Studie
- Identifizierung von pflanzlichen Extrakten mit insulinmimetischen Eigenschaften.
- Beurteilung ihrer Wirkung auf die Blutglukosesenkung.
- Einschätzung potenzieller Nebenwirkungen in einem lebenden System.
Verwendete Methoden
- Es wurde das modifizierte Hühnerembryomodell verwendet.
- Insulinmimetische Verbindungen wurden durch Injektionen in die Luftsackblase appliziert.
- Die Blutglukosespiegel wurden nach der Applikation der Verbindungen gemessen.
- Zu den kritischen Schritten gehörten das Durchleuchten der Eier, die Vorbereitung der Gefäße und die Techniken zur Blutentnahme.
Hauptergebnisse
- Extrakt 0845 senkte die Blutglukosespiegel im Vergleich zu Kontrollen signifikant.
- Beim Extrakt aus Rangoon creeper wurde kein signifikanter Effekt beobachtet.
- Zerstörende Läsionen traten nach Exposition gegenüber einem toxischen Extrakt auf.
Schlussfolgerungen
- Die Studie zeigt die Nützlichkeit des Hühnerembryo-Modells zur Bewertung insulinmimetischer Verbindungen auf.
- Diese Methode verbessert die Forschungseffizienz bei der Suche nach sicheren Insulinalternativen.
- Zu den Implikationen gehört ein besseres Verständnis der Rolle pflanzlicher Verbindungen bei der Behandlung von Diabetes.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Bewertung insulinmimetischer Wirkstoffe im Entdeckungsstadium erfordert prädiktive, skalierbare und ethisch optimierte in-vivo-Modelle, um Kandidaten vor Studien an Säugetieren vorzusortieren. Das modifizierte Hühnerembryo-Modell ermöglicht eine schnelle, quantitative Beurteilung der blutglukosesenkenden Wirkungen und der Toxizität und unterstützt so die Frühphase der Risikominimierung sowohl synthetischer als auch pflanzlicher Wirkstoffe. Dieser Ansatz verbessert die Portfolio-Entscheidungsfindung, indem er handlungsrelevante Daten zur Wirksamkeit und Sicherheit von Verbindungen in einem lebenden System bereitstellt.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die funktionelle Validierung insulinmimetischer Aktivität in einem lebenden Organismus.
- Ermöglicht die biologische Entschärfung von Risiken, indem sowohl Wirksamkeit als auch offensichtliche Toxizitätsignale aufgedeckt werden.
- Erleichtert die schnelle Vorauswahl von Kandidatenverbindungen vor aufwändigen Säugetierstudien.
Screening und Assay-Entwicklung
- Bietet ein durchsatzkompatibles System zur quantitativen Messung des Blutglukosespiegels nach Applikation einer Substanz.
- Standardisiert die Beurteilung von substanzausgelöster Glut4-Translokation und der Effekte auf die Glukoseaufnahme.
- Ermöglicht die reproduzierbare Untersuchung sowohl synthetischer als auch pflanzlicher Extrakte hinsichtlich insulinmimetischer Eigenschaften.
Translationale und präklinische Forschung
- Ermöglicht eine Brücke zwischen der In-vitro-Screening-Phase und präklinischen Säugetiermodellen für die Forschung zu Stoffwechselerkrankungen.
- Ermöglicht die frühzeitige Erkennung von Toxizitäten oder vaskulären Läsionen und unterstützt so die translationale Risikobewertung.
- Unterstützt die kontinuierliche Bewertung der Sicherheit und Wirksamkeit von Wirkstoffkandidaten über verschiedene Modellsysteme hinweg.
Pipeline- und Workflow-Integration
Dieses In-ovo-Modell fügt sich zwischen die in-vitro-Screening-Verfahren und die präklinischen Studien an Säugetieren ein und bietet einen lebenden Organismus als Kontext für die funktionelle und sicherheitsrelevante Beurteilung insulinmimetischer Verbindungen.
- Entdeckungsbiochemie: Ermöglicht die Hypothesenprüfung für glucoseerniedrigende Mechanismen und Zielstrukturen in vivo.
- Screening: Liefert quantitative, reproduzierbare Blutglukosewerte zur vergleichenden Analyse der Wirksamkeit von Wirkstoffkandidaten.
- Analytik: Unterstützt die statistische Auswertung von Glukoseabnahme und Toxizitätsendpunkten über verschiedene Zeitpunkte hinweg.
- Translationale Forschung: Leitet risikoadjustierte Weiterentwicklungen ein, indem frühzeitige Toxizität oder mangelnde Wirksamkeit im Kontext eines ganzen Organismus aufgedeckt werden.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Bietet eine wiederverwendbare, ethisch optimierte Plattform für die iterative Bewertung von Verbindungen in Pipelines für Stoffwechselerkrankungen.
Operationelle und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Kandidatenauswahl, indem Wirksamkeits- und Toxizitätsdaten aus einem lebenden System integriert werden.
- Operationaler Wert: Vereinfacht die Frühphasenscreening durch standardisierte, skalierbare Protokolle und erfordert keine tierversuchsethischen Genehmigungen.
- Strategischer Wert: Ermöglicht fundiertere Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch, wodurch biologische Risiken und Ressourcenverbrauch in späteren Phasen reduziert werden.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung und Weiterentwicklung von insulinmimetischen Kandidaten mit translationaler Aussicht.
Implementierungsüberlegungen
- Erfordert technische Fachkenntnisse im Umgang mit Embryonen, der Vorbereitung von Gefäßen und der Blutentnahme.
- Benötigt Zugang zu Fluoreszenzmikroskopie und Instrumenten zur Messung des Blutglukosespiegels.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen Teams bei der Herstellung von Verbindungen und der Dosierungsprotokolle.
- Möglicherweise ist eine Anpassung für verschiedene Klassen von Verbindungen oder metabolische Endpunkte erforderlich.
- Sorgfältige Technik ist unerlässlich, um einen Verlust der Gefäße oder eine Verdünnung der Proben zu vermeiden, was die Datenintegrität beeinträchtigen könnte.
