Name: Ein In Ovo -Modell zum Testen Insulin-mimetischen Verbindungen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 9 s
Description: Erfahren Sie die modifizierte Hühnerembryo-Methode zur Testung insulin-mimetischer Verbindungen in vivo. Diese Technik ermöglicht die effiziente Analyse pflanzlicher Extrakte auf blutzuckersenkende Wirkung ohne ethische Genehmigung.

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Diese Arbeit wurde von der Österreichischen Forschungsförderungsgesellschaft (FFG, Projektnummer 850681), der Hochschule für angewandte Wissenschaften Upper Austria grundlegende Finanzierung-Initiative (Projekt GlucoSTAR) und das Zentrum für technologische Innovation in der Medizin (Training Center) finanziert. Grundfinanzierung durch das Land Oberösterreich erhält.

Laut der Richtlinie 2010/63/EU benötigen Experimente mit nicht geschlüpft Vogelgrippe Embryonen während der ersten zwei Drittel der embryonalen Entwicklung keine Erlaubnis von einer Ethikkommission.
1. Lagerung und Zucht der Eier
<ol><li>Erhalten Sie von einem lokalen Züchter befruchteten Hühnereiern (Table of Materials). Hinweis: Eiern können bis zu 10 Tage nach der Verlegung vor Gebrauch für Experimente bei 14 ° C in eine feuchte Atmosphäre gespeichert werden.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Eizellen bei 38 ° C mit einer durchschnittlichen Luftfeuchtigkeit von 40-60 % für 10 oder 11 Tage im Brutkasten verwandelt, die ständig die Eiern.</li>
</ol>2. Auswahl der Eizellen
<ol><li>Überprüfen Sie die Eizellen zur Befruchtung nach Inkubation von bis zu 11 Tagen. Verwenden Sie ein candling Licht für diesen Schritt. Tauchen Sie am Rande des candling Lampe in ein Stempelkissen und Kerze der Spitzen Seite des Eies.</li>
	<li>Um das Luftpolster zu identifizieren, überprüfen Sie auf Unterschiede in der Helligkeit auf der Oberseite das Ei. Hinweis: Das Luftpolster erscheint als ein runder, transparenter Region, während das Eiweiss dunkler ist, wenn das Ei candled ist.</li>
	<li>Markieren Sie nach der Entdeckung der Luft Blase durch Drücken der Lampe leicht gegen das Ei mit der vorher verwendeten Tinte.</li>
	<li>Schließen Sie nicht befruchteten Eiern bei diesem Schritt die einen Unterschied in der Helligkeit zwischen dem Eiweiss und Luftpolster nicht zeigen aus.</li>
</ol>3. Injektion von Substanzen
<ol><li>Bereiten Sie die Substanz von Interesse (z.B., Kräuterextrakt oder Insulin) durch Verdünnen der Substanz in der gewünschten Konzentration in Hanks ausgeglichene Salzlösung (HBSS) Puffer. Zum Beispiel 3,3 U/mL eine kommerziell verfügbare Insulin analoge in HBSS.</li>
	<li>Picken Sie für die Anwendung der ausgewählten Verbindung sorgfältig die Eierschale mit einer Spitzen Pinzette in den markierten Bereich der Luft-Blase. Bilden Sie ein Loch größer als der Durchmesser der Nadel der Spritze nicht. Die Pufferlösung (300 µL), die den Stoff von Interesse in der gestrichelte Bereich über eine Spritze zu injizieren. Hinweis: Verwenden Sie steril, 1-ml Einweg-Spritzen, Pipettenspitzen und Schiffe. Tragen Sie Handschuhe und einen Laborkittel für die Experimente.</li>
	<li>Um Blut Glukose-reduzierende Wirkung eines Stoffes zu ermitteln, legen Sie die Eiern zurück in den Brutkasten für 60, 120 und 180 min, bzw.. Um basale Blutzuckerspiegel zu bestimmen, sind mindestens 10-15 unbehandelten Kontrolle Eiern.</li>
</ol>4. Toxizitätstests
<ol><li>Nach Anwendung der ausgewählten Verbindung für 24 h, equilibrate die Eierschale Membran mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS)-Puffer (genug, um die gesamte Eierschale Membran) für mindestens 30 s.</li>
	<li>Entfernen Sie überschüssige PBS-Puffer durch Gießen entfernt.</li>
	<li>Ziehen Sie die Eierschale Membran vorsichtig mit einer Spitzen Pinzette.</li>
	<li>Überprüfen Sie Blutgefäße für Läsionen und bestätigen Sie Vitalität (z.B. Bewegung) des Embryos Küken. Hinweis: Siehe Abbildung 1 für den Vergleich des vital im Vergleich zu nicht-vital Embryonen nach dem Auftragen eine giftige Kräuter-Extrakt.</li>
</ol>5. Messung der Blutzuckerwert
<ol><li>Zum jeweiligen Zeitpunkt sorgfältig entfernen Sie die Eierschale über das Luftpolster und equilibrate der Eierschalen Membran mit PBS-Puffer (genug, um die gesamte Eierschale Membran).</li>
	<li>Entfernen Sie überschüssige PBS-Puffer durch Gießen entfernt.</li>
	<li>Ziehen Sie die Eierschale Membran vorsichtig mit einer Spitzen Pinzette.</li>
	<li>Schneiden Sie und entfernen Sie die chorioallantoic Membrane mit einer Mikro-Schere, um guten Zugang zu geeigneten Blutgefäße zu ermöglichen. Schneiden Sie die Membran mit mindestens 2-3 cm. Schneiden Sie keine großen Schiffe in die Membran selbst unerwünschte Blutverlust des Embryos zu vermeiden.</li>
	<li>Suchen Sie das große Schiff mit Ursprung aus dem Bauch des Embryos. Heben Sie dieses Schiff aus das Eiweiss mit einer geschlossenen Mikro-Schere und legen Sie es auf einem Kunststoff pH-Streifen. PH-Streifen unter dem Behälter, die mit Mikro-Schere stattfindet, zu bewegen und zurückziehen der Mikro-Schere entfernt sorgfältig.</li>
	<li>Nehmen Sie 1 bis 2 mL der Flüssigkeit unter die chorioallantoic Membrane mit einer Pipette zur Verdünnung des Blutes in den nächsten Schritt zu vermeiden. Trocknen Sie die Behälter und pH-Streifen mit Filterpapier, bevor das Schiff geschnitten wird.</li>
	<li>Schneiden Sie das Blutgefäß sorgfältig mit einer Mikro-Schere auf einer Seite. Schneiden Sie durch das Gefäß nicht vollständig aus. Hinweis: Das Schiff ist ca. 1 mm dick. Schneiden Sie nicht mehr als die Hälfte des Schiffes zu vermeiden, Schneiden durch das Gefäß vollständig, da es nicht am Strip rutschen kann und keine Blutentnahme möglich ist.</li>
	<li>Sammeln Sie die undichte Blut auf den pH-Streifen mit einer Pipette. 10 Mikroliter Blut müssen Blutzuckerspiegel mit dem Blutzuckermessgerät zu bestimmen.</li>
</ol>6. Statistische Auswertung
<ol><li>Berechnen Sie den Mittelwert aus mindestens 10 einzelnen Eiern pro Zeitpunkt und Normalisieren Sie diese Werte zu einem Steuerelement Eier (oder Puffer-unbehandelte Eiern) zu.</li>
	<li>Anschließend bestimmen Sie den Prozentsatz der Abnahme. Darüber hinaus nutzen Sie Insulin als Positivkontrolle. Hinweis: Wiederholen Sie jedes Experiment mindestens dreimal.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Der HET-CAM-Assay ist eine weit verbreitete alternative Testsystem zu Tierversuchen in der Industrie-12. Das hier beschriebene in Ovo -System stellt eine modifizierte Version des HET-CAM-Assays. Während in seiner ursprünglichen Form HET-CAM Experimente werden durchgeführt, um die irritierenden Eigenschaften von Verbindungen und Formulierung oder die Analyse der Angiogenese14,15,16studieren, haben wir das Konzept zu testen angepasst Verbindungen mit vermeintlichen Insulin-mimetischen Eigenschaften12. Laut der Richtlinie 2010/63/EU benötigen Experimente mit nicht geschlüpft Vogelgrippe Embryonen während der ersten zwei Drittel der embryonalen Entwicklung keine Erlaubnis von einer Ethikkommission, da diese Experimente nicht Tierversuche gelten. Jüngste Studien haben bewiesen, die Eignung des in Ovo Systems, um die Wirksamkeit von ausgewählten Kräuter-Extrakten, charakterisieren die in einer GLUT4-Translokation-basierten primären Bildschirm10, Senkung des Blutzuckerspiegels in identifiziert wurden die das Fehlen von Insulin12,13. Kritische Punkte für eine gute Leistung des Systems in Ovo gehören: Erstens eine zuverlässige Züchter liefern die befruchteten Eizellen. Die klassische braune Hühner Lohmann ist eine gute Wahl der Rasse. Zweitens prüft die Umsetzung der Toxizität auszuschließende toxische Wirkungen der untersuchten Verbindung muss getan werden. Darüber hinaus ist die Vorbereitung eines geeigneten Blutgefäßes zur Blutentnahme wichtig. Es ist wichtig, das Schneiden von großen Schiffen in der chorioallantoic Membrane selbst, zu vermeiden, da dies zu einer nicht vorzuziehen Blutverlust führen kann. Darüber hinaus, bevor das Schiff auf den pH-Streifen geschnitten wird, hat es gestreichelt zu werden trocken mit Filterpapier um Verdünnung der das gesammelte Blut zu verhindern. Schließlich scheint eine ausreichende Anzahl von Experimenten wichtig zu sein. Es wird empfohlen, mit mindestens 10 Eizellen für jeden Zeitpunkt und eine dreifache Wiederholung des jeweiligen Experiments.
Natürlich gibt es einige Einschränkungen dieses Ansatzes in Ovo . Da es bis zu 30 Minuten dauert, bis die Stoffe durch die Eierschale Membran absorbiert und in engem Kontakt mit der chorioallantoic Membrane kommen, ist es nicht möglich, eine schnelle Reaktion des Embryos bei der angewandten Verbindung zu quantifizieren. Darüber hinaus können einige Verbindungen in die angewandte Konzentration giftig sein führt häufig zu Verletzungen der Blutgefäße in der chorioallantoic Membrane. Zytotoxizität Tests basierend auf langfristige Inkubation der Verbindungen für ca. 24 Stunden erscheint daher angemessen. Schließlich fanden wir, dass das Puffersystem für die Anwendung der Verbindungen eine erhebliche Auswirkungen auf die Leistung des Tests hat. 12 derzeit HBSS Puffer verwendet, da es in der kleinsten Wirkung auf den Blutzuckerspiegel des Embryos führt.
Für zukünftige Anwendungen möglicherweise zusätzlichen Puffersysteme als Alternative zu HBSS getestet werden. Darüber hinaus könnte der Einfluss von pflanzlichen Extrakten auf zusätzliche Blutwerte wie Cholesterin, Triglyceride oder Lipoproteine eine attraktive Frage sein.
Unser neues in-Ovo -System ist ein vielversprechender und wichtige Werkzeug, Stoffe mit Insulin-mimetischen Eigenschaften in einem lebenden Organismus ohne die Notwendigkeit einen Tierversuch zu testen. Daher, es füllt die Lücke zwischen in-vitro- und in-Vivo -Ansätzen. Im Vergleich zu bestehenden in Ovo Modell Systeme17 entfällt induzieren Diabetes durch die Streptozocin (STZ) Behandlung, wie wir Embryonen am Tag 10 oder 11 der Inkubation zu verwenden. In diesem Stadium Insulin-Produktion hat noch nicht begonnen, aber die Embryonen sind bereits Insulin empfindlich. Darüber hinaus kann Erlaubnis von einer Ethikkommission erforderlich sein, wenn Embryonen im Alter von 14-17 Tagen verwendeten17sind. Darüber hinaus ist im Vergleich zu alternativen Strategien18, die zusammengesetzte Anwendung wie hier beschrieben weniger schädlich und mühsam, Erhöhung experimentelle Durchsatz.
Zusammen genommen, diese in Ovo ist Ansatz ein attraktives System, wenn eine Blut-abnehmender Wirkung einer Insulin-mimetische Substanz muss in einem lebenden Organismus getestet werden.

Diabetes Mellitus ist eine Stoffwechselerkrankung, die durch Hyperglykämie gekennzeichnet und wird durch defekte Insulinsekretion oder Insulin Aktion1verursacht. Neunzig Prozent aller Diabetesfälle sind Kategorie Typ 2 Diabetes Mellitus (T2DM), wo Einzelpersonen zu demonstrieren, Insulin-Resistenz und vor allem Insulin-Mangel2. Mehrere Faktoren sind dafür bekannt, die globale Inzidenz von T2DM, einschließlich Veränderungen im Lebensstil, insbesondere die Überernährung, Altern und Bewegungsmangel erhöhen. Rund 400 Millionen Menschen haben Diabetes Mellitus nach der International Diabetes Federation (IDF) weltweit. Diese Zahl wird voraussichtlich 600 Millionen innerhalb der nächsten 20 Jahre3zu erreichen.
Diabetische Komplikationen verursacht durch Hyperglykämie und Insulinresistenz, wie Bluthochdruck, Fettstoffwechselstörungen, Glukoseintoleranz, koronare Herzkrankheit und zerebralen Gefäßerkrankungen, führen zu einer deutlich reduzierten Lebenserwartung und Qualität4. Betroffenen Personen erfordern Glukose-senkenden Pharmakotherapie; Allerdings ist die Verwendung von Drogen wie Metformin5 oft verbunden mit dramatischen Nebenwirkungen6,7,8. Daher sind weitere Antidiabetika Ansätze, die sicher, weithin verfügbar und kostengünstig sind erforderlich.
Verschiedene pflanzliche Verbindungen, Extrakte, Pflanzen und Nutraceuticals sind Feature-Insulin-mimetischen Eigenschaften zugeschrieben worden, durch die Modulation verschiedene Zellfunktionen. Ein wichtiges Merkmal ist die Stimulation der die Translokation von glukosetransporters 4 (GLUT4) an der Plasmamembran von intrazellulären Staufächer, wodurch eine erhöhte Aufnahme von Glucose in Muskel und Fettgewebe in Abwesenheit von Insulin, bekannt als Insulin-mimetischen Eigenschaften9. Zuvor haben wir einen Fluoreszenz-Mikroskopie-basierter Ansatz zur Quantifizierung des Translokation Prozess von GLUT410implementiert. Analyse der zahlreichen Pflanzenextrakte aus Extrakt Bibliothek11 mit dieser Assay führte bei der Identifizierung von vielversprechenden Kandidaten. Weitere Tests in lebenden Organismen sind jedoch erforderlich. In diesem Papier, eine modifizierte Küken Embryos Modell ausführlich beschriebene Ansatz erweist sich ein zukunftsträchtiges Modell zur Identifizierung von Substanzen mit Insulin-mimetischen Eigenschaften. Es stellt ein attraktives Instrument, die große Lücke zwischen in-vitro- und in-Vivo -Studien und bietet mehrere Vorteile im Vergleich zu bestehenden Systemen wie akzeptablen Kosten, einfache Handhabung und angemessene Durchsatzraten. Darüber hinaus ist die Berechtigung von einer Ethikkommission nicht erforderlich.

<table><tbody><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Biochrom</td><td>L1825</td><td></td></tr><tr><td>Hank' s balanced salt solution (HBSS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30268.02</td><td></td></tr><tr><td>NovoRapid</td><td>Novo Nordisk</td><td>8-0905-82-304-6</td><td></td></tr><tr><td>Hühnereier (Lohmann classic brown chicken)</td><td>Local Breeder</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Accu-check performa</td><td>Roche</td><td>6454011</td><td></td></tr><tr><td>Accu-check Inform II Teststreifen</td><td>Roche&nbsp;</td><td></td><td></td>5942861</tr><tr><td>Inkubator&nbsp; HEKA- Turbo 288</td><td>HEKA Brutger&auml; te</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spritze Omnican F 1 mL</td><td>Braun</td><td>09161502S&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Extrakte</td><td>PEKISH Extraktbibliothek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lamp Tempo Nr. 119</td><td>ORBAN</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ein in ovo -modell zum testen insulin-mimetischen verbindungen

An In Ovo Model for Testing Insulin-mimetic Compounds

Erhöhte Blutzuckerwerte bei Diabetes Mellitus Typ 2 (T2DM), eine komplexe und multifaktorielle Stoffwechselerkrankung werden durch Insulin-Resistenz und β-Zellen Ausfall verursacht. Verschiedene Strategien, einschließlich die Injektion von Insulin oder die Verwendung von Insulin-sensibilisierende Medikamente wurden fortgesetzt, um T2DM zu behandeln oder zumindest die Symptome zu reduzieren. Darüber hinaus hat die Anwendung von pflanzlichen Verbindungen immer mehr Aufmerksamkeit erregt. Daher ist es notwendig, effiziente Testsysteme zu identifizieren und zu charakterisieren, Insulin-mimetischen Verbindungen zu finden. Hier haben wir eine modifizierte Küken Embryos Modell, das ermöglicht das Testen der synthetischen Verbindungen und Kräuterextrakte mit Insulin-mimetischen Eigenschaften entwickelt. Mit einer Fluoreszenz Mikroskopie-basierten primären Bildschirm, der die Translokation von glukosetransporters 4 (Glut4) an der Plasmamembran quantifiziert, konnten wir Verbindungen, vor allem pflanzliche Extrakte zu identifizieren, die zu einer Erhöhung der intrazellulären Glukose führen Konzentrationen in Adipozyten. Die Wirksamkeit dieser Substanzen erfordert jedoch weitere Überprüfung in einem lebenden Organismus. So haben wir in Ovo Ansatz, um deren Blut Glukose-reduzierenden Eigenschaften zu identifizieren. Die Zulassung durch eine Ethik-Kommission ist nicht erforderlich, da die Verwendung von Hühnerembryos während der ersten zwei Drittel der Embryonalentwicklung keinen Tierversuch angesehen wird. Hier wird die Anwendung dieses Modells im Detail beschrieben.

Beschreibung des Gluc-HET-Ansatzes:
Nach der Inkubation mit den Stoffen von Interesse die befruchteten Eizellen geöffnet und bereit für die Blutentnahme durch Beseitigung der Eierschale (Abbildung 2). Weitere Vorbereitung umfasst Gleichgewichtherstellung und Entfernung der Eierschale Membran für den Zugriff auf die chorioallantoic Membrane. Diese Membran ist dann sorgfältig geschnitten, um Zugang zu einem geeigneten Blutgefäß zur Blutentnahme. Vorzugsweise ist das große Schiff mit Ursprung aus dem Bauch des Embryos auf Kunststoff pH-Streifen gelegt. Zur Verdünnung des Blutes während der Erfassung zu vermeiden, ist das Schiff und pH-Streifen klopfte trocken mit Filterpapier. Das Blutgefäß wird dann geschnitten und Blut austritt auf die pH-Streifen ist für die Analyse mit einer Pipette gesammelt.
Auswirkungen auf den Blutzuckerspiegel ausgewählte Kräuterextrakte:
Mit einem kürzlich ins Leben gerufene GLUT4-Translokation Quantifizierung-basierten primären Bildschirm sind wir in der Lage, Stoffe zu identifizieren, mit einem Insulin-mimetischen charakteristischen10. Screening von Hunderten von wasserlöslichen Kräuterextrakte führte bei der Identifizierung von mehreren Treffern. Diese Extrakte wurden in unserem in -Ovo Modell getestet. Für diese Experimente wurden Auszüge aus Combretum Indicum (Rangoon Creeper) vorbereitet und ein nicht offengelegt-Extrakt (Extrakt 0845 bezeichnet) verwendet. Wir aufgelöst die Extrakte in HBSS Puffer bei 300 mg/L, eine Konzentration, die in früheren Studien12,13geeignet herausstellte. Auf die Embryonen für 11 Tage inkubiert wurden Substanzen angewendet. Wie in Abbildung 3gezeigt, hat der Extrakt aus Rangoon Creeper keine bedeutende Blut Glukose Reduktion in Ovogeführt. Jedoch wurde die Blut-Glukose-Konzentration erfolgreich reduziert mit Extrakt 0845, mit einer geringfügigen Abnahme nach 60 min, das ist vergleichbar mit der Wirkung, die mit einem im Handel erhältlichen Insulin analoge beobachtet. Eine signifikante Wirkung wurde beobachtet, wenn die Inkubationszeit der Eier verlängert wurde.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57237/57237fig1.jpg"> Abbildung 1: Einfluss von toxischen Verbindungen auf Embryo Vitalität. Eiern inkubiert für 11 Tage (A und C) oder mit einer giftigen Kräuterextrakt am Tag 10 für ein weiteres 24 h behandelt wurden (B und D). Anwendung des Extrakts führte zu schweren Verletzungen der Blutgefäße in der chorioallantoic Membrane (D) und der Embryo (B).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57237/57237fig2.jpg"> Abbildung 2: Beschreibung des Modells in Ovo . Von links nach rechts: Eröffnung und Entfernung der Eierschale (1-2); Gleichgewichtherstellung und Entfernung der Eierschale Membran mit chorioallantoic Membrane ausgesetzt sind (3); vorbereitete Gefäß auf einem pH-Streifen (4); die Gewinnung von Blut und Messung der Glukosekonzentration unter Verwendung einer Glukose Meter (5). Adaptiert von Haselgruebler Et Al., 201712. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57237/57237fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57237/57237fig3.jpg"> Abbildung 3: Wirkung von Kräuter-Extrakten auf den Blutzuckerspiegel im Vergleich zu unbehandelten oder Insulin-behandelten Eiern. Eiern waren für 11 Tage inkubiert und mit den angegebenen Substanzen behandelt (im Handel erhältlichen Insulin analoge: 3,3 U/mL; Extrakte: 300 mg/L) aufgelöst in HBSS Puffer (300 µL Volumen) für bis zu 3 h Blut Blutzuckerspiegel über ein Blutzuckermessgerät ermittelt wurden. Ergebnisse werden ohne die Wirkung des Puffers angezeigt. Fehlerindikatoren basieren auf den Standardfehler des Mittelwerts. * P &lt; 0,05 und *** P &lt; 0,0001, bedeutende Abnahme in Bezug auf HBSS-behandelten Eiern der Inkubation gleichzeitig. Adaptiert von Haselgruebler Et Al., 201712. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57237/57237fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

In dieser Studie beschreiben wir eine in Ovo -System als ein viel versprechendes Instrument, Insulin-mimetischen Verbindungen in einem lebenden Organismus zu testen. Die Hauptvorteile sind angemessene Durchsatzraten und vertretbaren Kosten, die die Identifizierung von sekundären Pflanzenstoffen mit Insulin-mimetischen Eigenschaften ermöglichen.

Ein In Ovo -Modell zum Testen Insulin-mimetischen Verbindungen

Elevated blood glucose levels in type 2 diabetes mellitus (T2DM), a complex and multifactorial metabolic disease, are caused by insulin resistance and ...

Das übergeordnete Ziel des vorgestellten modifizierten Hühnerembryomodells ist es, Substanzen mit insulinmimetischen Eigenschaften in einem lebenden Organismus zu charakterisieren. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen im Bereich der Diabetikerforschung zu beantworten, z. B. die Suche nach pflanzlichen Extrakten mit insulinmimetischen Eigenschaften, die den Blutzuckerspiegel ohne Nebenwirkungen senken. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Wirksamkeit von Verbindungen in einem lebenden Organismus mit ausreichenden Durchsatzraten getestet werden kann und dass keine Genehmigung durch eine Ethikkommission erforderlich ist.Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Vorbereitungs- und Schneidschritte schwer zu erlernen sind, da die Gefäße nicht leicht zu präparieren sind oder oft vollständig geschnitten werden und verloren gehen. Überprüfen Sie die Eier auf Befruchtung nach einer Inkubation bei 38 Grad Celsius und einer durchschnittlichen Luftfeuchtigkeit von 40 bis 60 Prozent für bis zu 11 Tage. Tauchen Sie dazu den Rand der Kerzenlampe in ein Stempelkissen und kerzen Sie dann die spitze Seite des Eies an.Um die Luftblase zu identifizieren, prüfe die Oberseite des Eies auf Helligkeitsunterschiede. Die Luftblase erscheint als runde, transparentere Region, während das Albumin dunkler erscheint. Markieren Sie die Position der Luftblase, indem Sie die Lampe mit der zuvor aufgetragenen Tinte leicht gegen das Ei drücken.Schließen Sie unbefruchtete Eizellen aus, die keinen Helligkeitsunterschied zwischen Albumin und Luftblase aufweisen. Bereiten Sie das Insulin-Mimetikum oder Insulin vor, indem Sie es in Hank's Balanced Salt Solution auf die gewünschte Konzentration verdünnen. Um die ausgewählte Verbindung aufzutragen, picken Sie die Eierschale mit einer spitzen Pinzette vorsichtig in den markierten Bereich der Luftblase, um ein Loch zu bilden, das dem Durchmesser der Nadelspritze entspricht.Verwenden Sie eine sterile Ein-Milliliter-Spritze, um 300 Mikroliter der Pufferlösung zu injizieren, die die betreffende Substanz enthält. Um die blutzuckersenkende Wirkung einer Substanz zu bestimmen, legen Sie die Eier zurück in den Inkubator und messen Sie den Blutzucker nach 60, 120 und 180 Minuten. Entfernen Sie zum richtigen Zeitpunkt vorsichtig die Eierschale über der Luftblase und äquilibrieren Sie die Eierschalenmembran, indem Sie genügend PBS-Puffer hinzufügen, um die gesamte Membran zu bedecken.Nachdem Sie überschüssiges PBS weggegossen haben, ziehen Sie die Eierschalenmembran vorsichtig mit einer spitzen Pinzette ab. Verwenden Sie eine Mikroschere, um die chorioallantoische Membran zu schneiden und zu entfernen, und vermeiden Sie dabei große Gefäße in der Membran. Lokalisieren Sie das große Gefäß, das aus dem Bauch des Embryos stammt.Heben Sie dieses Gefäß mit einer geschlossenen Mikroschere aus dem Albumin und legen Sie es auf einen pH-Streifen aus Kunststoff. Schieben Sie den pH-Streifen unter das Gefäß und ziehen Sie die Mikroschere vorsichtig zurück. Es ist wichtig, die großen Blutgefäße, die aus dem Bauch kommen, vorzubereiten, da kleinere Gefäße zerreißen und die Blutentnahme unmöglich machen können.Entfernen Sie mit einer Pipette alle Flüssigkeiten, die das Gefäß umgeben, um eine Verdünnung des Blutes zu vermeiden. Verwenden Sie dann Filterpapier, um das Gefäß und den pH-Streifen zu trocknen. Bei der Blutentnahme ist es wichtig, das Gefäß nicht vollständig zu durchtrennen, da es sonst verloren geht.Schneiden Sie anschließend mit einer Mikroschere das Blutgefäß vorsichtig auf einer Seite auf. Schneiden Sie nicht mehr als die Hälfte des Gefäßes durch, um zu vermeiden, dass das Gefäß vollständig durchtrennt wird. Sammeln Sie das Blut, das auf den pH-Streifen austritt, mit einer Pipette.10 Mikroliter Blut werden benötigt, um den Glukosespiegel mit dem Blutzuckermessgerät zu bestimmen. Nach dem Auftragen der ausgewählten Verbindung für 24 Stunden wird die Eierschalenmembran wie zuvor mindestens 30 Sekunden lang mit PBS äquilibriert. Entfernen Sie überschüssigen PBS-Puffer, indem Sie ihn wegschütten.Ziehe dann die Eierschalenmembran vorsichtig mit einer spitzen Pinzette ab. Überprüfen Sie die Blutgefäße auf Läsionen und bestätigen Sie die Vitalität, indem Sie die Bewegung des Hühnerembryos beobachten. Für diese Versuche wurden Extrakte aus Combretum indicum oder dem Rangun-Kriechgang und ein nicht offenbarter Extrakt mit der Bezeichnung Extrakt 0845 verwendet.Wie in dieser Abbildung angedeutet, führte der Extrakt aus dem Rangun-Kriecher nicht zu einer signifikanten Senkung des Blutzuckerspiegels in Ovo. Die Blutzuckerkonzentration wurde jedoch erfolgreich mit Extrakt 0845 gesenkt, wobei ein signifikanter Effekt beobachtet wurde, wenn die Inkubationszeit verlängert wurde. Im Vergleich zu unbehandelten Eiern führte die Behandlung von Eiern mit einem giftigen Kräuterextrakt am Tag 10 für 24 Stunden zu schweren Läsionen der Blutgefäße in der chorioallantoischen Membran.Läsionen waren auch beim behandelten Embryo im Vergleich zur normalen Kontrolle sichtbar. Sobald zwei Eier gemeistert sind, können sie bei richtiger Durchführung innerhalb von fünf Minuten auf Glukosespiegel und Toxizität analysiert werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Blutgefäße vorbereitet und Blut im Hühnerembryo-Modell sammelt, um die blutzuckersenkende Wirkung natürlicher oder synthetischer Verbindungen zu quantifizieren.

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