Hochdurchsatz-Identifizierung von synergistischen Wirkstoffkombinationen durch die Überlappung² Methode

Das übergeordnete Ziel dieser Methodik ist es, die synergistischen Moleküle zu identifizieren, die sich gegenseitig verstärken, wenn sie durch Hochdurchsatz-Screening kombiniert werden. Synergistische Wirkstoffpaare sind eine vielversprechende Strategie zur Bekämpfung arzneimittelresistenter Infektionen, aber sie sind schwer zu identifizieren. Mit dieser Methode können Moleküle identifiziert werden, die mit bestehenden antimikrobiellen Medikamenten interagieren, die zur Behandlung von Infektionskrankheiten eingesetzt werden.

Langfristig können diese Kombinationen in die präklinische Bewertung eingehen und schließlich die Patientenversorgung verbessern. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie mit jedem Organismus von Interesse und mit jeder Bibliothek kleiner Moleküle durchgeführt werden kann. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie mehrerer Infektionskrankheiten, da sie mit jedem Organismus von Interesse funktioniert.

Verwenden Sie eine Standardtabelle, um den mittleren Wachstumswert und die Standardabweichung für alle Mutanten zu berechnen, wenn eine bestimmte Konzentration des hinzugefügten kleinen Moleküls vorhanden ist. Berechnen Sie dann die Z-Werte für jede Konzentration kleiner Moleküle. Markieren Sie dann die Genmutanten mit signifikanten Z-Werten.

Züchten Sie zunächst eine E.coli-Kultur in M9-Minimalmedium für die Nacht bei 37 Grad Celsius. Lösen Sie dann die kleinen Moleküle in Dimethylsulfoxid in einer hohen Konzentration von über 10 Milligramm pro Milliliter auf. Geben Sie als Nächstes 100 Mikroliter M9-Medium in eine 96-Well-Platte in jede Vertiefung

Weitere 100 Mikroliter M9-Medium werden in die erste Spalte pipettiert, so dass das Volumen in dieser Spalte 200 Mikroliter beträgt. Fügen Sie dann etwa 10 Mikroliter der konzentrierten niedermolekularen Lösung in die erste Spalte hinzu. Nachdem Sie die kleinen Moleküle hinzugefügt haben, beginnen Sie, sie über die X-Achse der Platte zu verdünnen.

Weiter verdünnen, bis 100 Mikroliter in Spalte 11 sind. Nach dem Mischen der Säule 11 werden 100 Mikroliter aus dieser Säule verworfen. In Spalte 12 soll nur Medium sein, um die Daten zu normalisieren.

Als nächstes erfassen Sie den optischen Dichtewert bei 600 Nanometern der Nachtkultur, die in M9-Minimalmedium gezüchtet wurde. Geben Sie dann zwei Mikroliter der Kultur in jede Vertiefung. So dass es 1000 Zellen pro Vertiefung gibt.

Schütteln Sie dann den Teller vorsichtig. Und beachten Sie die optische Dichtemessung bei 600 Nanometern für den Null-Stunden-Zeitpunkt. Sobald der Messwert aufgezeichnet ist, inkubieren Sie die Platte einen Tag lang bei 37 Grad Celsius.

Messen Sie erneut den Wert der optischen Dichte bei 600 Nanometern für einen 24-Stunden-Zeitpunkt. Um den Schachbrett-Assay durchzuführen, züchten Sie eine E.coli-Kultur in M9-Minimalmedium für Nacht bei 37 Grad Celsius. Geben Sie dann 100 Mikroliter M9-Medium in jede Vertiefung und fügen Sie weitere 100 Mikroliter desselben Mediums in die erste Spalte einer 96-Well-Platte hinzu.

Fügen Sie als Nächstes die kleinen Moleküle des Tests in jede Vertiefung in Spalte eins hinzu. Und fügen Sie die doppelte Konzentration in Vertiefung A1 hinzu. Erstellen Sie dann einen Verdünnungsgradienten entlang der X-Achse, indem Sie 100 Mikroliter von Spalte eins in Spalte zwei übertragen. Der Verdünnungsvorgang wird fortgesetzt, bis 100 Mikroliter in Spalte 11 hinzugefügt werden.

Nach dem Mischen von Säule 11 werden 100 Mikroliter aus dieser Säule verworfen und Spalte 12 nur mit Medium ohne Arzneimittel belassen. Erstellen Sie einen weiteren Gradienten für die zweite Wirkstoffverdünnung. Fügen Sie dazu 100 Mikroliter des Mediums hinzu, das zwei X mit minimaler Hemmkonzentration des Eingangsmoleküls in Reihe A enthält.Übertragen Sie dann 100 Mikroliter von Reihe A nach B.Setzen Sie den Verdünnungsprozess fort, bis 100 Mikroliter in Reihe G hinzugefügt werden.Nach dem Mischen von Reihe G werden 100 Mikroliter aus der Vertiefung verworfen.

Beimpfen Sie dann die Platte mit zwei Mikrolitern der Kultur in jede Vertiefung. So dass es 1000 Zellen pro Vertiefung gibt. Messen Sie dann den Messwert der optischen Dichte bei 600 Nanometern für den Null-Stunden-Zeitpunkt.

Sobald der Messwert aufgezeichnet ist, inkubieren Sie die Platte 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Messen Sie dann den Wert der optischen Dichte bei 600 Nanometern für einen 24-Stunden-Zeitpunkt. Um ein Hochdurchsatz-Screening für synergistische Wirkstoffe durchzuführen, kultivieren Sie sowohl Wildtyp- als auch Synergievorhersage-Mutantenzellen in M9-Minimalmedium.

Fügen Sie dann die Medikamente aus der Bibliothek zum Medium hinzu. Als nächstes inokulieren Sie eine Platte mit Bibliotheksmedikamenten mit dem Wildtyp und eine weitere Platte mit mutierten Bakterien zur Synergievorhersage. Diese Platte stellt den Schachbrett-Assay dar, der zur Untersuchung synergistischer Wirkstoffkombinationen verwendet wird.

In dieser Platte zeigt die Vertiefung F9 mit dem niedrigsten FICI-Wert von 0,07 an, dass das kleine Molekülpaar synergistisch ist. Diese Platte stellt den Schachbrett-Assay dar, um nicht-interagierende Wirkstoffkombinationen zu untersuchen. In dieser Platte zeigt die Vertiefung C3 mit dem niedrigsten FICI-Score von 1,0 an, dass das kleine Molekülpaar nicht miteinander interagiert.

Diese Platte stellt den Schachbrett-Assay dar, der zur Untersuchung antagonistischer Wirkstoffkombinationen verwendet wird. In dieser Platte zeigt die Vertiefung A1 mit dem niedrigsten FICI-Wert von 8,0 an, dass die Wechselwirkung zwischen den Wirkstoffmolekülen antagonistisch ist. Als nächstes wird Befeldin A, ein niedermolekulares Medikament in Fluconazol, verwendet, um das Wachstum von C- und U-Forminen zu untersuchen.

Das Diagramm zeigt, dass das Wachstum sowohl des Wildtyps als auch der Synergievorhersagemutante leicht und im gleichen Ausmaß gehemmt ist. Dies deutet darauf hin, dass Befeldin A und Fluconazol nicht-synergistische Wirkstoffpartner sind. Im Gegenteil, das Wachstum der Synergievorhersagemutante von C- und U-Forminen wird in Gegenwart von Refromisyn und Fluconazol signifikant gehemmt.

Dies deutet darauf hin, dass es sich bei den Medikamenten um synergistische Partner handelt. Interessanterweise wird das Wachstum des Wildtyps überhaupt nicht gehemmt. Hier ist der größte Wachstumsunterschied zwischen 32 und 49 Stunden nach der Inokulation zu beobachten.

Einmal gemeistert, kann diese Technik die Zeit verkürzen, um synergistische Wechselwirkungen mit anderen Medikamenten zu identifizieren. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, dass die Medikamente nicht in der letzten Spalte in der letzten Reihe des Schachbrett-Assays kombiniert werden. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden der synergistischen Molekülidentifizierung durchgeführt werden, um zusätzliche synergistische Arzneimittelwechselwirkungen zu identifizieren.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die O2M-Methodik zur Identifizierung mutmaßlicher Synergiemarker verwenden können, um synergistische Wechselwirkungen mit Ihrem interessierenden Organismus zu finden. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit einigen kleinen Molekülen zwar gefährlich sein kann und dass alle Vorsichtsmaßnahmen im Sicherheitsdatenblatt bei der Durchführung dieses Protokolls befolgt werden sollten.