PET-Bildgebung des Neuroinflammation mit [¹¹C] DPA-713 in einem Mausmodell des ischämischen Schlaganfalls

Positronen-Emissions-Tomographie (PET) Bildgebung der Nyrianer Protein 18 kDa (bestreiten) bietet eine nicht-invasive Möglichkeit, die dynamische Rolle der Neuroinflammation in die Entwicklung und das Fortschreiten von Gehirnerkrankungen zu visualisieren. Dieses Protokoll beschreibt bestreiten-PET und ex-Vivo Autoradiographie um Neuroinflammation in einem Mausmodell der ischämischen Schlaganfall zu erkennen.

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, die räumliche Verteilung und das Ausmaß der Neuroinflammation in einem Mausmodell des ischämischen Schlaganfalls mittels TSPO-PET- und MR-Bildgebung genau zu quantifizieren und diese in vivo Befunde mittels ex vivo Autoradiographie zu validieren. Ich freue mich sehr, Ihnen diese Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Verwendung der PET-Bildgebung zur Visualisierung von Neuroinflammation bei einem lebenden Probanden vorstellen zu können. Hier verwenden wir ein Mausmodell eines Strichs als Beispiel.

Nun, warum sollten Sie diese Technik verwenden? Dafür gibt es mehrere Gründe. Die erste ist, dass Neuroinflammation, bei der es sich nur um eine Entzündung handelt, die im zentralen Nervensystem auftritt, als eng verbunden angesehen wird und wirklich vielen, vielen Gehirnerkrankungen zugrunde liegt, einschließlich Schlaganfall, aber auch Alzheimer-Krankheit, Multipler Sklerose, Parkinson und die Liste geht weiter.

Es ist also unglaublich wichtig, dass wir diese Techniken haben, die es uns wirklich ermöglichen, diese biologischen Phänomene zu untersuchen. Zweitens bietet die PET-Bildgebung eine Reihe von Vorteilen gegenüber einigen der traditionelleren Techniken. Zum Beispiel beruhen die meisten dieser traditionellen Techniken stark auf der Verwendung von postmortalem Hirngewebe von Menschen und Mäusen, und obwohl sie eine Reihe wichtiger Erkenntnisse geliefert haben, sind diese Techniken von Natur aus statisch, was bedeutet, dass sie uns nur über einen Moment wirklich Informationen geben können.

Da wir wissen, dass sowohl das Gehirn als auch das Immunsystem hochdynamisch sind, macht es Sinn, dass wir eine Technik haben wollen, die es uns ermöglicht, diese molekularen Prozesse in lebenden, intakten Systemen, also in ihrer natürlichen Umgebung, in Echtzeit wirklich zu erfassen, und genau das macht die PET-Bildgebung. Hier zeigen wir Ihnen, wie wir einen bestimmten PET-Radiotracer, DPA-713, verwenden, von dem bekannt ist, dass er an das TSPO- oder Translokatorprotein bindet. Wir zeigen Ihnen konkret, wie wir ein Bild nicht nur in eine Maus, sondern in vier Mäuse gleichzeitig dynamisch injizieren, und warum das eine so große Sache ist, ist, dass es wirklich hilft, die Anzahl der Mäuse zu erhöhen, die Sie an einem bestimmten Tag mit der gleichen Charge Tracer abbilden können, wodurch Ihre Experimente wirklich rationalisiert werden.

Dies ist zwar eine technische Herausforderung, aber ich hoffe wirklich, dass dieses Video Ihnen helfen kann, dies in Ihrem eigenen Labor durchzuführen. Beginnen Sie damit, die anästhesierten Mäuse in Bauchlage auf dem PET/CT-Scannerbett zu positionieren und sicherzustellen, dass sie gerade und sicher in den Nasenkegeln sitzen. Kleben Sie den Kopf und den Körper jeder Maus mit weichem chirurgischem Klebeband an das Bett und stellen Sie sicher, dass die Atmung nicht durch die Platzierung des Klebebandes eingeschränkt wird.

Sobald die Tiere sicher im Bett sind und die Atmung stabil ist, schalten Sie das Laser-Fadenkreuz ein und bewegen Sie das Scanbett so, dass es mit dem Gehirn aller vier Mäuse ausgerichtet ist. Bringen Sie das Scannerbett mit den Gehirnen der Mäuse so nah wie möglich an die Mitte des Sichtfeldes in die Aufnahmeposition. Erfassen Sie ein Scout-Ansichtsbild der Mäuse, um ihre Position zu überprüfen, und passen Sie die Position an, indem Sie bei Bedarf das Sichtfeldfeld auf der Benutzeroberfläche ziehen.

Klicken Sie abschließend in der Scannersoftware auf Workflow starten, um den CT-Scan zu starten, und stellen Sie sicher, dass Sie die Option Interaktive Benutzeraufforderungen anzeigen auswählen, damit der PET-Scan vor der Tracerinjektion manuell gestartet werden kann. Sobald die Mäuse automatisch von CT zu PET übergehen, richten Sie die Rückseite des Scanners für die Radiotracer-Injektion ein. Legen Sie eine schützende, saugfähige Polsterung auf eine Leiste und stellen Sie sicher, dass Schere und Feuerzeug griffbereit sind.

Schneiden Sie den versiegelten Katheterschlauch mit einer Schere ab. Überprüfen Sie, ob die Katheterleitungen frei von Blasen sind, und bestätigen Sie, dass sich die Kanüle noch in der Vene befindet, indem Sie eine Kochsalzspülung von 10 bis 20 Mikrolitern durchführen, und laden Sie dann zuvor gemessene Dosisspritzen in jeden der vier Katheter, wobei Sie verfolgen, welche Dosis jeder Maus verabreicht wurde. Klicken Sie auf OK, wenn der PET-Scan startbereit ist, während gleichzeitig ein 10-Sekunden-Timer gestartet wird.

Lassen Sie zwei Forscher mit den Dosisspritzen in der Hand an der Rückseite des Scanners sitzen, um alle vier Mäuse gleichzeitig zu injizieren, wenn der Timer Null erreicht. Spülen Sie jeden Katheter mit 50 bis 100 Mikrolitern Kochsalzlösung, um sicherzustellen, dass die volle Dosis in die Schwanzvene gelangt, und verschließen Sie den Schlauch erneut mit einem Feuerzeug. Messen Sie anschließend die Dosisspritzen mit einem Dosiskalibrator, um einen Restradioaktivitätswert zu erhalten.

Notieren Sie sich die Werte und den Zeitpunkt, zu dem sie aufgezeichnet werden. Sobald der Scanvorgang abgeschlossen ist, bringen Sie das PET-Bett mit der horizontalen Home-Taste im Motion Control-Bedienfeld wieder in die ursprüngliche Position. Nehmen Sie die Mäuse aus dem Scanner und entfernen Sie vorsichtig den Katheter.

Üben Sie vorsichtig Druck auf die Kanülenstelle aus, um übermäßige Blutungen zu vermeiden. Messen Sie dann die Restaktivität im Katheter mit einem Dosiskalibrator. Rekonstruieren Sie abschließend die Daten, indem Sie die Nachbearbeitungssoftware öffnen, die jeden Scan automatisch anhand der Histogrammdaten rekonstruiert, die aus der ersten Datei generiert wurden.

Öffnen Sie für die PET-Analyse zunächst die Bildanalysesoftware, klicken Sie auf das Symbol "Daten öffnen", um das CT-Bild zu laden, und wählen Sie das Symbol "Daten anhängen" aus, um das dynamische PET zu laden. Führen Sie eine visuelle Qualitätskontrolle der Daten über den Zeitreihenoperator im Dropdown-Menü durch. Wählen Sie "Referenz" und "Global" aus, und wenden Sie ein entsprechendes Minimum und Maximum für die Farbskala an.

Visualisieren Sie die dynamischen PET-Daten Bild für Bild, überprüfen Sie die Radioaktivitätsaufnahme und prüfen Sie auf Bewegungsstörungen innerhalb des Scans. Erstellen Sie dann mit der Funktion Arithmetik ein durchschnittliches PET-Bild. Wählen Sie "Ausgewählter Durchschnitt" aus, deaktivieren Sie "Referenz" und stellen Sie sicher, dass "Eingang 1", "Eingang 2" und "Eingang" ausgewählt sind, um einen Mittelwert aller PET-Rahmen zu erstellen.

Gehen Sie zur Registerkarte Datenmanager und ziehen Sie das Durchschnittsbild an die Position Eingang 1, um die Visualisierung des PET-Signals anhand des durchschnittlichen PET-Bildes zu ermöglichen. Verteilen Sie dann die Farbskala neu, indem Sie auf die automatische Berechnung im Min/Max-Tool klicken. Registrieren Sie als Nächstes den CT in der durchschnittlichen PET-Datei mit der automatischen 3D-Funktion im Dropdown-Menü Reorientation Registration.

Wählen Sie Ref und Input 1 aus, und wählen Sie Rigid, Fast, Input 1 to Ref registration. Überprüfen Sie die Registrierung visuell in allen drei Dimensionen und passen Sie sie bei Bedarf im Reiter Manuelles 3D mit den Funktionen Translation und Rotation manuell an. Wenn Sie mit der Registrierung zufrieden sind, wählen Sie Eingang 2 und Eingang und wenden Sie ihn auf alle PET-Rahmen an, indem Sie auf das Häkchen klicken.

Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die CT- und PET-Dateien in der DM und speichern Sie sie als RAW. Wählen Sie als Nächstes Zuschneiden aus dem Dropdown-Menü und ziehen Sie die Bildgrenzen, um den Kopf einer Maus jeweils unterhalb des Hirnstamms abzuschneiden. Richten Sie die PET- und CT-Bilder manuell neu aus, so dass der Schädel in allen Dimensionen gerade ist.

Laden Sie das MRT-Bild für diese Maus mit der Schaltfläche Daten anhängen oben links auf der Benutzeroberfläche. Verschieben Sie das MR mit der manuellen 3D-Neuausrichtung und passen Sie es innerhalb des CT-Bildes an den Schädel an. Deaktivieren Sie als Nächstes die PET-Visualisierung, indem Sie sie auf der Registerkarte Visual Controller deaktivieren und nur den MR und den CT verwenden, um den Bereich of Interest oder ROI zu zeichnen.

Klicken Sie im 3D-ROI-Tool auf die Schaltfläche ROI hinzufügen, um einen neuen ROI zu erstellen und ihn Infarct zu nennen. Wählen Sie das Spline-Werkzeug aus, klicken Sie mit der linken Maustaste, um den ROI-Rand zu zeichnen, und klicken Sie mit der rechten Maustaste, um ihn zu schließen. Erstellen Sie anschließend einen neuen ROI und kennzeichnen Sie ihn als kontralateral.

Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den Infarct ROI und wählen Sie Exportieren. Verschieben Sie dann den ROI an Position 2, Eingang 1, um die Visualisierung und manuelle Neuausrichtung des neuen ROI zu ermöglichen. Wenn nur Eingabe 1 ausgewählt ist, aktivieren Sie das Kontrollkästchen ROI und wählen Sie Nur anzeigen, um die Visualisierung des Infarkt-ROI zu ermöglichen, ohne ihn neu auszurichten.

Wenden Sie im Menü "Neuausrichtungsregistrierung" mit der Operator-Funktion einen Links-Rechts-Flip an und verschieben Sie den neuen ROI manuell in den identischen Bereich auf der kontralateralen Seite. Wählen Sie dann den Operator Arithmetik aus und wenden Sie eine skalare Multiplikation von zwei auf den neuen ROI an, was eine unabhängige Quantifizierung der ROIs ermöglicht. Kehren Sie zum 3D-ROI-Tool zurück.

Gehen Sie zur Registerkarte Experte und Experimentell und klicken Sie auf die Schaltfläche ROI importieren. Wählen Sie im Dialogfeld Eingabe 1 aus, um das neue Volume als kontralateralen ROI zu laden. Klicken Sie abschließend mit der rechten Maustaste auf das durchschnittliche PET-Bild, entladen Sie es und schalten Sie das PET wieder ein.

Generieren Sie die quantitativen Aufnahmeergebnisse mithilfe des Symbols "Ergebnisse exportieren" im 3D-ROI-Tool. Die resultierenden PET/CT-Bilder und Zeitaktivitätskurven zeigen eine erhöhte Radiotraceraufnahme in der ipsilateralen im Vergleich zur kontralateralen Hemisphäre. Die Quantifizierung dynamischer PET-Hirnbilder unter Verwendung summierter Daten von 50 bis 60 Minuten zeigte einen signifikanten Anstieg der Traceraufnahme in der ipsilateralen Hemisphäre im Vergleich zur kontralateralen Hemisphäre in dMCAO, jedoch nicht bei Scheinmäusen unter Verwendung des manuell gezeichneten ROI-Ansatzes.

Nachdem Sie sich diese Technik angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Neuroinflammation in einem Mausmodell des ischämischen Schlaganfalls mittels TSPO-PET genau und effizient quantifizieren können, wobei sowohl automatische als auch manuelle Bildanalysemethoden verwendet werden. Wichtig ist, dass Sie in der Lage sein sollten, diese In-vivo-Befunde auch mit der digitalen Ex-vivo-Autoradiographie zu bestätigen. Da die Halbwertszeit von Kohlenstoff-11 so kurz ist, ist es wichtig, vor dem Versuch dieses Verfahrens einen klaren Versuchsplan und Zeitplan zu erstellen, um die Quantität und Qualität Ihrer Daten zu maximieren.

Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie die Immunhistochemie durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie die Korrelation zwischen Gliaaktivierung und TSPO-Expression zu beantworten. Denken Sie daran, dass die Verwendung von Radioaktivität äußerst gefährlich sein kann. Um Ihre Exposition zu minimieren, verwenden Sie bei der Durchführung dieses Verfahrens Schutzkleidung, Bleischutzschilde und vergrößern Sie Ihren Abstand.