Isolierung und Charakterisierung von mesenchymaler Stromazellen Herzzellen von Endomyocardial bioptischen Proben von Arrhythmogenic Kardiomyopathie Patienten

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, kardiale mesenchymale Stromazellen von Patienten mit arrhythmogener Kardiomyopathie zu isolieren, ihre adipogene Differenzierungsfähigkeit zu testen und ihre Oberflächenmarker zu phänotypisieren. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der arrhythmogenen Kardiomyopathie zu beantworten, wie z.B. die Beteiligung von Herzstromazellen an der Adipo-Substitution und molekulare Mechanismen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Isolierung von Stomazellen mit wenigen einfachen Passagen aus sehr kleinen Herzproben durchgeführt werden kann.

Diese Methode kann jedoch Einblicke in die Erforschung der arrhythmogenen Kardiomyopathie geben. Es kann auch auf andere Systeme angewendet werden, wie z. B. die Untersuchung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen, für die eine endomyokardiale Biopsie indiziert ist. Wir haben uns zum ersten Mal mit der Idee für diese Methode beschäftigt, als wir verstanden, dass wir das Verfahren der Stomazellisolierung auf Herzbiopsien und die Elektrophysiologie, die es uns bieten könnte, reduzieren können.

Für dieses Protokoll wird eine Endomyokardbiopsie aus dem rechten Ventrikel eines ACM-Patienten unter Verwendung eines integrierten elektroanatomischen Mappings und einer kardialen Fluoroskopie entnommen. Nehmen Sie etwa fünf Gramm Taschentuch und senden Sie es in TMES-Medium an das Labor. Richten Sie im Labor die biologische Sicherheitswerkbank nach Bedarf ein, um das Verfahren bis zum ensomatischen Aufschluss durchzuführen.

Übertragen Sie dann die Biopsie auf einen Teller und waschen Sie sie zweimal mit PBS. Zu diesem Zeitpunkt kann die Biopsie unter dem Mikroskop fotografisch dokumentiert werden. Übertragen Sie dann die Biopsie in ein Zwei-Milliliter-Röhrchen, das einen Milliliter der Kollagenaselösung enthält.

Schneiden Sie darin die Probe in kleine Fragmente, die zwischen 0,5 und einem Millimeter breit sind. Dann inkubieren Sie das Gewebe 90 Minuten lang bei 37 Grad Celsius unter kontinuierlichem rotierendem Rühren. Als nächstes zentrifugieren Sie die aufgeschlossene Lösung, entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet wieder in einem Milliliter PBS.

Zentrifugieren Sie dann das Röhrchen erneut, entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet wieder in einem Milliliter TMES. Plattieren Sie nun die Suspension auf eine 60-Millimeter-Platte und füllen Sie die Platte mit TMES bis zu drei Milliliter, aber nicht weiter. Anschließend werden die Zellen gemäß dem Textprotokoll kultiviert und erweitert.

Bevor Sie beginnen, stellen Sie sich das Reagenz für die Zelldissoziation, den Waschpuffer und die erforderlichen Antikörper zur Verfügung. Wenn die geschätzte Zellzahl der Kultur drei Millionen erreicht, waschen Sie die 100-Millimeter-Platte zweimal mit 10 Millilitern sterilem PBS. Geben Sie dann fünf Milliliter eines Zelldissoziationsreagenzes zu den Zellen und inkubieren Sie die Platte sieben bis 10 Minuten lang bei Raumtemperatur, um die Zellen zu lösen.

Sobald die Zellen abgelöst sind, fügen Sie den Zellen 15 Milliliter PBS hinzu und überführen Sie die Suspension in ein 50-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie nun die Zellen und suspendieren Sie das Pellet wieder in einem Milliliter Waschpuffer. Zählen Sie dann die Zellen und übertragen Sie drei Millionen in ein neues Röhrchen mit einem Endvolumen von 1,5 Millilitern Waschpuffer.

Teilen Sie dann die Suspension in 12 Faxschläuche auf. Geben Sie in jedes Röhrchen Antikörper, die zur Charakterisierung von CMSCs in den empfohlenen Konzentrationen verwendet werden. Achten Sie darauf, die Isotyp-Steuerelemente einzuschließen.

Nach der Zubereitung inkubieren Sie die Röhrchen 15 Minuten lang bei Raumtemperatur und vor Licht geschützt. Später geben Sie einen Milliliter Waschpuffer in jedes Röhrchen, um die Reaktionen zu stoppen. Zentrifugieren Sie dann die Zellen, entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie die Pellets wieder in 250 Mikrolitern Waschpuffer.

Fahren Sie nun mit der Charakterisierung der Zellen mittels Durchflusszytometrie fort. Nach der adipogenen Differenzierung der Zellen wird mit der ORO-Färbung auf Lipidakkumulation getestet. Bevor Sie beginnen, stellen Sie sicher, dass Sie die funktionierende ORO-Lösung haben.

Entfernen Sie vor dem Färben der Zellen das Medium und waschen Sie die Zellen zweimal mit zwei Millilitern PBS. Bedecken Sie dann die Zellen mit 4% Paraformaldehyd und lassen Sie sie fünf Minuten bei Raumtemperatur fixieren. Als nächstes verwerfen Sie das Paraformaldehyd und waschen die Zellen zweimal mit zwei Millilitern PBS.

Nach der zweiten Wäsche fügen Sie genügend ORO-Arbeitslösung hinzu, um die Zellen zu bedecken. Dann die Platte eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubieren. Diese Inkubation muss in einer Umgebung durchgeführt werden, in der die automatische Lösung nicht funktioniert, daher werden volle Räume nicht empfohlen.

Nach der Inkubation aspirieren Sie die ORO-Lösung und waschen die Zellen mehrmals mit zwei Millilitern PBS, bis der Fleck in der PBS-Wäsche nicht mehr zu sehen ist und bis bei der Betrachtung unter dem Mikroskop keine unspezifische Färbung festgestellt wird. Nehmen Sie nun mit einem inversen Phasenkontrastmikroskop der Gewebekultur 20 Bilder jeder Vertiefung bei 20-facher Vergrößerung auf. Einzelheiten finden Sie im Textprotokoll.

CMSCs wurden wie beschrieben aus Endomyokardbiopsien isoliert. Um ihre mesenchymale Abstammung zu bestätigen, wurden die Zellen mit geeigneten Florofour-konjugierten Antikörpern inkubiert und mittels Durchflusszytometrie analysiert. Die CMSCs waren positiv für die spezifischen mesenchymalen Oberflächenantigene CD29, CD44 und CD105.

Es ist bekannt, dass der Anteil der CD90-positiven Zellen variabel ist. Die Marker für das endotheliale Erbe, das Monozyten- oder Makrophagenerbe, das lautmalerische Erbe und für den wichtigsten histokompatiblen Komplex wurden nicht exprimiert. Als nächstes wurden die CMSCs in T.ADIPO-Medium für die adipogene Differenzierung kultiviert und mit ORO gefärbt, um nach intrazellulären Lipidtröpfchen zu suchen.

CMSCs von Patienten mit arrhythmogener Kardiomyopathie akkumulierten mehr Lipidtröpfchen als Zellen von gesunden Kontrollen. Diese Unterschiede wurden unter Differenzierungsbedingungen nach 72 Stunden und nach sieben Tagen gemessen. Einmal gemeistert, kann die Zellauflösung in drei Stunden erfolgen, die Färbung in zwei Stunden und die Faxanalyse in drei Stunden.

Im Anschluss an dieses Verfahren könnten andere Methoden wie Medikamententests durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. ob wir Stomazellen von denselben Patienten verwenden können, die auf unterschiedliche Reize reagieren. Nach ihrer Entwicklung hat diese Technik Forschern auf dem Gebiet der arrhythmogenen Kardiomyopathie den Weg geebnet, um die Beteiligung menschlicher Herzstromazellen an der Krankheitsentstehung zu erforschen.