Name: Ein Phänomen Bauchspeicheldrüsenkrebs-Maus-Modell zur Untersuchung der Auswirkungen der Irreversible Electroporation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-08T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Erfahren Sie, wie irreversible Elektroporation (IRE) Bauchspeicheldrüsenkrebs in einem syngenen Mausmodell beeinflusst. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Tumorwachstum und Immunantwort in immunkompetenten Tieren.

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RRW erhielt Unterstützung für diese Arbeit aus einer kollaborativen Translational Research Grant finanziert durch das San Diego C3 Padres Pedal die Ursache (#PTC2017).

Alle Tierversuche durchgeführt, im Anschluss an die dieses Protokoll durch die jeweiligen institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) genehmigt werden muss. Alle hier beschriebene Verfahren sind durch IACUC UCSD genehmigt worden.
1. Empfänger Tiere zu beschaffen.
Hinweis: Die KPC-Luc 4580-Zell-Linie wurde gegründet von einem Tumor aus einem LSL-KrasG12D / +; LSL-Trp53R172H / +; PDX1Cre / +; LSL-ROSA26 Luc / + -Maus (KPC), die ein gentechnisch hergestellte Modell der PC auf einem C57BL/6-Hintergrund ist. Der Vorteil dieser Zelllinie ist, dass es konstitutiv drückt Luciferase ermöglicht Überwachung Tumor im orthotopen Modelle. Anderen Zelllinien können jedoch auch verwendet werden, solange sie mit den genetischen Hintergrund der Empfänger Mäuse vereinbar sind.
<ol><li>Bestimmen Sie den experimentellen Gruppen und die Anzahl der Tiere pro Gruppe im voraus.</li>
	<li>Wählen Sie das Alter (6 - 10 - Wochen alten Mäusen empfohlen) und Geschlecht der Versuchstiere nach der Hypothese und der Zell-Linie verwendet.</li>
</ol>(2) Zellkulturen
<ol><li>Verwendung Dulbecco modifizierten Eagle Medium (DMEM): Nährstoff Gemisch F12 (50: 50) Medium mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS) und 1 % Penicillin-Streptomycin Antibiotika (komplette Wachstumsmedium) um die KPC-Luc 4580 Zellen wachsen.</li>
	<li>Wenn gefroren, Auftauen der Zellen 4 Tage vor der Tumor-Implantation.</li>
	<li>Wachsen Sie die Zellen bei 37 ° C mit 5 % CO2 % und 95 % Luftfeuchtigkeit unter aseptischen Bedingungen.</li>
	<li>Trypsinize der Zellen mit 0,25 % Trypsin für 5 min bei 37 ° C, bevor sie erreichen > 80 % Konfluenz und neutralisieren die Trypsin durch Zugabe von zweimal das Volumen des vollständigen Wachstumsmedium. Hinweis: Diese Zellen Tumore effizient bei Mäusen begründen Wenn sie bei 100 % Konfluenz verwendet werden oder wenn sie für mehr als 12 Mal passagiert sind. Daher ist es ratsam, die Zellen am früheren Passagen unter optimalen Konfluenz einzufrieren.</li>
	<li>Zählen der Zellen unter Verwendung einer Hemocytometer und fahren Sie mit Tumor-Induktion, wenn ausreichender Zahl vorhanden sind (0,5 - 1 x 106 Zellen/Maus). Wenn dies nicht der Fall ist, erweitern Sie die Zellen für eine weitere Passage, bis ausreichende Zellzahlen gewonnen werden.</li>
</ol>(3) Induktion von SQ Tumoren
<ol><li>Bereiten Sie die benötigten Materialien: P1000 und P100 Pipetten und Spitzen, 1-mL-Spritze, 25G Nadeln, Basalmembran Matrix (BMM), DMEM basale Medien, 1,5 mL Röhrchen Zentrifugieren. Halten Sie alle Materialien steril und kalt (4 ° C) bis zum Ende des Verfahrens. Auch immer Haarschneidemaschinen und Alkoholtupfer Tier einsatzbereit.</li>
	<li>Trypsinize (wie pro Schritt 2.4) zählen die Zellen und Aufschwemmen ihnen bei einer Konzentration von 2-4 x 107 Zellen/mL kalte DMEM.</li>
	<li>Fügen Sie ein gleiches Volumen von 100 % BMM in 50 % zu einer endgültigen Zellsuspension BMM. Der letzte Band soll 50 µL Zellsuspension für jede Maus erforderlich betragen. Bereiten Sie 10 % im Übermaß der Totraum in der Spritze und pipettieren Fehler unterzubringen.</li>
	<li>Aliquoten Suspension in 550 µL Volumen in 1,5 mL Zentrifuge Röhren in Eis gelegt.</li>
	<li>Zurückhalten der Tiere (6 - Wochen alten männlichen C57BL/6 Mäusen) verwenden eine einschränkende oder manuell. Hinweis: Alternativ können Mäuse mit 2,5 % Isofluran in Sauerstoffgas bei einer Durchflussmenge von 2 L/min mit einem Präzisions-Verdampfer betäubt werden.</li>
	<li>Rasieren der Injektionsstelle, die vorzugsweise auf einer Flanke über ein Bein, eine Haarschneidemaschine verwendet wird. Mit einem Alkoholtupfer Reinigen der Injektionsstelle zweimal.</li>
	<li>Zeichnen Sie 250 µL Zellsuspension auf eine Endkonzentration von 1-2 x 107 Zellen/mL in einer kalten 1-mL-Spritze und entfernen Sie Luftblasen zu, indem Sie den Kolben auf und ab bewegt. Legen Sie eine 25G Nadel auf die Spritze und achten Sie darauf, den Raum innerhalb der Nadel zu füllen.</li>
	<li>Legen Sie die Nadel unter die Haut in einem 30°-Winkel auf den Körper in der Nähe von den Flanken, um sicherzustellen, dass die Nadel nicht gewaltsam der Bauchhöhle oder der Muskulatur der Gliedmaßen öffnen.</li>
	<li>Glätten Sie die Nadel parallel zum Körper, und glätten Sie Falten auf der Haut. Injizieren Sie langsam 50 µL Zellsuspension. Halten Sie die Nadel an der Injektionsstelle für 10 s erlauben die BMM zu festigen, um Undichtigkeiten zu vermeiden.</li>
	<li>Ziehen Sie langsam die Nadel parallel ohne seitliche Bewegung zu halten. Sanft reinigen Sie der Injektionsstelle mit einem Alkoholtupfer und lassen Sie die Maustaste auf dem Gehäuse. Hinweis: Wenn die Maus während des Verfahrens betäubt wurde, überwachen Sie das Tier, bis es seine aufrichtendes Reflexe wiedergewinnt.</li>
	<li>Überwachen Sie das Wachstum des Tumors regelmäßig Bremssättel mit bis zu 5 mm im Durchmesser.</li>
</ol>(4) die Induktion der Orthotopen Tumoren
<ol><li>Bereiten Sie die benötigten Materialien. Autoklaven Werkzeuge der chirurgischen wie Scheren, Skalpelle, Nadel-Treiber, und wies darauf hin und flachen Spitzen Pinzette. Halten Sie praktisch steril Nähte (resorbierbare 6-0 und nicht-absorbierbaren 4-0), Alkoholtupfer, Haarschneidemaschinen, Enthaarungscreme, Auge Schmiermittel, Baumwolle Gaze, 10 % Povidon-Jod-Lösung, op-Abdeckungen, Heizkissen, Buprenorphin und Anästhetika.</li>
	<li>Einschläfern eine Spender-Maus (vorzugsweise aus den gleichen Hintergrund für die orthotopen Modell erforderlichen) tragen einen SQ KPC-Tumor mit einer langsamen Füllung CO2 -Kammer. Verbrauchssteuern Sie SQ Tumor sorgfältig unter sterilen Bedingungen in einem BSL-2 Haube mit sterilen Pinzette und Microscissors kurz vor der orthotopen Implantation. Während Tumor Exzision kümmern Sie sich nicht um die Punktion der Bauchhöhle und den Tumor sofort mit 2 Austausch von sterilen PBS waschen.</li>
	<li>Sterile Skalpelle, hacken Sie den ausgeschnittenen Tumor in 1 mm3 Stücke, legen Sie sie auf eine Petrischale mit kalten sterilen DMEM basale Medien und auf Eis bis zur Implantation lagern.</li>
	<li>Verwalten Sie die Empfänger Maus 0,05 - 1 mg/kg Buprenorphin Analgetikum SQ, 30 min vor der Operation.</li>
	<li>Die Empfänger Mäuse mit 2-3 % Isofluran in Sauerstoff (2 L/min) mit einem Präzisions-Verdampfer (oder anderen Anästhetika) zu betäuben. Halten Sie Mäuse auf einem 37 ° C Heizkissen für die Gesamtheit des Verfahrens. Gelten Sie Schmiermittel für die Augen, um Austrocknung zu verhindern. Die Tiefe der Narkose durch Mangel an überraschenden Reflex zunächst zu testen, und chirurgische Flugzeug Anästhesie durch den Mangel an Pedal Reflex auf eine sanfte Zehe Prise bestätigen. Pflegen Sie die Narkose während der gesamten Operation.</li>
	<li>Platzieren Sie den Mauszeiger auf dem Rücken und drehen Sie es leicht auf der rechten Seite zu, so dass die linke Seite des Bauches ausgesetzt ist. Das Abdominal-Haar der Maus mit Enthaarungscreme entfernen und reinigen mit Gaze um sicherzustellen, dass keine freien Haare den Bauch Post Schnitt betritt. Bereiten Sie den linken Bauch für Chirurgie mit 3 Zyklen von 10 % Povidon-Jod gefolgt von Alkoholtupfer zur Desinfektion der Haut.</li>
	<li>Mit einem sterilen Skalpell, machen Sie einen 1,5 cm quer oder schrägen Schnitt in der Haut, 1 cm Links von der Mittellinie, unterhalb des Brustkorbs, die Milz leicht medial. Dann verlängern Sie den Schnitt durch die Bauchmuskulatur, Spiegelung des darüberliegenden oberflächlichen Schnittes.</li>
	<li>Suchen Sie die Milz mit flachen Spitzen Pinzette und externalisieren Sie sanft aus der Bauchhöhle zu. Einfahren der Milz mit einer sterilen Baumwolle Applikator und der pankreasschwanz auf der Unterseite der Milz zu finden.</li>
	<li>Mit flachen Spitzen Pinzette, zurückziehen der pankreasschwanz seitlich.</li>
	<li>Eine fein gehackte Tumor Stück von der Spender-Maus mit einer Geldbuße (6-0) sterile Box-Nadelspitze holen Sie ab und positionieren Sie es mit sterilen Pinzette.</li>
	<li>Während sanft die Rute/Körper der Bauchspeicheldrüse seitlich einfahren, Stechen Sie die Nadel des Nahtmaterials mit Tumor-Fragment in den pankreasschwanz. Übergeben Sie die Naht langsam durch das Gewebe, hält des Tumors in Kontakt mit der Bauchspeicheldrüse Schweif. Wenden Sie eine oder zwei zusätzliche Nähte je nach Ausrichtung des Fragments in Bezug auf das Gewebe.</li>
	<li>Entfernen Sie die Nadel vollständig aus dem Gewebe und halten die Pankreas/Milz externalisiert für eine zusätzliche 60 s während der Inspektion auf Anzeichen einer Blutung oder Leck. Dann, verinnerlichen sie sanft in die Bauchhöhle mit stumpfen Pinzette.</li>
	<li>Schließen Sie die Bauchmuskulatur mit einer 6-0 resorbierbaren Naht mit entweder einen kontinuierliche oder unterbrochenen Stich und die darüber liegende Haut mit einer 3: 0, 6: 0 nicht absorbierbare unterbrochenen Naht. Die Narkose zu diesem Zeitpunkt einzustellen.</li>
	<li>Lassen Sie die Maus in seinem Hause Käfig mit freiem Zugang zu Futter und Wasser zu erholen. Legen Sie den Käfig auf ein Heizkissen, Erholung zu erleichtern. Vitalfunktionen wie Atmung, Durchblutung etc., während des Wiederherstellungsprozesses zu überwachen.</li>
	<li>Bestätigen Sie die Zeichen der aufrichtenden Reflex, sobald die Maus erholt sich, und dann wieder der Käfig mit regelmäßigen Gehäuse kann.</li>
	<li>Verwalten von Buprenorphin 0,05 - 0,1 mg/kg 8-12 h nach der Operation, und alle 8 bis 12 h nach dem Eingriff Bedarf für Anzeichen von Schmerzen.</li>
	<li>Tumorwachstum mit einer Biolumineszenz in Vivo imaging-System zu überwachen (siehe die Tabelle der Materialien).<ol>
<li>Folgen Sie Tumorwachstum durch bildgebende ab Tag 4 nach der orthotopen Implantation zu und führen Sie imaging zweimal in der Woche.</li>
		<li>Am Tag der Bildgebung zu verwalten (intraperitoneale Injektion) 30 mg/kg D-Luciferin zu einem narkotisierten (ca. 2-3 % Isofluran in Sauerstoff (2 L/min)) Empfänger Maus 10 min vor der Bildgebung.</li>
		<li>Bild für das Luciferase-Aktivität mit der Lumineszenz-Einstellung ohne Emission Filter für ein Minimum von 5 s Belichtung in einem Lumineszenz-Imager mit Auto-Fluoreszenz kostenlosen beheizten Objekttisch und unter Beibehaltung der Narkose für die Mäuse.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(5) IRE SQ Tumoren
<ol><li>Bereiten Sie die benötigten Materialien: quadratische Welle Electroporator, Sicherheits-Fuß-Schalter, Elektroden (Nadel Array versus Pinzette-Trode) und Adapter. Steriles Nahtmaterial (nicht-absorbierbaren 4-0), Alkoholtupfer, Haarschneidemaschinen, Enthaarungscreme, Auge Schmiermittel, Baumwolle Gaze, Buprenorphin und Anästhetika halten ebenfalls in der Nähe.</li>
	<li>Sterilisieren Sie die Pinzette oder Nadel-Array Elektroden mit Gassterilisation. Autoklavieren ist nicht empfehlenswert. Verwenden Sie ein Glas Bead Sterilisator, um die Elektroden zwischen Tieren zu sterilisieren.</li>
	<li>Buprenorphin 0,05 - 0,1 mg/Kg an der Tumor-tragenden Mäusen 30 min. vor dem Eingriff zu verwalten.</li>
	<li>Schritte 4,4-4,5 erfolgreich Anästhesie bei Mäusen zu induzieren, sobald das Implantat SQ Tumor Durchmesser 5 mm erreicht.</li>
	<li>Legen Sie die narkotisierten Maus auf die Seite den SQ Tumor an der Flanke Zugriff auf. Entfernen Sie die Haare mit Klipper und gereinigte Haut mit einem Alkoholtupfer.</li>
	<li>Für SQ Tumoren Array 2-Nadel-Elektroden verwendet werden. Erheben Sie die Haut direkt unter der Tumor-Website mit Pinzette und legen Sie die Elektroden durch die Haut parallel zum Körper dafür, dass sie nicht die Bauchhöhle eindringen. Einmal durch die Haut, positionieren Sie die Elektroden so, dass sie den Tumor Halterung.</li>
	<li>Programmieren der Electroporator 100 µs Impulse mit einer Frequenz von 1 Hz mit 1.500 V/cm für eine Gesamtmenge von 150 Impulse liefern. Die Impulse, die über das Fußpedal zu liefern. Trennen Sie jeden Satz von 10 Impulse durch 10 s, um für die Wärmeableitung und die richtige Position der Elektroden zu bestätigen. Hinweis: Ohne den Einsatz von paralytischen Agenten Mäuse Muskelkontraktionen mit IRE erleben, die Verschiebung der Elektroden führen können, es sei denn, manuell gesichert.</li>
	<li>Entfernen Sie die Elektroden nach kompletten Dosierung nicht überschreiten sollte 200 S. Datensatz die tatsächliche Spannung geliefert, die auf der Electroporator angezeigt wird. Lassen Sie die Mäuse wieder Anschluss an IRE gemäß Schritte 4.14-4.16.</li>
</ol>(6) IRE Orthotopen Tumoren
Hinweis: Zorn der orthotopen Tumoren umfasst eine zweite überleben-Operation auf die gleiche Maus erfordern somit besondere Genehmigung von lokalen IACUC vor Beginn.
<ol><li>Benötigte Materialien vorbereiten: Autoklaven die chirurgischen Werkzeuge wie Scheren, Skalpelle, Nadel Treiber, Pinzette spitz und flach gekippt, Zange. Beachten Sie Folgendes in der Nähe sowie: steriles Nahtmaterial (resorbierbare 6-0 und nicht-absorbierbaren 4-0), Alkoholtupfer, Haarschneidemaschinen, Enthaarungscreme, Auge Schmiermittel, Baumwolle Gaze, 10 % Povidon-Jod-Lösung, op-Abdeckungen, Heizkissen, quadratische Welle Electroporator Sicherheit-Fußschalter, Elektroden und ihre Adapter Buprenorphin und Anästhetika.</li>
	<li>Die Mäuse für orthotopen Tumorwachstum durch in-Vivo Bildgebung zu beurteilen (siehe Schritt 4.17) durch die intraperitoneale Injektion von 30 mg/kg D-Luciferin. Hinweis: Der orthotopen Tumoren sind ideal für IRE Behandlung 8 bis 10 Tagen Post Implantation, wenn die Tumoren sind deutlich sichtbar und noch engen an der Bauchspeicheldrüse wie auf die Luciferase-Lumineszenz-Bilder ersichtlich (siehe die Vertreter Ergebnisse).</li>
	<li>Führen Sie die Schritte 4.4-4,9, um den implantierten Tumor zu finden. Wenn der Tumor nicht leicht zu finden, verwenden Sie stumpfe Nase Zange um zu Magen und Milz sanft um den Tumor zu identifizieren zu bewegen.</li>
	<li>Externalisieren Sie den Tumor mit der stumpfe Nase Pinzette zu und erfassen Sie den Tumor mit der Platin-Elektroden von der Pinzette-Trode fest. Die Elektroporation Impulse zu liefern, wie im Schritt 5.7 mit Rechtecksignal Electroporator in Gruppen von 10 Impulse durch den Fußschalter gesteuert programmiert.</li>
	<li>Halten Sie den Tumor externalisiert für mindestens 60 s Post IRE, auf Anzeichen von Blutungen zu überwachen. Einfügen des Tumors zurück in die Bauchhöhle und schließen Sie den Schnitt als beschrieben (Schritte 4.13-4.16) und die Maus zu überwachen, bis es erholt.</li>
	<li>Überwachen Sie die Auswirkungen der IRE auf das Tumorwachstum mit in Vivo Luciferase Bildgebung wie pro Schritt 4.17..</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben keine relevanten finanziellen Angaben.

In dieser Studie haben wir einem immunkompetenten Mausmodell für PC gezeigt, die verwendet werden, um die Auswirkungen der IRE auf das Tumorwachstum zu studieren. IRE wird derzeit, als nicht-thermische Ablation Technik nur in sehr ausgewählten lokal fortgeschrittenen PC-Patienten verwendet, die nicht weit entfernten Krankheitsprogression nach Monaten der präoperativen Therapie verfügen. Seine Verwendung wurde deshalb begrenzt, weil die meisten Patienten mit lokal fortgeschrittenem PC entfernten Metastasen<sup class="xref...

Duktales Pankreaskarzinom (PC) wird voraussichtlich die zweithäufigste Ursache der durch Krebs verursachten Todesfälle in den USA um 20201geworden. Die überwiegende Mehrheit der Patienten mit PC wird schließlich von entfernten Metastasen2sterben. Die PC-Mikroumgebung ist notorisch immunsuppressive und chemoresistentem. Seine Desmoplastic Stroma enthält eine Knappheit der Effektor (Anti-Tumor) T-Zellen und eine Schartenhöhe von immunsuppressiven Leukozyten, einschließlich Tumor-assoziierten Makrophagen (TAMs), myeloische abgeleiteten Suppressor Zellen (MDSCs) und regulatorische T-Zellen (Tregs)3 . Diese unterliegen die Notwendigkeit, multimodale Strategien zu entwickeln, die diese Effekte der Mikroumgebung entgegenwirken.
IRE wurde als nicht-thermische Methode der Tumor Ablation entwickelt. Im Gegensatz zu thermische Ablation Techniken IRE verursacht keine schnelle coagulative Nekrose aber stattdessen schrittweise Apoptotic Zelle Tod4führt. Vor allem für Tumoren der Bauchspeicheldrüse IRE ist nicht anfällig für "Heat Sink" Effekte und direkt neben den Blutgefäßen5durchgeführt werden kann. Diese Technologie hat 510(k) Clearance aus dem FDA-6 und wird derzeit klinisch bei ausgewählten Patienten mit lokal fortgeschrittenem oder grenzwertig entfernbaren Bauchspeicheldrüsenkrebs eingesetzt. In der größten veröffentlichten Reihe der IRE für PC7war die mediane Überlebenszeit von Patienten mit IRE etwa verdoppeln das Überleben von Patienten mit modernen Chemotherapie allein ohne Resektion8,9.
Mehrere Studien haben gezeigt, dass thermische Ablation führt zu eine systemischen Immunantwort bei anderen Tumorarten (rezensiert in Chu Et al. 10). Radiofrequenz-Ablation (RFA) in tierischen Tumor Modelle führt zu erhöhte T-Zell-Infiltrate11,12, unter anderem eine Erhöhung in den aktivierten natürlichen (NK) Killerzellen in hepatozellulären Krebs Patienten13, 14, und eine Abnahme der immunsuppressiven Tregs in der Lunge Krebs Patienten15. Immunsystem, microenvironmental, und Verletzungen Antworten auf IRE16haben eine viel kleinere Anzahl von Studien untersucht. IRE hat gezeigt, dass eine systemischen Immunantwort bei immunkompetenten Mausmodellen zu stimulieren, in dem das Wachstum der sekundären (kontralateralen) renal Cell Allografts wurde reduziert bzw. verhindert durch IRE eines primären Tumors zwei Wochen, früher17. Sie bemerkte auch, dass immunkompetenten Mäusen weniger Spannung für vollständige Regression benötigt als immungeschwächte Mäuse haben. Es hat die Hypothese, dass IRE verbesserte Antigenpräsentation im Vergleich zu den coagulative Nekrose der thermische Ablation führen kann, aber dies wurde nicht speziell untersucht.
Haben wir ein Phänomen Mausmodell der PC von der KPC-Luc 4580-Zell-Linie (Geschenk von j.j. Yeh an der University of North Carolina), die von einem Tumor abgeleitet wurde, die in einem männlichen LSL-Kras entwickeltG12D / +; LSL-Trp53R172H / +; PDX1Cre / +; LSL-ROSA26 Luc / + Maus, um die lokalen und systemischen Wirkungen von IRE18,19untersuchen. Diese Zelllinie Luciferase exprimierenden ist immunogen und auch tumorigenic bei immunkompetenten C57BL/6 Mäusen, wenn SQ oder Orthotopically injiziert und zuverlässig produziert Leber-Metastasen in der Milz injiziert. Wir haben eine programmierbare Rechtecksignal Impulsgenerator um 100 µs elektrische Impulse im Verhältnis Spannung/Entfernung von 1.500 V/cm mit einem zwei-Nadel-Array-Sensors (getrennt durch 5 mm) oder Platin Pinzette-Trodes SQ oder orthotopen Tumoren, liefern genutzt bzw. in Mäuse, die Auswirkungen der IRE in ein kleines Tier zu modellieren.

<table><tbody><tr><td>ECM 830 Rechteck-Elektroporator</td><td>Harvard Apparat</td><td>BTX # 45-0002 ( 58018-004 )</td><td></td></tr><tr><td>2 Nadel-Array-Elektrode</td><td>Harvard Gerät</td><td>45-0167</td><td></td></tr><tr><td>Sicherheits-Fußschalter</td><td>Harvard Gerät</td><td>45-0211</td><td></td></tr><tr><td>Platin-Pinzette</td><td>Harvard Gerät</td><td> 45-0486</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12 Medien</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>ThermoFisher</td><td>Scientific 10437028</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning&nbsp;</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td></td><td></td>792632</tr><tr><td>Lacrilube</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>19090646</tr><tr><td>Buprenorphin</td><td>Fisher Wissenschaftlich&nbsp;</td><td></td><td></td>NC1292810</tr><tr><td>D-Luciferrin</td><td>Perkin Elmer</td><td>122799</td><td></td></tr><tr><td>IVIS&nbsp; Spectrum In Vivo Imaging System</td><td>Perkin Elmer</td><td>124262</td><td></td></tr><tr><td>Mausstamm C57BL/6J</td><td>The Jackson Laboratory&nbsp;</td><td>000664/Schwarze</td> 6-Zellen-Linie <td></td></tr><tr><td>(KPC-Luc 4580)</td><td>J.J. Yeh Lab an der University of North Carolina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Precisionglide Spritzennadeln</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td></td><td></td>Z192406</tr><tr><td>Alkoholtupfer (70% Isopropylalkohol</td>) <td>BD</td><td>326895</td><td></td></tr><tr><td>Digitale Messschieber</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14-648-17</td><td></td></tr><tr><td>Einwegskalpelle, steril</td><td>VWR</td><td>21909</td><td></td></tr><tr><td>Applikatoren mit Wattespitze</td><td>VWR</td><td>89198</td><td></td></tr><tr><td>Nahtnadel, 45 cm, Größe 6-0</td><td>Harvard Gerät</td><td>72-3308</td><td></td></tr><tr><td>Nahtnadel, 45 cm, Gr. 4-0</td><td>Harvard Gerät</td><td>72-3314</td><td></td></tr><tr><td>Povidon-Jod 10%</td><td>BD</td><td>29900-404</td><td></td></tr><tr><td>Einweg-Wärmekissen&nbsp;</td><td>KENT SCIENTIFIC CORP.</td><td>TP-3E</td><td></td></tr><tr><td>Maus Haarschneider</td><td>KENT SCIENTIFIC CORP.</td><td>CL8787</td><td></td></tr><tr><td>OP-Tuch</td><td>Harvard Apparatus</td><td>59-7421</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr></tbody></table>

ein phänomen bauchspeicheldrüsenkrebs-maus-modell zur untersuchung der auswirkungen der irreversible electroporation

A Syngeneic Pancreatic Cancer Mouse Model to Study the Effects of Irreversible Electroporation

Bauchspeicheldrüsenkrebs (PC), eine Krankheit, die etwa 40.000 Patienten jedes Jahr in den USA tötet hat mehrere Therapieansätze einschließlich der vielversprechenden immunotherapeutic Strategien erfolgreich umgangen. Irreversible Electroporation (IRE) ist eine nicht-thermische Ablation-Technik, die induziert Tumor Zelltod ohne Zerstörung des benachbarten kollagenen Strukturen, so dass das Verfahren bei Tumoren in der Nähe von Blutgefäßen durchgeführt werden. Im Gegensatz zu thermische Ablation Techniken IRE führt schrittweise apoptotischen Zelltod, zusammen mit sofortigen Ablation induzierten Nekrose, und ist derzeit in der klinischen Anwendung bei ausgewählten Patienten mit lokal fortgeschrittenem PC. Ein Ablativ Nichtziel-spezifisches Verfahren wie IRE kann eine Vielzahl von Reaktionen in der Mikroumgebung Tumor auslösen. Einige Studien haben die Auswirkungen der IRE auf das Tumorwachstum in andere Tumorarten angesprochen, aber keiner konzentrierten sich auf PC. Wir haben ein Phänomen Mausmodell der PC in der subkutanen (SQ) und orthotopen Tumoren erfolgreich behandelt werden können mit IRE in einer sehr kontrollierten Umgebung erleichtern verschiedene Längsschnittstudien Post-Verfahren entwickelt. Dieses Tiermodell dient als ein robustes System zur Untersuchung der Auswirkungen der IRE und Möglichkeiten zur Verbesserung der klinischen Wirksamkeit von IRE.

Wir folgten das Verfahren beschriebenen und SQ Tumoren auf 5-6 Wochen alte Wildtyp C57BL/6 Mäusen mit 1 x 106 Zellen mit 50 geimpft % erzeugt BMM. Wenn die Größe des Tumors ca. 5-6 mm im Durchmesser erreicht, ein paar von den Mäusen wurden eingeschläfert, deren Tumoren wurden herausgeschnitten und Orthotopically bei einem Empfänger C57BL/6 Mäusen implantiert. IRE war durchgeführten 10 Tage Post Implantation, wie in der Timeline auf Abbildung 1gezei...

Irreversible Electroporation (IRE) ist eine nicht-thermische Ablation-Technik zur Behandlung von lokal fortgeschrittenem Bauchspeicheldrüsenkrebs eingesetzt. Eine relativ neue Technik sind, die Auswirkungen der IRE auf das Tumorwachstum schlecht verstanden. Wir haben ein Phänomen Mausmodell entwickelt, das ermöglicht, die Auswirkungen der IRE an Bauchspeicheldrüsenkrebs.

Ein Phänomen Bauchspeicheldrüsenkrebs-Maus-Modell zur Untersuchung der Auswirkungen der Irreversible Electroporation

Pancreatic cancer (PC), a disease which kills approximately 40,000 patients each year in the US, has successfully evaded several therapeutic approaches ...

Das übergeordnete Ziel dieses Modells ist es, die Auswirkungen der irreversiblen Elektroporation (IRE) auf Bauchspeicheldrüsenkrebs bei immunkompetenten Mäusen zu untersuchen. Dieses Modell kann helfen, viele Schlüsselfragen zur Rolle von IRE bei Bauchspeicheldrüsenkrebs zu beantworten. Wie wirkt sich IRE beispielsweise auf die lokale Tumormikroumgebung aus?Der Hauptvorteil dieses Modells besteht darin, dass es eine genaue Beurteilung des Tumorwachstums in einem immunkompetenten System ermöglicht, ohne dass Knockout- oder mutierte Mausmodelle erforderlich sind. Diese Methode kann Einblicke in die Auswirkungen von IRE auf das Immunsystem in einem immunkompetenten Mausmodell für Bauchspeicheldrüsenkrebs geben. Für die subkutane Tumorinduktion rasieren Sie zuerst die Injektionsstelle einer anästhesierten, sechs Wochen alten, männlichen, C57 Black Six-Maus und verwenden Sie einen Alkoholtupfer, um die Stelle zweimal zu reinigen.Als nächstes wird eine kalte Ein-Milliliter-Spritze mit ein bis zwei mal zehn bis sieben Zellen pro Milliliter und 250 Mikrolitern Basalmembranmatrix beladen. Befestigen Sie eine 25-Gauge-Nadel an der Spritze und laden Sie die Nadel mit der Tumorzellsuspension. Drücken Sie den Kolben einige Male und ziehen Sie ihn wieder ein, um Luftblasen zu entfernen.Führen Sie die Nadel vorsichtig in einem Winkel von 30 Grad unter die Haut der Injektionsstelle ein. Mit der Nadel parallel zum Körper injizieren Sie langsam 50 Mikroliter der Tumorzellen. Ziehen Sie die Nadel nach 10 Sekunden langsam zurück, halten Sie sie parallel ohne Seitwärtsbewegung, und reinigen Sie die Injektionsstelle vorsichtig mit einem Alkoholtupfer, bevor Sie die Maus wieder in ihren Käfig zurückbringen.Wenn der Tumor fünf bis sieben Millimeter erreicht, verwenden Sie eine sterile Pinzette und eine Mikroschere, um den subkutanen Tumor unter sterilen Bedingungen in einer Haube der Biosicherheitsstufe zwei zu entfernen, und achten Sie darauf, die Bauchhöhle nicht zu punktieren. Waschen Sie den exzidierten Tumor sofort zweimal in sterilem PBS. Und zerkleinern Sie den Tumor mit sterilen Skalpellen in ein bis zwei Kubikmillimeter große Stücke.Übertragen Sie dann die Tumorstücke in eine Petrischale, die kaltes, steriles DMEM-Basalmedium auf Eis enthält. Um die Tumorfragmente zu implantieren, tragen Sie nach Bestätigung einer fehlenden Reaktion auf das Einklemmen der Zehen eine Salbe auf die Augen des anästhesierten Empfängertieres auf und platzieren Sie die Maus auf der rechten Seite, so dass die linke Seite des Bauches freiliegt. Entfernen Sie die Bauchhaare mit Enthaarungscreme und entfernen Sie die Creme mit Gaze.Nachdem Sie die exponierte Haut mit drei aufeinanderfolgenden 10%igen Povidon-plus-Jod- und Alkoholtüchern desinfiziert haben, verwenden Sie ein steriles Skalpell, um einen 1,5 Zentimeter langen Schnitt in die Haut zu setzen, einen Zentimeter links von der Mittellinie, unterhalb des Brustkorbs und leicht medial zur Milz. Schieben Sie die Milz vorsichtig mit einer flachen Pinzette und einem sterilen Baumwollapplikator nach außen und ziehen Sie mit der Pinzette den Schwanz der Bauchspeicheldrüse am unteren Ende der Milz seitlich zurück. Fassen Sie mit einer sterilen Pinzette ein fein zerkleinertes Tumorstück und führen Sie eine feine sterile Nahtnadel mit 6 O durch das Stück.Führen Sie die Nadel mit dem Tumorfragment in den Schwanz der Bauchspeicheldrüse ein und führen Sie die Naht langsam durch das Gewebe. Achten Sie darauf, den Kontakt zwischen dem Tumor und der Bauchwandmuskulatur und dem Bauchfell zu vermeiden, um eine Tumoraussaat zu verhindern. Wenn das Tumorfragment gesichert ist, entfernen Sie die Nadel vollständig aus dem Gewebe und halten Sie die Organe für weitere 60 Sekunden vollständig externisiert, während Sie nach Anzeichen von Blutungen suchen.Wenn keine Blutung beobachtet wird, verwenden Sie eine stumpfe Pinzette oder einen Wattestäbchenapplikator, um Milz, Bauchspeicheldrüse und Tumor sanft in die Bauchhöhle zurückzubringen. Bevor der Tumor einen Durchmesser von sechs Millimetern erreicht, legen Sie das betäubte Tier auf die rechte Seite, um Zugang zum Tumor zu erhalten, und reinigen Sie die Tumorstelle mit einer Haarschneidemaschine und einem Alkoholtupfer. Heben Sie mit einer Pinzette die Haut direkt unter dem Tumor an und führen Sie zwei Nadelarray-Elektroden parallel zum Körper durch die Haut ein, um den Tumor zu umklammern, wobei Sie darauf achten müssen, dass die Elektroden nicht in die Bauchhöhle eindringen.Stellen Sie den Elektroporator so ein, dass er 100 Mikrosekunden-Impulse mit einer Frequenz von einem Hertz bei 1500 Volt pro Zentimeter für insgesamt 150 Impulse abgibt, und verwenden Sie das Fußpedal, um die Impulse abzugeben, wobei Sie jeden Satz von 10 Impulsen durch 10 Sekunden trennen, um eine Wärmeableitung zwischen den einzelnen Impulssätzen zu ermöglichen. Da Muskelzuckungen während der IRE-Abgabe auftreten und während des ersten Impulssatzes stärker ausgeprägt sind, stellen Sie sicher, dass sich die Elektroden noch an der gewünschten Stelle befinden und dass das Tier nach jedem Impulssatz immer noch sediert ist. Entfernen Sie nach nicht mehr als 200 Sekunden Dosierung die Elektroden und notieren Sie die tatsächlich abgegebene Spannung, wie sie auf dem Elektroporator angezeigt wird.Setzen Sie dann die Maus wieder in ihren Käfig ein. Für die IRE eines orthotopen Tumors verwenden Sie acht bis 10 Tage nach der Tumorimplantation eine stumpfnasige Pinzette, um den Tumor mit der Pinzette zu externalisieren, und erfassen Sie den Tumor fest mit den Platinelektroden der Pinzette, geben Sie die Elektroporationsimpulse ab, wie gerade demonstriert, und halten Sie den Tumor für den letzten Satz von Impulsen mindestens 60 Sekunden lang externalisiert. zur Überwachung auf Anzeichen von Blutungen. Bringen Sie dann den Tumor wieder in die Bauchhöhle zurück und schließen Sie den Schnitt, wie gezeigt, und überwachen Sie das Tier, bis es sich vollständig erholt hat.In diesem repräsentativen Experiment bildeten sich die subkutanen Tumoren bei fast 50% der Mäuse nach 150 IRE-Impulsen vollständig zurück, mit nur geringen Rückbildungen nach 75 Impulsen. Die histologische Analyse des Tumorgewebes, eine Woche nach der IRE, zeigte bei unvollständiger Tumorregression große Regionen mit zentraler Tumornekrose, die bei unbehandelten Kontrolltumoren nicht beobachtet wurden und von lebendem Tumorgewebe flankiert wurden. Die Überwachung der Wachstumsraten implantierter orthotoper Tumoren zeigte ein konsistentes Tumorwachstum im Laufe der Zeit bei Empfängertieren, das auch durch IRE gestört werden konnte, was die Fähigkeit dieses Modells zeigt, die Auswirkungen von IRE in einem immunkompetenten Mausmodell zu simulieren.Einmal gemeistert, kann diese Technik in 15 Minuten pro Maus abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, die Tumorgröße innerhalb des Arbeitsabstands der verfügbaren IRE-Elektroden zu halten, da größere Tumoren aufgrund einer unvollständigen Ablation inkonsistente Reaktionen hervorrufen. Auch andere Behandlungsansätze, wie Bestrahlung oder Chemotherapien, können genutzt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, ob die Kombination von Behandlungen das Ansprechen von Tumoren auf IRE verbessern kann.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man subkutane und orthotope Bauchspeicheldrüsenkrebserkrankungen bei Mäusen etabliert und wie man IRE bei diesen Tumoren durchführt.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Das Video erklärt eine schrittweise chirurgische Methode zur orthotopen Implantation eines Tumorfragments von einem krebsartigen Spender in die Bauchspeicheldrüse einer nicht krebsartigen Empfängermäuse zur Entwicklung von Bauchspeicheldrüsenkrebs. Orthotopisch implantiertes PDAC könnte die Gewebemikroumgebung von menschlichem Bauchspeicheldrüsenkrebs genauer erfassen als herkömmliche subkutane (SC) Modelle.

Orthotope homotransplantierte Tumortransplantation: Eine Technik zur Generierung von Mausmodellen für Pankreastumoren

Dieses Video beschreibt das Verfahren zur Durchführung einer irreversiblen Elektroporation (IRE) für die nicht-thermische Ablation von Bauchspeicheldrüsentumoren bei Mäusen. Sowohl subkutane (SQ) als auch orthotope Tumoren können erfolgreich mit IRE in einer hochgradig kontrollierten Umgebung behandelt werden, was verschiedene Studien nach dem Eingriff ermöglicht.

Irreversible Elektroporation: Eine Technik zur Ablation von Bauchspeicheldrüsentumoren bei Mäusen

Dieses Video demonstriert das Protokoll für die orthotopische Implantation von grün fluoreszierenden Protein-exprimierenden Bauchspeicheldrüsenkrebszellen in die Bauchspeicheldrüse der Maus. Das orthotope Mausmodell hilft bei der Untersuchung der Wirksamkeit neuartiger Therapeutika bei primären und metastasierten Tumoren.

Fluoreszierendes orthotopes Mausmodell: Implantation von GFP-exprimierenden Krebszellen in eine Maus zur Beurteilung der Tumorprogression in vivo

Dieses Video zeigt ein orthotopes Modell von Bauchspeicheldrüsenkrebs, das Matrigel für die lokalisierte Zellabgabe und in vivo Biolumineszenz-Bildgebung zur nicht-invasiven Überwachung der Tumorprogression verwendet. Das orthotope Modell eignet sich sowohl für syngene als auch für Xenotransplantatmodelle und könnte in präklinischen Studien verwendet werden, um den Einfluss neuartiger Krebstherapeutika auf das Wachstum des primären Pankreastumors und die Metastasierung zu untersuchen.

Biolumineszierendes orthotopes Pankreaskarzinom-Mausmodell: Eine nicht-invasive Technik zur Überwachung des Fortschreitens von Krebs bei Mäusen

Eine präklinische, Mausmodell der Lebermetastasen über eine hemispleen Injektionstechnik durchgeführt.

Einer präklinischen Mausmodell der Lebermetastasen

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die dynamische kontrastverstärkte Magnetresonanztomographie (DCE-MRT) für orthotope Xenotransplantate von Pankreastumoren bei Mäusen anzuwenden. Die DCE-MRT ist eine nicht-invasive Methode zur Analyse der Mikrogefäße in einem Zielgewebe und nützlich zur Beurteilung der Gefäßreaktion in einem Tumor nach einer neuartigen Therapie.

Dynamic Contrast Verbesserte Spintomographie von einem orthotopen Mausmodell Bauchspeicheldrüsenkrebs

Ein Verfahren zur orthotopischen Implantation von grün fluoreszierenden Protein-exprimierenden Bauchspeicheldrüsenkrebszellen (PANC-1 GFP) in die Bauchspeicheldrüse von Balb-c Ola Hsd-Fox1nu Mäusen zur Beurteilung der Tumorprogression und Metastasierung wird hier vorgestellt.

Fluoreszierende orthotopen Mausmodell des Bauchspeicheldrüsenkrebs

Wir beschreiben ein Protokoll für die ultraschallgeführte Implantation von murinabgeleiteten duktodrischen Adenokarzinom-Zelllinien direkt in die native Tumorstelle. Dieser Ansatz führte zu Pankreastumoren, die durch Ultraschall-Scanning innerhalb von 2-4 Wochen nach der Injektion nachweisbar waren, und reduzierte den Anteil der Tumorzellsaatierung an der Peritonealwand im Vergleich zur chirurgischen orthotopischen Implantation signifikant.

Ultraschallgeführte orthotopische Implantation von murine Pankreas-Ductalsocarcinom

Im klinischen Kontext werden Patienten mit lokalisierten Bauchspeicheldrüsenkrebs einer Pankreastektomie unterzogen, gefolgt von einer adjuvanten Behandlung. Dieses hier berichtete Protokoll zielt darauf ab, eine sichere und effektive Methode zur Modellierung dieses klinischen Szenarios bei nackten Mäusen durch orthotopische Implantation von Bauchspeicheldrüsenkrebs zu etablieren, gefolgt von distaler Pankreatektomie und Splenektomie.

Ein orthotopisches Resektions-Mausmodell für Bauchspeicheldrüsenkrebs

Syngene orthotope Allotransplantate der Maus des duktalen Adenokarzinoms der Bauchspeicheldrüse (PDAC) rekapitulieren die Biologie, die Phänotypen und das therapeutische Ansprechen von Krankheitssubtypen. Aufgrund ihrer schnellen, reproduzierbaren Tumorprogression sind sie in präklinischen Studien weit verbreitet. In dieser Arbeit zeigen wir gängige Praktiken zur Generierung dieser Modelle, indem wir syngene murine PDAC-Kulturen in die Bauchspeicheldrüse injizieren.

Syngene orthotope Allotransplantate der Maus zur Modellierung von Bauchspeicheldrüsenkrebs

Das vorliegende Protokoll beschreibt einen neuartigen Ansatz zur Modellierung der chronisch obstruktiven Pankreatitis, der die Visualisierung des Pankreasgangs und die Elektrokoagulation des Pankreasgangs beinhaltet, um eine Obstruktion des Pankreasgangs zu verursachen.

Ein obstruktives Modell der chronischen Pankreatitis, das durch Elektrokoagulation etabliert wurde

Erfahren Sie, wie irreversible Elektroporation (IRE) Bauchspeicheldrüsenkrebs in einem syngenen Mausmodell beeinflusst. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Tumorwachstum und Immunantwort in immunkompetenten Tieren.

Ein Phänomen Bauchspeicheldrüsenkrebs-Maus-Modell zur Untersuchung der Auswirkungen der Irreversible Electroporation

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