Stereotaktischen Chirurgie für Genmanipulation in Striatale Zellen des Neugeborenen Mäusegehirnen

Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen in der genetischen und neurologischen Entwicklung zu beantworten, z. B. während der postnatalen Entwicklung. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass es sich um eine einfache Technik mit einem selbstgebauten Gerät handelt. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da gezielte Injektionen in das Gehirn volle Aufmerksamkeit für Details erfordern.

Machen Sie zunächst einen Halter, um Neugeborene in einem stereotaktischen Gerät zu verwenden. Stellen Sie zuerst die Kopfablage her. Schneiden Sie etwa 1/5 des Bodens eines 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchens ab, um eine Öffnung für den Kopf eines Neugeborenen zu schaffen.

Wählen Sie als Nächstes eine leere Pipettenspitzenbox aus, die auf den Sockel des stereotaktischen Geräts passt. Befestigen Sie dann die Kopfablage mit Heißkleber am Boden der Spitzenbox. Kleben Sie als Nächstes eine Kassette zum Einbetten von Gewebe auf die Box, wo sie den Oberkörper des Welpen stützen kann, während sein Kopf fixiert ist.

Bereiten Sie nun 30 Gauge Edelstahlnadeln für die Injektion vor. Reinigen Sie sie zunächst, indem Sie sie drei Tage lang in einem Glasfläschchen in Chloroform einweichen. Entfernen Sie drei Tage später vorsichtig die Nadeln und waschen Sie sie 20 Minuten lang mit absolutem Ethanol und mit 50 U/min Rührwerk.

Waschen Sie sie dann dreimal 10 Minuten pro Waschgang in 70%igem Ethanol, ebenfalls unter Rühren. Lassen Sie die Nadeln nach dem Waschen an der Luft trocknen und bewahren Sie sie bis zum Gebrauch in einer sauberen Box bei Raumtemperatur auf. Verwenden Sie für die Mikroinjektionsbaugruppe ein fünf Zentimeter langes Segment aus PE20-Polyethylenschlauch, um den PE10-Schlauch mit einer 26-Gauge-10-Mikroliter-Spritze zu überbrücken.

Sichern Sie die Verbindung mit Cyanacrylat. Montieren Sie als Nächstes die neue 30-Gauge-Injektionsnadel am anderen Ende des PE10-Rohrs. Laden Sie nun die 10-Mikroliter-Mikroinjektionsspritze.

Entfernen Sie den Kolben und verwenden Sie eine weitere 25-Gauge-Spritze, um die Baugruppe mit autoklaviertem destilliertem Wasser zu beladen und Luft aus dem Schlauch zu entfernen. Setzen Sie dann den Kolben wieder in die Mikroliterspritze ein und drücken Sie den Kolben, bis nur noch zwei Mikroliter destilliertes Wasser im Zylinder verbleiben und nicht weniger. Montieren Sie anschließend die Mikroliterspritze vorsichtig auf die Microflow-Spritzenpumpe.

Pipettieren Sie dann kleine Mengen des gefilterten 0,1%Fast Green Farbstoffs in den experimentellen Virusflüssigkeiten auf ein Stück Parafilm. Saugen Sie nun eine kleine Menge Luft in die Spritze ein, bis eine Luftblase zwischen der Injektionsnadel und dem Schlauch sichtbar ist. Laden Sie dann 0,7 Mikroliter gefilterte Fast Green-Lösung, um den Flüssigkeitsfluss in den Mikroinjektionsschlauch zu testen.

Wenn die Strömung gut ist, saugen Sie ein weiteres kleines Luftvolumen an, um eine zweite Luftblase zu erzeugen, und laden Sie anschließend die Injektionslösung in den Mikroinjektionsschlauch. Befestigen und befestigen Sie die Mikroinjektionsnadel an der stereotaktischen Vorrichtung und fahren Sie mit der Mikroinjektion der neugeborenen Mäuse fort. Wischen Sie zur Vorbereitung der Operation das stereotaktische Instrument gründlich mit 70 % Ethanol ab und sterilisieren Sie die chirurgischen Instrumente mit 70 % Ethanol.

Betäuben Sie dann ein Neugeborenes durch Unterkühlung. Legen Sie den Welpen in einen Latexhandschuh und tauchen Sie ihn fünf Minuten lang bis zum Hals in zerstoßenes Eis. Kneifen Sie dann die Füße des Welpen mit einer Pinzette, um sicherzustellen, dass kein Pedalreflex auftritt.

Positionieren Sie als Nächstes den Welpen mit dem Handschuh in der Kopfschale und geben Sie etwas zerstoßenes Eis um die Latexhülle, um die Unterkühlungsanästhesie aufrechtzuerhalten. Schrubben Sie dann den Kopf des Welpen mit 70%igem Ethanol und lokalisieren Sie den Lambda-Orientierungspunkt. Markieren Sie es mit einem Marker.

Richten Sie dann die Nadelspitze auf das Lambda und setzen Sie die anterior/posterioren und medialen/lateralen Koordinaten auf Null. Ziehen Sie dann mit einem Gehirnatlas den Injektionsarm an die Zielstelle. Zum Beispiel beträgt das Striatum von P2-Welpen 2,4 Millimeter vor dem Lambda, 1,0 Millimeter zu beiden Seiten der Mittellinie und 1,7 Millimeter ventral.

Markieren Sie anschließend mit einem Stift die Position des Fast Green Farbstoffs auf der PE10-Tube. Beginnen Sie dann, die Nadel langsam durch die Haut und den Schädel zu dringen, bis die Nadelspitze die Oberfläche des Schädels berührt. Legen Sie die dorsale/ventrale Koordinate auf Null fest.

Senken Sie dann die Nadel langsam auf die Zielstelle ab. Warten Sie eine Minute, damit das Parenchym wieder in seine normale Form zurückkehrt. Führen Sie dann das Mikroinjektionsprogramm mit 100 Nanolitern pro Minute durch.

Beobachten Sie während der Injektion, wie sich der Fast Green Farbstoff in den PE-Schlauch bewegt. Es ist wichtig, die Nadel langsam durch die Haut und den Schädel zu dringen, bis die Nadelspitze die Oberfläche des Schädels berührt. Während der Injektion ist unbedingt zu beobachten, wie sich der Fast Green Farbstoff in den PE-Schlauch bewegt.

Warten Sie nach Beendigung der Injektion eine Minute und bringen Sie die Nadel dann langsam auf 1/2 der eingedrungenen DV-Tiefe nach oben. Warten Sie dann weitere 30 Sekunden, bevor Sie mit dem langsamen Zurückziehen der Nadel aus dem Kopf des Welpen fortfahren. Nach Abschluss der Injektion ist es wichtig, eine Minute zu warten, bevor die Nadel langsam auf 1/2 der eingedrungenen DV-Tiefe angehoben wird.

Warten Sie dann weitere 30 Sekunden, bevor Sie die Nadel langsam aus dem Kopf des Welpen ziehen. Nachdem alle Zielstellen injiziert wurden, wärmen Sie den Welpen 20 Minuten lang in einem 33 Grad Celsius heißen Inkubator auf. Kontrollieren Sie den Welpen alle fünf Minuten, bis er wieder sternal liegt.

Dann bringen Sie das Jungtier zu seinem Muttertier zurück. 200 Nanoliter Virus, die Cre-DNA-Rekombinase exprimieren, die mit GFP fusioniert ist, wurden in das P2-Striatum von Ai14-Mäusen injiziert. Diese Mäuse exprimierten das tdTomato-Reportergen nach Cre-vermittelter Deletion einer loxP-flankierten Stoppkassette

Die Gehirne wurden an P14 für die Immunfärbung von GFP und tdTomato entnommen. Viele AAV-transduzierte GFP-positive Zellen waren im gesamten Striatum vorhanden, was auf eine ausgedehnte Infektion der striatalen Zellen mit AAV-EGFP-Cre-Viren hinweist. Eine ähnlich umfangreiche Expression von tdTomato wurde auch im Striatum gefunden.

Bei der mikroskopischen Untersuchung bei hoher Vergrößerung wurde eindeutig festgestellt, dass alle GFP-positiven striatalen Zellen das tdTomato-Reportergen mitexprimieren. Darüber hinaus wurden tdTomato-Signale in vermutlich Axonendigungen im Globus pallidus, in der Substantia nigra pars reticulata, den Zielregionen der striatonigralen und striatopallidalen Projektionsneuronen, nachgewiesen. Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse auf eine erfolgreiche Cre loxP-vermittelte DNA-Rekombination hin, die durch die AAV-vermittelte Expression der Cre-Aktivität in neonatalen striatalen Neuronen induziert wurde.

Sobald diese Technik gemeistert ist, kann sie in 30 Minuten für eine bilaterale striatale Injektion durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass es sich um eine heikle Gehirnoperation für Neugeborene handelt, die Geduld und Sorgfalt erfordert. Von diesem Verfahren aus können weitere Methoden wie Optogenetik und Chemogenetik durchgeführt werden, um die Reifung während der postnatalen Entwicklung zu analysieren.