Isolieren von Lymphozyten aus der Maus kleinen intestinalen Immunsystems

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist die Isolierung von Lymphozyten aus induktiven Stellen des Darms, einschließlich Peyer-Pflastern und mesenterialen Lymphknoten, sowie Effektorstellen wie Lamina propria und Epithel. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Schleimhautimmunologie zu beantworten, wie z. B. das Verständnis der Immunantworten auf Magen-Darm-Infektionen, Krebs und entzündliche Erkrankungen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Isolierung hochreiner und lebensfähiger Lymphozyten aus verschiedenen Kompartimenten des Dünndarms mit minimaler kompartimentübergreifender Kontamination gewährleistet.

Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da es schwierig ist, Mesenterienlymphknoten und Peyer-Pflaster zu identifizieren und zu isolieren und Geschwindigkeit und Präzision für eine optimale Ausbeute in Einklang zu bringen. Um das Protokoll zu starten, legen Sie eine zuvor betäubte Maus auf den Rücken und besprühen Sie sie mit 70%igem Ethanol. Verwenden Sie eine Schere, um einen Mittellinienschnitt zu machen, und öffnen Sie die Haut und die Bauchdecke, um die Bauchhöhle freizulegen.

Lokalisieren Sie als Nächstes den Blinddarm und ziehen Sie den Blinddarm mit einer Pinzette vorsichtig nach unten. Bewegen Sie den Dünndarm vorsichtig mit einer Pinzette nach rechts, wodurch die gesamte mesenteriale Lymphknoten- oder MLN-Kette, die mit dem Dickdarm ausgerichtet ist, freigelegt wird. Identifizieren Sie den unteren Knoten in der Kette, der dem Blindmals am nächsten liegt.

Verwenden Sie eine Pinzette, um das Mesenterialfett um sich herum zu greifen, und bewegen Sie die MLN-Kette vorsichtig von unten nach oben, indem Sie das Fett um den Lymphknoten herum mit einer anderen Pinzette zupfen. Befeuchte dann ein Handtuch mit Erntemedium und lege die MLN-Kette auf das Papiertuch. Entfernen Sie das Mesenterialfett, indem Sie die Kette auf das Papiertuch rollen und das Fett mit zwei Pinzetten abziehen.

Legen Sie das MLN für spätere Isolationsschritte in ein kaltes Erntemedium. Schneiden Sie mit einer Schere den Dünndarm unterhalb des Pylorusschließmuskels und oberhalb des Blinddarms auf. Ziehen Sie den Darm mit einer Pinzette langsam vom Ileum zum Zwölffingerdarm heraus, während Sie das anhaftende Mesenterialfett mit einer anderen Pinzette entfernen.

Lege den Darm auf ein mit Erntemedium angefeuchtetes Papiertuch und tosse das restliche Mesenterialfett mit zwei Pinzetten ab. Halten Sie den Darm während dieser Schritte feucht, indem Sie regelmäßig Erntemittel auftragen. Sammeln Sie Peyer-Pflaster, indem Sie sie mit einer gebogenen Schere aus dem Darm entfernen.

Entnehmen Sie 5-11 Peyer-Pflaster aus dem Dünndarm. Legen Sie die Peyer-Pflaster für spätere Isolationsschritte in kaltes Erntemedium. Verwenden Sie die flache Seite der Pinzette und gleiten Sie vorsichtig vom Zwölffingerdarm in Richtung Ileum, um Stuhlinhalt und Schleim auszustoßen.

Wiederhole diesen Schritt einmal, um den größten Teil des Schleims zu entfernen. Verwenden Sie eine feine Schere mit einem stumpfen Ende an einer Spitze, führen Sie das stumpfe Ende in den Darm ein und schneiden Sie den Darm in Längsrichtung vom Zwölffingerdarm bis zum Ileum auf. Schneiden Sie den geöffneten Darm seitlich in zwei Zentimeter große Stücke.

Legen Sie die Darmstücke in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen mit 25 Millilitern kaltem Erntemedium für spätere Isolierungsschritte. Isolieren Sie Lymphozyten aus dem MLN, indem Sie sie vorsichtig durch ein 70-Mikrometer-Zellsieb mit dem Kolben einer Drei-Milliliter-Spritze dissoziieren. Waschen Sie das Zellsieb mit fünf Millilitern kaltem Erntemedium.

Pelletieren Sie die MLN-Zellen, indem Sie sie fünf Minuten lang bei 400-facher Schwerkraft bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Anschließend resuspendieren Sie das Zellpellet in einem Milliliter kaltem Erntemedium. Waschen Sie die Dünndarmstücke dreimal mit 25 Millilitern kaltem Erntemedium, indem Sie den Schlauch 10 Mal umdrehen.

Lassen Sie die Darmstücke sich absetzen und gießen Sie den Überstand ab. Geben Sie dann 20 Milliliter vorgewärmtes Dithioerythrit oder DTE-Lösung in das 50 Milliliter konische Röhrchen mit den Darmstücken und geben Sie den Inhalt mit einem Rührstab in einen 50 Milliliter silikonisierten Erlenmeyerkolben. Verwenden Sie einen großen Magneten an der Außenseite des Kolbens, um den Rührstab zu halten und das Gewebe und die Lösung zurück in das konische 50-Milliliter-Röhrchen zu übertragen.

Wirbeln Sie dann die Röhre 10 Sekunden lang auf der maximalen Stufe. Übertragen Sie den Überstand durch ein 70-Mikrometer-Zellsieb in ein neues konisches 50-Milliliter-Röhrchen, wobei darauf zu achten ist, dass die Gewebestücke im ursprünglichen Röhrchen bleiben. Pelletieren Sie die Zellen.

Das Zellpellet in 10 Milliliter kaltem Erntemedium resuspendieren und auf Eis lagern. 20 Milliliter vorgewärmte DTE-Lösung werden in das konische 50-Milliliter-Röhrchen mit den Darmstücken gegeben und wieder in den silikonisierten 50-Milliliter-Erlenmeyerkolben mit einem Rührstab überführt. Verwenden Sie einen großen Magneten an der Außenseite des Kolbens, um den Rührstab zu halten und das Gewebe und die Lösung zurück in das konische 50-Milliliter-Röhrchen zu übertragen.

Wirbeln Sie die Röhre 10 Sekunden lang auf der maximalen Einstellung. Der Überstand wird durch ein 70-Mikrometer-Zellsieb in das Röhrchen mit den Zellen aus dem Überstand der ersten DTE-Behandlung überführt und die Zellen zentrifugiert. Resuspendieren Sie das Zellpellet in acht Millilitern 44%iger Density Gradient oder DG-Lösung bei Raumtemperatur.

Übertragen Sie die acht Milliliter große 44%ige DG-Lösung und die Zellsuspension in ein 17 Millimeter x 100 Millimeter großes 14-Milliliter-Polypropylen-Rundbodenröhrchen. Unterlegen Sie die Zellen mit fünf Millilitern RT 67%iger DG-Lösung. Zentrifugieren Sie 25 Minuten lang bei 1.600-facher Schwerkraft bei RT, ohne die Bremse zu betätigen.

Lebensfähige Zellen bilden einen Buffy-Mantel an der Grenzfläche zwischen 44 % und 67 %. Entfernen Sie die Fettschicht auf der Oberseite durch Vakuumaspiration. Verwenden Sie eine Pasteur-Pipette, um den Buffy Coat an der Grenzfläche zu ernten, und geben Sie ihn in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen mit 40 Millilitern Kalterntemedium.

Pelletzellen werden durch Zentrifugieren bei 400-facher Schwerkraft für fünf Minuten bei vier Grad Celsius hergestellt und das Zellpellet in einem Milliliter kaltem Erntemedium resuspendiert. Entfernen Sie Epithelzellen aus Darmgewebestücken, indem Sie 25 Milliliter vorgewärmte EDTA-Lösung zu den restlichen Darmstücken geben und den Inhalt mit einem Rührstab in einen 50 Milliliter silikonisierten Erlenmeyerkolben geben und umrühren. Halten Sie den Rührstab fest und entsorgen Sie den Überstand vorsichtig, während Sie die Darmstücke im Kolben aufbewahren.

Wiederholen Sie den Schritt zur Entfernung von Epithelzellen noch einmal. Als nächstes gibst Du 50 Milliliter Erntemedium bei Raumtemperatur hinzu und rührst den Inhalt kurz mit einem Magneten um. Lassen Sie dann die Darmstücke absetzen und entsorgen Sie den Überstand vorsichtig.

Fügen Sie 30 Milliliter vorgewärmte Kollagenaselösung hinzu und rühren Sie die Darmstücke um. Nach dem Rühren werden das verdaute Gewebe und der Überstand durch ein 70-Mikrometer-Zellsieb in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen überführt. Dissoziieren Sie die restlichen Gewebestücke vorsichtig, indem Sie den Filter mit dem Kolben einer Drei-Milliliter-Spritze durchdrücken.

Waschen Sie den Filter mit 10 Millilitern kaltem Erntemedium und pelletieren Sie die Zellen. Nach dem Schleudern resuspendieren Sie das Zellpellet in acht Millilitern Lösung mit 44 % DG bei Umgebungstemperatur. Übertragen Sie die acht Milliliter der 44%igen DG-Lösungszellensuspension in ein frisches 70 Millimeter x 100 Millimeter großes Polypropylen-Rundbodenröhrchen.

Unterlegen Sie die Probe mit fünf Millilitern Lösung bei Umgebungstemperatur 67 % DG und zentrifugieren Sie dann die Gradienten. Entfernen Sie die Fettschicht auf der Oberseite durch Vakuumaspiration. Verwenden Sie eine Pasteur-Pipette, um den Buffy Coat an der Grenzfläche zu ernten, und geben Sie ihn in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen mit 40 Millilitern Kalterntemedium.

Zum Schluss resuspendieren Sie das Zellpellet in einem Milliliter kaltem Erntemedium. Jedes intestinale Immunkompartiment zeichnet sich durch eine einzigartige Zusammensetzung von Lymphozyten-Untergruppen aus. Das MLN besteht überwiegend aus Alpha-Beta-T-Zellen, während PP-Lymphozyten hauptsächlich B-Zellen sind.

Die Zusammensetzung der LP-Lymphozyten besteht hauptsächlich aus Alpha-Beta-T-Zellen und B-Zellen. IEL sind hauptsächlich Gamma-Delta-T-Zellen und Alpha-Beta-T-Zellen, die im Wesentlichen keine B-Zellen enthalten. CD8-alpha-positive alpha-beta-T-Zellen innerhalb der LP- und IEL-Kompartimente exprimierten das CD8-alpha-Homodimer oder das CD8-alpha-beta-Heterodimer, während CD8-alpha-positive alpha-beta-T-Zellen an der induktiven Stelle überwiegend das CD8-alpha-beta-Beta-Heterodimer exprimierten.

Die Mehrheit der Gamma-Delta-T-Zellen im IEL-Kompartiment exprimierte CD8 alpha, während Gamma-delta-T-Zellen, die im MLN gefunden wurden, CD8 alpha fehlt. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, genügend Zeit und Sorgfalt für die Schritte der Gewebeisolierung aufzuwenden, um die Kontamination zwischen den Darmkompartimenten zu begrenzen. Nach diesem Verfahren können isolierte Lymphozyten einer Ex-vivo-Stimulation, Durchflusszytometrie und anderen Techniken zur weiteren phänotypischen und funktionellen Analyse unterzogen werden.