Name: Isolation und In-vitro- Kultur von murinen und menschlichen alveoläre Makrophagen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Lernen Sie die Isolation und In-vitro-Kultur von murinen und menschlichen alveolären Makrophagen aus Lungen und bronchoalveolärer Lavageflüssigkeit. Diese Methode ermöglicht hochreine Zellpopulationen für die pulmonale Immunforschung.

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Wir danken für die Unterstützung bei der Bearbeitung des Manuskripts Clare Prendergast. Sicherheitsanweisungen wird unterstützt durch eine Forschung gewähren (#2095) von der Stiftung Flinn und TM wird unterstützt durch Zuschüsse aus dem National Institutes of Health (R01HL056643 und R01HL092514). Sicherheitsanweisungen der Methoden entwickelt, die Studie konzipiert und schrieb das Manuskript; OM mit Tierversuchen und klinischen Probe Beschaffung unterstützt; SB mit durchflusszytometrischen Analyse und Zellsortierung unterstützt; TM die Studien überwacht und überprüft das Manuskript.

Alle hier beschriebene Methoden wurden von den institutionellen Animal Care und Verwendung Committee (IACUC) und die institutionelle Review Board (IRB) am St.-Josephs Hospital und Medical Center genehmigt.
1. Isolierung des AMs aus murinen alvéolaire Lavage (BAL) Flüssigkeit
<ol><li>Betäuben Sie eine acht Wochen alten C57BL/6-Maus mit Ketamin (87,5 mg/kg Körpergewicht) und Xylazin (12,5 mg/kg Körpergewicht) über eine intraperitoneale Injektion cocktail. Gehen Sie bei Maus chirurgische Anästhesie mit Verlust von Reflexen und Entspannung der Muskulatur erreicht.</li>
	<li>Platzieren Sie den Mauszeiger auf eine Dissektion-Oberfläche, mit der Bauchseite nach oben. Tragen Sie Augenheilkunde Tierarzt Salbe auf Augen zu verhindern Austrocknung und wischen die gesamte ventrale Oberfläche der Maus mit sterilen Prep Alkoholtupfer gesättigt mit 70 % Isopropanol zu desinfizieren.</li>
	<li>Montieren Sie die Maus mit allen vier Beinen zurückgehalten.</li>
	<li>Öffnen Sie sanft die Bauchhöhle mit Mikro Dissektion Werkzeuge. Vorsicht ist geboten, um so viel Raum wie möglich zu öffnen, ohne irgendwelche viszeralen Organe beschädigen oder überhängenden Gewebe zu schaffen.</li>
	<li>Sanft öffnen der Brusthöhle durch Eingrabung langsam den Brustkorb durch das Mediastinum. Im Idealfall können den Brustkorb von Seite zur Seite herausgeschnitten werden. Extreme Vorsicht ist geboten, um nicht zu verletzen die Pleura der Lunge während des Öffnens der Brusthöhle.</li>
	<li>Suchen Sie die minderwertige Vena Cava und einen Einschnitt, die Maus zu bluten. Verwenden Sie Watte-Pads, um Blut aufzusaugen.</li>
	<li>Injizieren Sie 10 mL eiskaltes Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) in die Rechte Herzkammer (mit 10 mL Spritze und Nadel 25G) zum zirkulierenden Blutzellen zu spülen. Der Blutfluss mit Watte-Pads zu absorbieren. Einmal komplett durchblutet, die Lungen erscheint blanchiert und sind dann bereit für Lavage.</li>
	<li>Vorsichtig Aufschneiden der Haut und Muskel in den Hals, um die Atemwege zu entlarven. Verbrauchsteuern Sie sorgfältig die angrenzenden Muskeln, Knorpel und Fettgewebe ohne Beschädigung der Luftröhre.</li>
	<li>Machen Sie einen kleinen Schnitt (< 2 mm) auf die Luftröhre nach den Kehlkopf. Dieser Schnitt sollte gerade genug, um einen Katheter in einfügen, während die Luftröhre Kehlkopf noch angeschlossen ist. Legen Sie einen 1-Zoll-22G-Katheter ohne Nadel in die Luftröhre zur Lunge. Der Katheter mit einer Seide geflochtene Naht (4: 0; nicht absorbierbare) mit einem Kreuzknoten. Hinweis: Der Katheter muss getrimmt werden basierend auf der Größe der Maus. Extrem kurze oder lange Katheter tendenziell undicht und/oder reißen die Atemwege während Lavage. Katheter-Länge sollte so sein, dass bei vollständig eingesteckt bleibt die Spitze gut innerhalb der Luftröhre und erreichen nicht die primäre Bronchien.</li>
	<li>Befestigen Sie eine 1-mL-Spritze mit eiskalten BAL-Puffer (Ca2 + und Mg2 + kostenlose PBS + 1 mM Ethylenediaminetetraacetic Säure, EDTA) des Katheters gefüllt und vermitteln Sie langsam den Puffer in die Lunge zu. Dies wird die Lungen aufzublasen. Halten Sie die Spritze befestigt am Katheter für fünf Sekunden und Aspirieren Sie die Lavage-Flüssigkeit durch leichtes Ziehen des Kolbens. Dies wird Luft aus der Lunge. Sammeln Sie die Flüssigkeit in einem 15 mL konische Röhrchen auf Eis gelegt.</li>
	<li>Wiederholen Sie Schritt 1.10 für neun weitere Male und bündeln Sie die Lavage-Flüssigkeit. Überschreiten Sie 1 mL Puffer pro Spülung, nicht, da das Überschreiten der Lungenkapazität und zu seinen Bruch führen kann.</li>
	<li>Die Maus mit CO2 Überdosierung durch IACUC genehmigte Protokoll einschläfern.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die 10 mL BAL-Flüssigkeit bei 250 X g bei 4 ° C für 10 Minuten. Die Zelle Pellet enthält BAL Zellen. Vorsicht: Das Pellet kann sehr klein sein, also seien Sie vorsichtig, wenn den überstand absaugen.</li>
	<li>Aufschwemmen Sie BAL Zellen in 100 μL der Strömung/Sortierung Puffer (PBS + 2 % Hitze inaktiviert fetalen bovine Serum (FBS) + 1 mM EDTA + 25 mM N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulphonic Säure (HEPES)).</li>
	<li>Die unspezifische Antikörperbindung an Fc-Rezeptor zu blockieren, indem hinzufügen Maus Fc-Block (Klon 2.4G2, 10 μg/mL) und Inkubation für 20 Minuten auf Eis.</li>
	<li>Führen Sie Antikörper Färbung zusammen mit Fluoreszenz minus eins (FMO) und Single-Fleck steuert11,25. Bewerten die BAL Zellen eine Zelle Analyzer (siehe Tabelle der Materialien) gefolgt von einzelligen Flow Cytometry-Analyse von geeigneten Analysesoftware (siehe Tabelle der Materialien).</li>
	<li>AMs isolieren von einer Fluoreszenz-aktivierte Zelle Sorter (siehe Tabelle der Materialien) direkt in 1 mL Maus bin Kulturmedium beim AMs für Kultur in Vitro oder in Vivo bestimmt sind Zelle übertragen. Alternativ (siehe Tabelle der Materialien) ergänzt Art AMs in 1 mL Lyse-Puffer mit 10 μL/mL β-Mercaptoethanol für RNA-Extraktion.</li>
</ol>2. Isolierung des AMs von Maus-Lunge, Single-Zellsuspension
<ol><li>Betäuben Sie eine acht Wochen alten C57BL/6-Maus mit Ketamin (87,5 mg/kg Körpergewicht) und Xylazin (12,5 mg/kg Körpergewicht) über eine intraperitoneale Injektion cocktail. Gehen Sie bei Maus chirurgische Anästhesie mit Verlust von Reflexen und Entspannung der Muskulatur erreicht.</li>
	<li>Platzieren Sie den Mauszeiger auf eine Dissektion-Oberfläche, mit der Bauchseite nach oben. Tragen Sie Augenheilkunde Tierarzt Salbe auf Augen zu verhindern Austrocknung und wischen die gesamte ventrale Oberfläche der Maus mit sterilen Alkoholtupfer gesättigt mit 70 % Isopropanol zu desinfizieren.</li>
	<li>Montieren Sie die Maus mit allen vier Beinen zurückgehalten.</li>
	<li>Öffnen Sie sanft die Bauchhöhle mit Mikro Dissektion Werkzeuge. Vorsicht ist geboten, um so viel Raum wie möglich zu öffnen, ohne irgendwelche viszeralen Organe beschädigen oder überhängenden Gewebe zu schaffen.</li>
	<li>Sanft öffnen der Brusthöhle durch Eingrabung langsam den Brustkorb durch das Mediastinum. Im Idealfall können den Brustkorb von Seite zur Seite herausgeschnitten werden. Extreme Vorsicht ist geboten, um nicht zu verletzen die Pleura der Lunge während des Öffnens der Brusthöhle.</li>
	<li>Suchen Sie die minderwertige Vena Cava und einen Einschnitt, die Maus zu bluten. Verwenden Sie Watte-Pads, um Blut aufzusaugen.</li>
	<li>Injizieren Sie 10 mL eiskaltem PBS in den rechten Ventrikel (mit 10 mL Spritze und Nadel 25G), um die zirkulierenden Blutzellen zu spülen. Einmal komplett durchblutet, die Lungen erscheint blanchiert und sind bereit für die Ernte.</li>
	<li>Aus der Lunge durch Abtrennen der Luftröhre, Blutgefäße und Bänder in ein 15 mL konische Röhrchen mit 5 mL kaltes sezieren Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM). Erst im nächsten Schritt auf Eis halten.</li>
	<li>Die Maus mit CO2 Überdosierung durch IACUC genehmigte Protokoll einschläfern.</li>
	<li>Übertragen Sie der PERFUNDIERTEN Lunge in einer Kulturschale sterile und Pyrogenfreie kostenlos 60 mm mit 3 mL DMEM. Herauszuarbeiten Sie mit Hilfe der Zange sezieren, die Atemwege und andere harte Lungengewebe Material, falls vorhanden. Zerkleinere das Lungengewebe mit einem Skalpell zu < 1 mm Größe.</li>
	<li>Hinzufügen von 300 µg/mL Liberase TL und 5 U/mL DNase I, mischen, indem Sie pipettieren und 25 Minuten bei 37° C in einem Inkubator inkubieren. Mischen Sie vorsichtig einmal durch pipettieren nach 10 Minuten.</li>
	<li>Ein 100 µm Zelle Sieb auf eine 50 mL konische Rohr installiert durchlaufen Sie die dissoziierten Lungen. Verwenden Sie die Rückseite von einem Kolben von 1 mL Spritze, mash up Zelle Klumpen auf dem Filter. Waschen Sie den Filter mit 20 mL Waschpuffer (PBS + 2 % Hitze inaktivierten FBS + 2 mM EDTA).</li>
	<li>Zentrifugieren Sie bei 500 X g bei 4 ° C für 5 Minuten. Den überstand verwerfen und Aufschwemmen der Zelle-Pellets in 20 mL Waschpuffer.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 2.12 und 2.13 zweimal, Filter und Schlauch jedes Mal ändern. Pre-Einweichen des Filters in Waschpuffer für mehr als fünf Minuten erhöht die AM Ertrag. Bereiten Sie Einzel-Zellsuspension durch Zugabe von 100 μl Puffer, um die Zelle Pellet Fluss/Sortierung.</li>
	<li>Die unspezifische Antikörperbindung an den Fc-Rezeptor zu blockieren, indem hinzufügen Maus Fc-Block (Klon 2.4G2, 10 μg/mL) und Inkubation für 20 Minuten auf Eis.</li>
	<li>Führen Sie Antikörper Färbung sowie FMO und Single-Fleck Kontrollen11,25. Bewerten die Lunge Zellen eine Zelle Analyzer (siehe Tabelle der Materialien) gefolgt von einzelligen Durchflusszytometrie Analyse durch Analyse Software.</li>
	<li>Art-AMs durch einen Zelle Sorter (siehe Tabelle der Materialien) direkt in 1 mL Maus bin Kulturmedium beim AMs für Kultur in Vitro oder in Vivo bestimmt sind Zelle übertragen. Sortieren Sie alternativ AMs in 1 mL Lyse-Puffer mit 10 μL/mL β-Mercaptoethanol für RNA-Extraktion ergänzt.</li>
</ol>3. Isolierung des AMs aus menschlichen BAL-Flüssigkeit
<ol><li>Übertragung der menschlichen BAL-Flüssigkeit aus der Klinik an das Labor bei 4 ° c zu vereinbaren</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die BAL-Flüssigkeit (10-50 mL) bei 250 X g bei 4 ° C für 10 Minuten. Die Zelle Pellet enthält BAL Zellen11.</li>
	<li>Waschen Sie die Pellets mit 20 mL Waschpuffer (PBS + 2 % Hitze inaktivierten FBS + 2 mM EDTA) und Zentrifuge bei 250 X g bei 4 ° C für 10 Minuten.</li>
	<li>Aufschwemmen der BAL-Zellen in 100 μL sind der Strömung/Sortierung Puffer (PBS + 2 % Hitze inaktivierten FBS + 1 mM EDTA + 25 mM HEPES).</li>
	<li>Die unspezifische Antikörperbindung an den Fc-Rezeptor durch Hinzufügen von menschlichen Fc Block (Klon Fc1.3070, 25 μg/mL) und Inkubation für 20 Minuten auf dem Eis zu blockieren.</li>
	<li>Führen Sie Antikörper Färbung sowie FMO und Single-Fleck Kontrollen11,24. Bewerten die BAL Zellen eine Zelle Analyzer (siehe Tabelle der Materialien) gefolgt von einzelligen Durchflusszytometrie Analyse durch Analyse Software.</li>
	<li>Art-AMs durch einen Zelle Sorter (siehe Tabelle der Materialien) ergänzt direkt in 1 mL menschlichen AM Kulturmedium oder 1 mL Lyse-Puffer mit 10 μL/mL β-Mercaptoethanol.</li>
</ol>4. in-vitro- Kultur von AMs
<ol><li>Im Anschluss an die Zellsortierung Ernten der Zellen durch Zentrifugieren bei 250 X g bei 4 ° C für 10 Minuten.</li>
	<li>Aufschwemmen Sie menschliche AMs in 1 mL menschlichen AM Kulturmedium [Roswell Park Memorial Institute mittlerer (RPMI) 1640 ergänzt mit 10 % FBS, 20 % 929 Kultur überstand (als eine Quelle von Makrophagen-Kolonie-stimulierende Faktor (M-CSF), 100 U/mL Endkonzentration), 1 mM Natrium Pyruvat, 10 mM N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulphonic Säure (HEPES) und 1 X Penicillin/Streptomycin (optional)]. In ähnlicher Weise Aufschwemmen Sie Maus AMs in 1 mL Maus AM Kulturmedium [DMEM mit 10 % FBS, 20 % 929 Kultur überstand (als Quelle für M-CSF, 100 U/mL Endkonzentration), 1 mM Natrium Pyruvat, 10 mM HEPES und 1 X Penicillin/Streptomycin (optional ergänzt )].</li>
	<li>Aufzählen der Trypan blau-lebensfähige Zellen durch einen Zelle Zähler und passen Sie die tragfähige Zellkonzentration auf 1 x 106/mL. Hinweis: Im Idealfall kann bis zu 5 x 105 AMs isoliert von BAL-Flüssigkeit, die aus einer 8-10 Wochen alte C57BL/6 männliche Maus gesammelt werden. AM Ertrag aus dem Maus-Lunge-Digest kann ist variabel und etwas weniger als die der Maus BAL-Flüssigkeit. AM Ertrag aus menschlichen BAL-Flüssigkeit hängt vom Volumen der BAL-Flüssigkeit, das Gesamtvolumen der Saline in der Lavage und klinischen Zustand des Patienten verwendet.</li>
	<li>Basierend auf den Ertrag und die experimentelle Notwendigkeit, Samen der Zellen in Kammer Folien, Kultur-Gerichte oder Kulturflaschen. Im Idealfall Samen Sie das AMs auf 1 x 10-5-/mL mit 10 mL Medium in einem T25 Gewebekultur Kolben.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Zellen in einem befeuchteten Inkubator von 37 ° C mit 5 % CO2 Atmosphäre. Hinweis: AMs wird als adhärente Zellen wachsen und sind extrem langsamwüchsig (Verdopplungszeit > 7 Tage).</li>
	<li>24 Stunden nach Aussaat, AMs sollte sein Anhänger und wird nicht durch einen sanften Wechsel des Kulturmediums abgenommen werden. Entfernen Sie das Medium durch Absaugen von einem Ende und Auffüllen mit frischem Medium auf 37 ° c vorgewärmt Hinweis: Die Zellen können jetzt verwendet werden, AM Physiologie oder die Auswirkungen von Reizen zu beurteilen. AMs gewachsen in Kammer Folien können auch bequem mit entsprechenden Antikörpern gebeizt und sind ideal für mikroskopische Visualisierung. Für Flow durchflusszytometrischen Bewertung geerntet AMs durch Inkubation mit nicht-enzymatische Zelle abkoppelt Lösung.</li>
	<li>Das Kulturmedium abgesaugt und fügen Trennendem Lösung genug zur Abdeckung der Kultur (ca. 2 mL pro T25 Kolben) und ca. 5-10 Minuten bei 37 ° C inkubieren. Kein kratzen wird notwendig sein, und es wird nicht empfohlen, die Zellen mechanisch zu kratzen. Klopfen Sie leicht die Seiten, fügen Sie 1-2 mL Flow/Sortierung Puffer und pipette vorsichtig rauf und runter um die Mehrheit der adhärenten Zellen zu lösen.</li>
	<li>Für RNA-Studien lyse der Zellen in der Kulturschale direkt durch Zugabe von Lysis Puffer.</li>
</ol>

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<li>Kopf, M., Schneider, C., Nobs, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+and+function+of+lung-resident+macrophages+and+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells.</a> Nat Immunol. 16 (1), 36-44 (2015).</li>
<li>Eguiluz-Gracia, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+persistence+of+human+donor+alveolar+macrophages+in+lung+transplant+recipients%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Long-term persistence of human donor alveolar macrophages in lung transplant recipients.</a> Thorax. 71 (11), 1006-1011 (2016).</li>
<li>Yu, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+myeloid+cells+in+human+blood%2C+bronchoalveolar+lavage%2C+and+lung+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of myeloid cells in human blood, bronchoalveolar lavage, and lung tissues.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. , (2015).</li>
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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.

AMs sind langlebige Lunge ansässige Makrophagen, die die Lunge beginnt bei der Geburt und dauerhaft über die gesamte Lebensdauer26bevölkern. Ihre Rollen in pulmonalen Physiologie7 und Pathologie12 und ihr Potenzial zur pulmonalen Autoimmunität24 Vorhersagen wurden erkannt. Da AMs eine langfristige Präsenz in der Lunge11,27 haben und Aktivierung und Fortschreiten der Im...

Die Lunge Mikroumgebung ist ein einzigartig Komplexes Ökosystem mit einer aufwendigen Luftleitung und Gefäßsystem. Die eingeatmete Luft geht durch die Luftröhre und durch zahlreiche Zweige der Bronchien und Bronchiolen vor Erreichen der Alveolen, wo die Blut-Luft-Gasaustausch auftritt. Durch direkte Interaktion mit der Atmosphäre erfordert die respiratorische Oberfläche Schutz vor potenziell schädlichen Auswirkungen von luftgetragenen Partikeln und Schadstoffen. Eine Reihe von physikalischen, chemischen und immunologischen Barrieren schützen die Lungen. Bereitstellung von Phagozyten an der respiratorischen Oberfläche dient vor allem eine wichtige Erstlinien Abwehrsystem. Alveoläre Makrophagen (AMs) sind eine Art von Lungenkrebs-Resident Phagozyten, und sie bilden die überwiegende Mehrheit der Lunge Makrophagen Pool. Wie ihr Name schon sagt, AMs sind in erster Linie auf das alveoläre Lumen lokalisiert und treten als festsitzende Zellen, die ständig der Umgebungsatmosphäre zu probieren und die Kommunikation mit der alveoläre Epithel1. Im Steady-State Lunge sind mehr als 95 % der Phagozyten im alveolären Bereich AMs2, deren Zusammensetzung aufgrund von Entzündungen, Infektionen oder chronische Exposition gegenüber Schadstoffen verändern kann.
AMs beteiligen sich eine Vielzahl von Funktionen, die möglicherweise lokal auf die Lunge und/oder systemrelevant. AMs sind beispielsweise wichtig bei der Entwicklung und die optimale Funktion der Lunge; immunüberwachung; und Freigabe der zelltrümmer, eindringende Krankheitserreger und inhalierten Partikel3,4,5,6,7. Gezielte Dezimierung der AMs ist bekannt, Räumung von respiratorischen Viren und Bakterien4,8beeinträchtigen. Neben ihrer Rolle als Phagozyten und eine Erstlinien Verteidiger der pulmonalen Homöostase, AMs sind dafür bekannt, funktionieren wie Antigen-präsentierenden Zellen in entlocken T Zell-Immunität9, die Wirksamkeit der intranasale Impfstoff10 potenzierende und Beeinflussung der Lunge eingeschränkt Autoimmunität nach Lung Transplantation11,12. Mangel AM Funktion ist verbunden worden, um pulmonale alveoläre Proteinosis (PAP), eine Bedingung, die durch eine genetische Mutation, Bösartigkeit oder Infektion, die Clearance von pulmonalen Tenside13,14beeinträchtigt. Transplantation von AMs wird jetzt als einen therapeutischen Ansatz zur Behandlung von PAP- 15,16geprüft.
AMs sind bekannt in der Embryogenese stammen und in den Lungen lebenslang beibehalten, ohne durch zirkulierenden Leukozyten2,17ersetzt. Obwohl AM Umsatz in homöostatische Lunge nicht nachweisbar ist, sind unterschiedlicher AM Umsatz in bestimmten klinischen Bedingungen, einschließlich Infektion berichtet worden, durch das Influenza-Virus4, Bolusinjektion Bestrahlung18, Einwirkung von endotoxin 19und Alter20. AMs werden geglaubt, um über eine minderwertige Verbreitung17,21selbst zu erneuern, aber einige neuen Studien behaupten, dass Monozyten können Anlass zu einer Bevölkerung von intravaskulären Lunge Makrophagen22,23 unter experimentelle Bedingungen, aber Funktionalität diese neu konvertierte pulmonaler Makrophagen haben noch bei Lungenkrankheiten definiert werden. Darüber hinaus ist die verstehen der Schwellenwerts des Reizes im Zusammenhang mit der Aktivierung AM eine potenziell interessante Gegend, wie die Lunge ein Gleichgewicht zwischen den entzündlichen Signalen und immunregulatorische Maschinen zu bewahren versucht.
Die physiologischen oder pathologischen Veränderungen, die zu Verlust der Immunregulation sind wichtig, in verschiedenen klinischen Einstellungen (z. B. Infektionen der Atemwege, entzündliche Lungenerkrankungen und fibrotische Lungenerkrankung) zu bewerten. AMs werden allerdings zunehmend als Indikatoren oder sogar Determinanten der pulmonalen Gesundheit11,24anerkannt. Derzeit gibt es keine einheitliche Protokolle zur Ernte, Charakterisierung und/oder Aufrechterhaltung AMs aus Mensch und präklinischen murinen Modellen. Mangel an Konsens über AM Ausgangsstoffe und Phänotypen und fehlender eine detaillierte Methode das Haupthindernis in Entzifferung Rolle(n) AM pulmonalen Gesundheit und Krankheit gewesen. Das folgende Protokoll bietet ein endgültiges Identifikations-, isoliert und in-vitro- Kultur-Strategie, die stark AM gezielte diagnostische und therapeutische Studien erleichtern und das Verständnis der AM Verhalten wird.

<table><tbody><tr><td>Nicht-enzymatische zelldissoziierende Lösung</td><td>Millipore-Sigma</td><td>C5789</td><td></td></tr><tr><td>Puralube Vet Salbe</td><td>Dechra</td><td>620300</td><td></td></tr><tr><td>22G Katheter&nbsp;</td><td>Terumo Medical Products</td><td>SR-OX2225CA</td><td></td></tr><tr><td>4-0 Nicht resorbierbares geflochtenes Seidennaht&nbsp;</td><td>Kent Scientific</td><td>SUT-15-2</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s phosphatgepufferte Kochsalzlösung&nbsp;</td><td>Corning</td><td>21-031-CM</td><td></td></tr><tr><td>Maus Fc-Block&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>Lysepuffer (PureLink RNA Kit)</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>12183018A</td><td></td></tr><tr><td>b-Mercaptoethanol&nbsp;</td><td>Millipore-Sigma</td><td>M6250&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FACSAria II Zellsortierer&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>644832</td><td></td></tr><tr><td>Ketamin&nbsp; (Ketathesia)</td><td>Henry Schein</td><td>56344</td><td></td></tr><tr><td>Xylazin &nbsp; (AnaSed)</td><td>Akorn</td><td>139-236</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Corning</td><td>10-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-017-CM</td><td></td></tr><tr><td>Liberase TL&nbsp;</td><td>Millipore-Sigma</td><td>5401020001</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Millipore-Sigma</td><td>AMPD1-1KT</td><td></td></tr><tr><td>100&mu; M-Zell-Sieb&nbsp;</td><td>Corning</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Künstlicher Fc-Block</td><td>BD Biosciences</td><td>564220</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Corning</td><td>46-034-CI</td><td></td></tr><tr><td>Countess II Automatisierter Zellzähler</td><td>Thermo Fisher Scientsp;</td><td></td><td></td>AMQAX1000</tr><tr><td>Trypan Blue Solution</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>15250061</tr><tr><td>HEPES</td><td>Corning</td><td>25-060-CI</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150H</td><td></td></tr><tr><td>L-929 Zelllinie</td><td>American Type Culture Collection</td><td>ATCC,&nbsp; CCL-1</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin&nbsp;</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyruvat</td><td>Corning</td><td>25-000-CI</td><td></td></tr><tr><td>T25 Gewebekulturflasche</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>156367</tr><tr><td>60 mm Kulturschale</td><td>Millipore-Sigma</td><td>CLS3261</td><td></td></tr><tr><td>15 mL konisches Röhrchen&nbsp;</td><td>Corning</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>50 mL konisches Röhrchen&nbsp;</td><td>Corning</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>LSRFortessa Zellanalysator</td><td>BD Biosciences</td><td>657669</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>FlowJo</td><td>v10.4</td><td>Analysesoftware</td></tr><tr><td>Anti-CD45 (Maus)</td><td>Biolegend</td><td>147709</td><td>Klon I3/2.3, FITC-konjugiert</td></tr><tr><td>Anti-CD11b (Maus)</td><td>Biolegend</td><td>101228</td><td>Klon M1/70, PerCP/Cy5.5 konjugiert</td></tr><tr><td>Anti-CD11c (Maus)</td><td>BD Biosciences</td><td>565452</td><td>Klon N418, BV 421 konjugiertes</td></tr><tr><td>Anti-I-Ab (Maus)</td><td>Biolegend</td><td>116420</td><td>Klon AF6-120.1, PE/Cy7 konjugiertes</td></tr><tr><td>Anti-Siglec-F (Maus)</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>562757 Klon E50-2440, PE-CF594 konjugiertes</td></tr><tr><td>Anti-Siglec-H (Maus)</td><td>Biolegend</td><td>129605</td><td>Klon 551, PE-konjugiertes</td></tr><tr><td>Anti-F4/80 (Maus)</td><td>Biolegend</td><td>123118</td><td>Klon BM8, APC/Cy7 konjugiertes</td></tr><tr><td>Anti-Ly-6C (Maus)</td><td>Biolegend</td><td>128035</td><td>Klon HK1.4, BV605 konjugiertes</td></tr><tr><td>Anti-CD64 (Maus)</td><td>Biolegend</td><td>139311</td><td>Klon X54-5/7.1, BV711 konjugiertes</td></tr><tr><td>Anti-CD24 (Maus)</td><td>BD Biosciences</td><td>563115</td><td>Klon M1/69, BV510 konjugiertes</td></tr><tr><td>Anti-CD103 (Maus)</td><td>BD Biosciences</td><td>745305</td><td>Klon OX-62, BV650 konjugiert</td></tr><tr><td>Anti-CD317 (Maus)</td><td>Biolegend</td><td>127015</td><td>Klon 927, APC konjugiert</td></tr><tr><td>Anti-CXCR1 (Maus)</td><td>Biolegend</td><td>149029</td><td>Klon SA011F11, BV785 konjugiert</td></tr><tr><td>Anti-CD45 (Mensch)</td><td>Biolegend</td><td>304017</td><td>Klon HI30, AF488 konjugiert</td></tr><tr><td>Anti-CD11b (Mensch)</td><td>Biolegend</td><td>101216</td><td>Klon M1/70, PE/Cy7 konjugiert</td></tr><tr><td>Anti-HLA-DR (Mensch)</td><td>Biolegend</td><td>307618</td><td>Klon L243, APC/Cy7 konjugiert</td></tr><tr><td>Anti-CD169 (Mensch)</td><td>Biolegend</td><td>346008</td><td>Klon 7-239, APC konjugiert</td></tr><tr><td>Anti-CD206 (Mensch)</td><td>Biolegend</td><td>321106</td><td>Klon 15-2, PE konjugiert</td></tr><tr><td>Anti-CD163 (Mensch)</td><td>Biolegend</td><td>333612</td><td>Klon GHI/61, BV421 konjugiert</td></tr></tbody></table>

isolation und in-vitro- kultur von murinen und menschlichen alveoläre makrophagen

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveoläre Makrophagen sind unheilbar differenzierte, Lunge-Bewohner Makrophagen pränatalen Ursprungs. Alveoläre Makrophagen sind einzigartig in ihrem langen Leben und ihre wichtige Rolle bei der Lungenentwicklung und Funktion sowie ihre Lunge lokalisiert Reaktionen auf Infektionen und Entzündungen. Bisher existiert kein einheitliches Verfahren für die Identifizierung, Isolierung und Handhabung der alveolären Makrophagen von Menschen und Mäusen. Diese Methode ist für Studien über diese wichtigeren angeborenen immunen Zellen in verschiedene experimentelle Einstellungen erforderlich. Die hier beschriebene Methode, die leicht von jedem Labor übernommen werden können, ist ein vereinfachter Ansatz Ernte alveoläre Makrophagen aus alvéolaire Lavage Fluid oder von Lungengewebe und pflegen sie in Vitro. Da alveoläre Makrophagen in erster Linie als adhärente Zellen in den Alveolen auftreten, liegt der Schwerpunkt dieser Methode auf verdrängen sie vor der Ernte und Identifikation. Die Lunge ist ein stark vaskularisierte Organ, und verschiedene Zelltypen myeloischen und lymphatischen Ursprungs bewohnen, interagieren und durch die Lunge Mikroumgebung beeinflusst werden. Mit dem Satz von oberflächenmarker beschrieben hier, können Forscher leicht und eindeutig andere Leukozyten alveoläre Makrophagen unterscheiden und für downstream-Anwendungen reinigen. Die Kultur-Methode entwickelt hierin unterstützt sowohl menschlich als auch Maus alveoläre Makrophagen für in-vitro- Wachstum und ist kompatibel mit zellulären und molekularen Studien.

Der Fluss durchflusszytometrischen Ansatz, Maus AMs zu identifizieren ist in Abbildung 1dargestellt. Dazu gehört die Analyse der einen minimalen Satz von oberflächenmarker notwendig in AMs von anderen Lunge-Resident oder Lunge infiltrieren Fresszellen zu unterscheiden. Differenzialanalyse muss eindeutig identifizieren AMs aus interstitielle Makrophagen, Dendritische Zellen, Neutrophilen, Monozyten und Monocyte abgeleitet pulmonaler Makrophagen, die in der Lun...

Diese Mitteilung beschreibt Methoden zur Isolierung und Kultur der alveolären Makrophagen aus Menschen und murinen Modellen zu Versuchszwecken.

Isolation und In-vitro- Kultur von murinen und menschlichen alveoläre Makrophagen

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, alveoläre Makrophagen von Menschen und Mäusen aus der Lunge und der bronchoalveolären Lavageflüssigkeit zu isolieren und die Methode für ihre in vitro Kultur zu entwickeln. Diese Methode kann helfen, einige Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Pulmonoimmunologie zu beantworten, wie z.B. die Rolle von Alveolarmakrophagen bei Atemwegsinfektionen, Entzündungen und Autoimmunität. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, die Alveolarmakrophagen von den anderen Lungenleukozyten unterscheiden zu können und eine Population von hochgereinigten Alveolarmakrophagen für experimentelle Zwecke zu erhalten.Platzieren Sie eine betäubte Maus mit der Bauchseite nach oben auf einer Präparierfläche. Tragen Sie ophthalmic vet Salbe auf die Augen auf, um Austrocknung zu verhindern. Wischen Sie die gesamte Bauchoberfläche der Maus zur Desinfektion mit sterilen Alkoholvorbereitungspads ab, die mit 70 % Isopropanol getränkt sind.Montieren Sie die Maus mit allen vier Beinen. Öffnen Sie die Bauchhöhle vorsichtig mit Mikrodissektionswerkzeugen. Es muss darauf geachtet werden, dass so viel Fläche wie möglich geöffnet wird, ohne die viszeralen Organe zu besch

isolation-vitro-culture-murine-human-alveolar

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Hier beschreiben wir Protokolle zum Ernten von murinen Alveolarmakrophagen, die ihren Sitz angeborenen Immunsystems Zellen in der Lunge und Prüfung ihrer Aktivierung in Reaktion auf Co-Kultur mit Polyanhydrid Nanopartikel.

Ernte Murine Alveolarmakrophagen und Auswerten zelluläre Aktivierung von Polyanhydrid Nanopartikel Induced

Wir stellen ein einfaches und effizientes Protokoll für die Herstellung von menschlichen Makrophagen. Buffy Coats werden durch Doppel Dichtegradientenzentrifugation isoliert verarbeitet und Monozyten werden dann an Makrophagen in Teflon-beschichtete Zellkulturbeutel differenziert. Dies maximiert Makrophagen-Renditen und erleichtert die Zellernte für nachfolgende Experimente.

Isolierung humaner Monozyten durch Doppel-Zentrifugation und ihre Differenzierung zu Makrophagen in Teflon-beschichteten Zellkultur-Taschen

Ein Verfahren, um die Fähigkeit der isolierten Maus-Alveolarmakrophagen, um das Wachstum von phagozytierten Aspergillus-Sporen durch konfokale Mikroskopie Steuerung auszuwerten.

Beurteilung der Anti-Pilz-Aktivität von isolierten Alveolarmakrophagen durch konfokale Mikroskopie

Wir beschreiben hier ein einfaches Protokoll zur Isolierung von Maus-Peritonealmakrophagen. Diesem Verfahren folgt eine RNA-Extraktion, um eine Genexpressionsanalyse bei der Stimulation von Toll-like-Rezeptoren durchzuführen.

Isolierung von Murine Peritonealmakrophagen zur Durchführung Genexpressionsanalyse Nach Toll-like Rezeptoren Stimulation

Knochenmarkzellen, die mit dem Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (GM-CSF) kultiviert wurden, erzeugen eine heterogene Kultur, die Makrophagen und dendritische Zellen (DCs) enthält. Diese Methode konzentriert sich auf die Verwendung von MHCII- und Hyaluronan (HA)-Bindung zur Unterscheidung von Makrophagen von den DCs in der GM-CSF-Kultur. Makrophagen in dieser Kultur haben viele Ähnlichkeiten mit Alveolarmakrophagen.

Erzeugung und Identifizierung von GM-CSF Abgeleitet Alveolare ähnlichen Makrophagen und dendritische Zellen aus Knochenmark der Maus

Es wird ein Protokoll für die Zellkultur von Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (M-CSF) differenzierten menschlichen Monozyten-abgeleiteten Makrophagen vorgestellt. Das Protokoll nutzt die Kryokonservierung von Monozyten in Verbindung mit ihrer Massendifferenzierung in Makrophagen. Dann können geerntete Makrophagen in Kulturvertiefungen mit den erforderlichen Zelldichten für die Durchführung von Experimenten ausgesät werden.

Kultur von M-CSF Differentiated Menschliche Monozyten abgeleiteten Makrophagen

Hier berichten wir über gemeinsame Methoden für die Analyse der phagocytic Funktion der murinen alveolären Makrophagen und bakterielle Freiraum aus der Lunge. Diese Methoden studieren in-vitro-Phagozytose von Fluorescein Herstellung Perlen und in-vivo Phagozytose von Pseudomonas Aeruginosa Green Fluorescent Protein. Wir beschreiben auch eine Methode für das clearing von p. Aeruginosa bei Mäusen.

Alveolären Makrophagen Phagozytose und Bakterien-Clearance bei Mäusen

Wir beschreiben eine Methode zur Verarbeitung von bronchoalveolarer Spülflüssigkeit und abgestimmtem peripherem Blut von chronisch HIV-infizierten Personen auf antiretrovirale Therapie zur Beurteilung von lungenen HIV-Reservoirs. Diese Methoden führen zum Erwerb von hochreinen CD4-T-Zellen und Alveolar-Makrophagen, die anschließend zur Immunphenotypisierung und HIV-DNA/RNA-Quantifizierungen durch ultraempfindliche Polymerase-Kettenreaktion eingesetzt werden können.

Verarbeitung von Bronchoalveolar Lavage Fluid und Matched Blood für Alveolar Macrophage und CD4+ T-Zell Immunophenotypisierung und HIV Reservoir Assessment

Hier wird ein optimiertes Protokoll zur Isolierung, Kultivierung, Transfekung und Unterscheidung menschlicher Primärmonozyten von HIV-infizierten Personen und gesunden Kontrollen vorgestellt.

Isolation, Transfektion und Kultur der primären menschlichen Monozyten

Präsentiert wird hier ein Protokoll zur primären monozyten Isolation des menschlichen Blutes sowie deren Differenzierung in Makrophagen und dendritische Zellen und die Zusammenstellung mit Epithelzellen zu einem mehrzelligen menschlichen Lungenmodell. Biologische Reaktionen von Kokulturen, die sich aus Immunzellen zusammensetzen, die sich entweder von frisch isolierten oder aufgetauten Monozyten unterscheiden, werden bei Exposition gegenüber proinflammatorischen Reizen verglichen.

Multizelluläres humanes Alveolarmodell bestehend aus Epithelzellen und primären Immunzellen zur Gefahrenbeurteilung

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Isolierung und Kultivierung von aus dem Knochenmark gewonnenen Makrophagen aus Mäusen.

Isolierung und Kultivierung von Makrophagen aus dem Knochenmark aus Mäusen

Lernen Sie die Isolation und In-vitro-Kultur von murinen und menschlichen alveolären Makrophagen aus Lungen und bronchoalveolärer Lavageflüssigkeit. Diese Methode ermöglicht hochreine Zellpopulationen für die pulmonale Immunforschung.

Isolation und In-vitro- Kultur von murinen und menschlichen alveoläre Makrophagen

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