Name: Folgenden endokardialen Gewebe Bewegungen über Zelle Ladungszustand des Zebrafish Embryos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie Endokardzellen während der Atrioventrikularkanal- und Herzklappenbildung in lebenden Zebrafisch-Embryonen verfolgen. Diese Photokonversionsmethode mit Kaede-Protein überwindet die Herausforderungen der schnellen Herzaktion.

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Wir möchten danken Anne-Laure Duchemin, Denise Duchemin, Nathalie Faggianelli und Basile Gurchenkov für die Hilfe, konstruieren und fertigen die Form, die in diesem Protokoll beschrieben. Diese Arbeit wurde von der Europäischen Gemeinschaft, ERC CoG N ° 682938, EMBO Young Investigator Program, die ANR (ANR-15-CE13-0015-01, ANR-12-ISV2-0001-01), FRM (DEQ20140329553) unterstützt Evalve und geleitet durch den Zuschuss ANR-10-LABX-0030-INRT, ein französischer Staatsfonds die Agence Nationale De La Recherche unter dem Rahmen Programm Investissements Avenir beschriftet ANR-10-IDEX-0002-02.

1. Vorbereitung Formen und Montage agarose
<ol><li>Erstellen Sie eine Form mit den Maßen, die in Abbildung 1 mit einem 3D Drucker oder traditionelle mechanische Werkstatt Werkzeuge dargestellt.</li>
	<li>Pipette ca. 1,5 mL geschmolzene 1 % Agarose in eine Schale 35 mm Kunststoff Montage. Legen Sie den Kunststoff-Formenbau in die flüssige Agarose, kümmert sich um Trapping Luft zwischen der Form und der Agarose zu vermeiden. Legen Sie die Schale bei 4 ° C, warten Sie, bis die Agarose härtet (Dies dauert ca. 5 min.), dann entfernen Sie die Kunststoff-Formenbau.</li>
	<li>Um die Montage Schüssel für die spätere Verwendung zu speichern, bedecken Sie die Schüssel mit dem Deckel, dann wickeln Sie die Schale und den Deckel mit Parafilm fest. Die Montage-Schüssel kann dann gespeichert werden Deckel Seite nach unten bis zu 5 Tage bei 4 ° C.</li>
	<li>Bereiten Sie im Voraus 1 mL Aliquots von 0,7 % niedriger Schmelzpunkt Agarose in 1,5 mL Eppendorf-Röhrchen, am Tag der Montage zu verwenden. Hinweis: Die Agarose-Brunnen der Montage Schale werden im Laufe der Zeit verformen, wie Wasser verdunstet, wenn Parafilm nicht die Gerichte fest gewickelt ist.</li>
</ol>2. Gewinnung Embryonen für den Ladungszustand
<ol><li>Incross Tg (Fli1a:gal4FFUbs, UAS:kaede) Linie und wachsen etwa 200 Embryonen im Embryo Medium im Dunkeln bei 28,5 ° C. Weitere Informationen zum Zebrafisch Linien kreuzen finden Sie in der Jupiter Science Education Database11.</li>
	<li>Nach 5 h, aber vor 24 h behandeln Embryonen mit 1-Phenyl-2-Thioharnstoff (PTU) Pigmentbildung verhindern (0,003 % PTU im Embryo Medium).</li>
	<li>Ca. 1 h vor dem Start der Ladungszustand, Bildschirm Embryonen unter einem fluoreszierenden Stereoskop und wählen Sie 5 gesunde Embryonen angezeigt, die die hellsten grün fluoreszieren zum Ausdruck bringen. Niedriger Intensität Licht bei der Visualisierung von Embryonen wird empfohlen, um die Embryonen zu Umgebungslicht zur Vermeidung von Photoconverting Kaede in unspezifischen Zellen vermeiden.</li>
</ol>3. einbetten
<ol><li>10 mL Montage Medien vorbereiten: 0,02 % Tricaine und 50 mM BDM Embryo Medium.</li>
	<li>Die Montage-Schale 2 mL Eindeckmedium hinzu und lassen Sie 15-30 min für die Lösung in der Agarose verbreiten.</li>
	<li>In der Zwischenzeit schmelzen Sie eine 1 mL-aliquoten von 0,7 % niedriger Schmelzpunkt (LMP) Agarose indem man das Rohr in einem Heizblock 70 ° C für ca. 5 Minuten.<ol>
<li>Warten auf die LMP-Agarose etwas abkühlen lassen, dann das Rohr des niedrigen Schmelzpunktes Agarose 25 µL 8 mg/mL Tricaine Lösung und 40 µL 1M BDM-Lösung hinzufügen. Mix von oben und unten, Pipettieren übertragen dann das Rohr auf 38 ° C Hitze Block die LMP-Agarose in seinem flüssigen Zustand zu halten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>In einer Petri dish mit Embryo Medium, sorgfältig Dechorionate der vorgewählten Embryos unter dem Stereomikroskop mit Pinzette, kümmert sich nicht um die Embryonen zu beschädigen.</li>
	<li>Übertragen Sie die Embryonen auf eine separate Schale mit 2 mL Montage Medien.<ol>
<li>Wenn das Herz des Embryos gestoppt werden (dauert ca. 5-10 min.), Transfer der Embryonen, die Montage-Speise- und arrangieren Embryonen in den Vertiefungen mit Pinzette, so dass sie in einem Winkel von 25 Grad liegen tails in Richtung der tiefere Teil des Brunnens, Eigelb nach oben zeigt.</li>
		<li>Wenn Embryonen sind etwa vorhanden, entfernen Sie das Medium, die Embryonen in ~ 200 µL 0,7 % LMP Agarose, Tricaine und BDM enthält einbetten und Nachjustieren der Embryonen Positionen, kippen die Embryonen nach links oder rechts als notwendig.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Warten Sie, bis die LMP-Agarose-Sets (dauert ca. 5 min.), dann das Gericht fügen Sie Eindeckmedium hinzu. Die Embryonen sind jetzt bereit, Photoconverted zu sein. Hinweis: Die Tricaine und das BDM sind die Embryonen zu betäuben und die Embryonen Herz bzw. stoppen verwendet. Montage-Medien können am Vortag Bildgebung vorbereitet werden, aber achten Sie darauf, die Medien vor Licht zu schützen. Hinweis: Die korrekte Positionierung der Embryonen ist wichtig, einen freie Laser-Pfad zu den Zellen zu erlauben, die man zu Photoconvert wünscht. Positionieren Sie den Kopf des Embryos in der Nähe der Start des Brunnens, so dass Laserlicht nicht weit reisen, um den Embryo zu erreichen und damit die Embryonen nach Ladungszustand leicht ausgehängt werden können.</li>
</ol>4. Ladungszustand
<ol><li>Auf eine aufrechte confocal Mikroskop (wie Leica SP8) ausgestattet mit einem 405 nm, 488 nm und 561 nm Laserquelle, lokalisieren den Embryo ist weißes Licht (Hellfeld) und einem Objektiv übertragen mit Herz (wie Leica HCX IRAPO L, 25 × N.A 0,95 Ziel). Suchen Sie nach roten Kaede Fluoreszenz mit dem 561 nm Laser (d.h. 561 DPSS Laser, bei ~ 5 % Intensität, Detektor bei 589-728 nm eingestellt). Dann visualisieren des Endokards mit 488 nm-Laser (d.h. 30 mW mehrzeilige Argon-Laser bei ~ 5 % Intensität, Detektor auf 502-556 nm eingestellt).</li>
	<li>Geben Sie "FRAP" Modus auf das Mikroskop-Datenerfassungs-Software. Wählen Sie ~ 1 % Laserleistung für beide 488 nm und 561 nm Laser.</li>
	<li>Konzentrieren Sie sich auf der Ebene von Interesse, wählen Sie eine Region of Interest (ROI) aus, dann auf 25 % Laserleistung, Scannen über den ROI dreimal Photoconvert Zellen unter Verwendung von 405 nm-Diode laser. Unzureichende Kaede Photoconverted im ROI sein sollte, wiederholen Sie den Scanvorgang 405 nm-Laser über die Fläche dreimal. Wiederholen Sie diesen Schritt für alle ROIs.</li>
	<li>Die Software in den Modus "TCS SP8" Rendite und erwerben einen Z-Stack, mit Hilfe der 561 nm und 488 nm Laser gegenüber dem Vorquartal. Achten Sie darauf, wählen Sie die Option "bidirektionale" bildgebende Geschwindigkeit zu erhöhen. Hinweis: Wie lange es dauert, um Photoconvert und Bild jedes Embryo variiert. Herzschlag ist bekannt für normale Herz-Ventil Entwicklung wichtig sein, so vermeiden halten das Herz für mehr als 30 min beendet, auch wenn es bedeutet, dass Sie keine Zeit zum Photoconvert haben alle 5 Embryonen. Hinweis: Bei der Ladungszustand Verwendung PMT-Detektoren, während nach Ladungszustand, empfiehlt es, Hybrid-Detektoren setzen auf 'zählen' Modus zu verwenden. Dies ist da die Hybrid-Detektoren empfindlicher sind und sind in der Lage, bessere Bildqualität, aber werden leicht durch übermäßige beschädigt.</li>
</ol>5. Demontage Photoconverted Embryonen
<ol><li>Verwenden Sie nach Ladungszustand eine Glaspipette, um nach unten zu drücken, nur leicht über dem Kopf des Embryos zu brechen die LMP-Agarose, dann sanft saugen auf den Embryo.<ol>
<li>Auswerfen des Embryos aus der Glaspipette in einer 35-mm-Petrischale mit Embryo Medium mit PTU (um abzuwaschen BDM mit Medium).</li>
		<li>Übertragen Sie den Embryo zu einem Brunnen in einem 6-Well-Platte mit Embryo Medium mit PTU. Während dieses Schrittes geht achten Sie darauf, die Kenntnis von dem Embryo zu halten in die nun, wie dies wichtig ist, die Position der Photoconverted Zellen in später Entwicklungsstadien korrelieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nun, da die Embryonen aus dem BDM enthaltenden Medium entfernt sind, sollten ihre Herzen fangen schlagen und wieder in ca. 5 min. Return Embryonen an die Dunkelheit bei 28,5 ° C erlauben Embryonen weiterhin normal entwickeln.</li>
</ol>6. Bildgebung Photoconverted Zellen später embryonalen Stadium
<ol><li>Zum gewünschten Zeitpunkt stoppen Sie das Herz zu und erneut Betten Sie die Embryonen wie unter Schritt 3 dieses Protokolls ein, mit dem entscheidenden Unterschied, dass Embryonen mit BDM in separaten, markierte Gerichte zu verfolgen Embryonen behandelt werden müssen.</li>
	<li>Für Embryonen bis zu 62 hpf, erwerben Z-Stapel des Endokards mit 561 nm und 488 nm für Rot und grün fluoreszierenden signalisiert, beziehungsweise. Für Embryonen in Phasen älter als 62 hpf, verwenden Sie einen Multiphoton laser-Satz auf 940 nm grün Kaede anstelle von 488 nm Laser Image.</li>
</ol>(7) Bildanalyse für Embryonen unter 48 hpf
Bemerkung: Gewebe Bewegungen von der AVC kann schwierig, aufgrund seiner komplexen dreidimensionalen Struktur zu analysieren. Um die Länge einer Photoconverted Region in AVC zwischen zwei nicht-Photoconverted-Regionen oder die Länge einer nicht-Photoconverted-Region in der AVC zwischen beiden Photoconverted Regionen zu quantifizieren, es kann wünschenswert sein, die dreidimensionale Struktur auf Karte ein zweidimensionale Karte. Bilder von Photoconverted Embryonen gewonnen vor 48 hpf kann mithilfe der folgenden Methode analysiert werden.
<ol><li>Importieren Sie die aufgenommenen Bilder in Matlab oder ähnliche Software.</li>
	<li>Valencianischen Sie manuell den ROI, d. h. die Endokards und tragen Sie eine Maske um das Signal außerhalb dieser Region zu entfernen.</li>
	<li>Tragen Sie einen Schwellenwert für die Intensität auf das Bild, um die Punkte auf den Endokards zu identifizieren und Plotten sie in drei Dimensionen. Isolieren Sie die Punkte entsprechend der schmalste und am geraden Teil der AVC durch Löschen manuell kein Sehenswertes auf das Atrium und die Herzkammer mit dem Löschbefehl in der Software.</li>
	<li>Verwenden Sie einen Zylinder um die Punkte, die den so erhaltenen AVC passen.</li>
	<li>Definieren Sie ein Bezugssystem um mehrere Proben zu vergleichen. Beispielsweise übernehmen Sie den Massenmittelpunkt der AVC-Punkte als der Ursprung des Bezugssystems und die Achse des Zylinders als die z-Achse ausgestattet.<ol>
<li>Stellen Sie sicher, dass die positive Z-Positionen immer auf der gleichen Seite des Herzens (ventrikuläre oder Vorhofflimmern) entsprechen.</li>
		<li>Die AVC Projektpunkte auf der X-y-Ebene und verwenden Sie eine Ellipse zu ihnen passen.</li>
		<li>Drehen Sie die endokardialen Punkten um die z-Achse, so dass die Hauptachse der Ellipse und die y-Achse des Bezugssystems sind parallel und positive y-Werte der inneren Seite des AVC in Bezug auf den Embryo entsprechen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Um die AVC zu segmentieren, schneiden Sie das dreidimensionale Dataset mit einige Flugzeuge erhalten durch Drehen der Halbebene {y = 0, X > 0} in Z-Richtung.<ol>
<li>Projizieren Sie die Intensität der benachbarten Pixel auf diese Ebenen und definieren Sie das Endothel in konsistenter Weise zu. Z. B. manuell eine Linie aus dem Vorhofflimmern ventrikuläre neben der AVC auf halbe Stärke des Endothels.</li>
		<li>Interpoliert die Punkte der Linien repräsentieren das Endothel mit einer dreidimensionalen Spline mit der Spline Toolbox AVC mit einer Oberfläche dargestellt. Hinweis: Die Anzahl der die Schnittebenen bestimmt sowohl die Genauigkeit der Segmentierung und den Verbrauch von diesem Schritt. 8 Flugzeuge sind in der Regel genug, um gute Ergebnisse zu erzielen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Legen Sie die azimutale Position jedes Punktes auf der AVC-Oberfläche unter Verwendung von zylindrischen Koordinaten.<ol>
<li>Definieren Sie an jede azimutale Position eine parametrische Kurve entlang der Oberfläche der AVC durch die Berechnung der Bogenlänge auf der Oberfläche zwischen aufeinander folgenden Punkten.</li>
		<li>Definieren Sie für jede parametrische Kurve den Punkt auf der Kurve am nächsten an der Mitte der AVC auf Null. Die Punkte der AVC sind somit vollständig durch ihre azimutale Position und ihre Position auf die parametrische Kurve beschrieben.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Entfalten Sie die AVC in ein zweidimensionales Bild mithilfe der parametrischen Position der Punkte.</li>
	<li>Finden Sie die Kanten der Region, wie die Kanten der Schnittstellenüberwachung binäres Bild das Verhältnis der Intensitäten von der Photoconverted und der nicht-Photoconverted-Kanäle zu quantifizieren. Korrigieren Sie das Ergebnis bei Bedarf manuell.</li>
	<li>Berechnen Sie die Bogenlänge zwischen den Kanten die Länge des Gewebes als Funktion der azimutale Position berechnen.</li>
</ol>

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</ol>

Kein Interessenkonflikt erklärt.

Timing der Ladungszustand: Obwohl Kaede bleibt hell ausgedrückt im EDZ sogar bei 96 hpf, ist anzumerken, dass der Embryo wächst, Laser-Licht mehr diffundiert bevor es die AVC, erschweren die engen Ladungszustand der Kaede erreicht. Bei embryonalen Stadien spätestens 55 hpf, Ballonfahren der Ventrikel und Atrium bedeutet auch, dass die violetten Laserstrahl verwendet für Ladungszustand AVC Zellen ohne ersten Durchgang durch die Atrium oder Ventrikel erreichen kann. Dies bedeutet, dass über 55 hpf, um zu Photoconv...

Der Zebrabärbling ist derzeit eines der wichtigsten vertebrate Modelle, Zell- und Entwicklungsbiologie Prozesse in Vivozu studieren. Dies ist vor allem wegen der Zebrabärbling optische Transparenz und Hilfsbereitschaft, Genetik, wodurch es ein leistungsfähiges Modell für die Anwendung von optischen Techniken genetisch codierte Photoresponsive Protein Technologien1. Speziell für die Untersuchung der Entwicklung von Herz, Zebrafisch erhalten genügend Sauerstoff durch Diffusion, so dass auch Mutanten ohne Herzschlag durch die ersten Wochen der Entwicklung, überleben können Analysen über die Auswirkungen von Entwicklungsgenen und verstört bei schönem Durchblutung am Herzen Morphogenese in die meisten Wirbeltiere2nicht möglich.
Die Zebrafisch Herz Röhre wird durch 24 Stunden Post Düngung (hpf) gebildet. Kurz nach ihrer Gründung fängt das Herz Rohr aktiv zu schlagen. Von 36 hpf, eine deutliche Einschnürung trennt das Atrium aus dem Ventrikel. Diese Region der Verengung ist ventrikulären Kanal (AVC) und Zellen in dieser Region Änderung von einem Plattenepithelkarzinom Morphologie zu einem quaderförmigen Morphologie3genannt. Zebrafisch ventrikulären Ventil Morphogenese beginnt etwa 48 h post Düngung. Durch 5 Tage nach Befruchtung, zwei Klappensegel erstrecken sich in der AVC und verhindern den Rückfluss des Blutes aus dem Ventrikel in den Vorhof während der Diastole4. Tracking-Zellen bei AVC und Ventil Bildung ist anspruchsvoll, da die schnellen Schläge des Herzens es schwierig macht, Zellen über traditionelle Zeitraffer Mikroskopie5,6folgen. Dieses Protokoll, adaptiert von Ross Et Al., 20167, beschreibt eine Methode, die Tg (Fli1a:gal4FFUbs, UAS:kaede)8 Zebrafisch transgene Linie, in der das Photoconvertible Protein Kaede in ausgedrückt wird Endothelzellen, einschließlich des Endokards. Die Droge 2,3-Butanedione-2-Monoxime (BDM) wird verwendet, um das Herz zu schlagen, so dass genaue Ladungszustand des EDZ zwischen 36 und 55 hpf und hochauflösende Bildgebung des Photoconverted EDZ an bestimmten Entwicklungszeit stellen vorübergehend zu stoppen. Es hat bisher gezeigt, dass EDZ Photoconverted mit dieser Methode für mindestens fünf Tage nach dem Zeitpunkt der Ladungszustand7unterscheidbar von den Unbekehrten Nachbarn bleiben kann. Dieses Protokoll beschreibt auch eine Methode für die Bildanalyse der Photoconverted EDZ in Embryonen, die jünger als 48 hpf, die erfolgreich verwendet wurde, um Gewebe Bewegungen während AVC Entwicklung (Boselli Et Al., im Druck)9folgen. Wir hoffen, dass die Leser dieses Protokoll nützlich finden würde, für AVC und Ventil Entwicklung in normalen Embryonen und Mutanten, Morphants oder Medikament behandelten Embryonen zu studieren. Lesen Sie für eine allgemeinere Protokoll in Bezug auf Zelle Tracking mit Photoconvertible Proteinen während der Zebrafisch-Entwicklung bitte den Artikel von Lombardo Et Al., 2012-10.

<table><tbody><tr><td>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Notwendige Ausrüstung für die Aufzucht von Fischen und das Sammeln von Eiern (siehe Zebrafish Book22 für Details).</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aufrechtes konfokales Mikroskop (Ausgestattet mit Lasern bei 488 nm, 561 nm und 405 nm, einem durchstimmbaren Multiphotonenlaser und einem Leica HCX IRAPO L, 25 >, N.A. 0,95 Objektiv)</td><td>Leica</td><td>Leica SP8</td><td></td></tr><tr><td>Wärmeblock</td><td>ThermoScientific</td><td>88870001</td><td></td></tr><tr><td>35 mm x 10 mm Gewebekulturschale</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Platte</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Petrischale</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinzette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glaspipette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Form</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><stark>Reagenzien</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>8 mg/ml Tricain-Stammlösung&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 M BDM-Stammlösung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt</td><td>Invitrogen</td><td>16520-050</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>PTU (1-Phenyl-2-thioharnstoff)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>Embryomedium: 30x Stammlösung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matlab ausgestattet mit den Toolboxen Image Analysis, Curve Fitting, Bio-Formats</td><td>MathWorks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>8 mg/mL Tricain-Stammlösung</td>200 mg Tricainpulver <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(Ethyl-3-aminobenzoat-Methansulfonsäure)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>25 mL Danieau</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Auf pH 7 einstellen, aliquotieren und bei -20 & Grad lagern; C&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><stark>1 M BDM Stammlösung</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 g BDM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>112135</td><td></td></tr><tr><td>10 mL ddH2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aliquot und lagern bei -20 &de; C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Embryo medium: 30x Stammlösung</stark>50,7</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>g NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>0,78 g KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>1,47 g Magnesiumsulfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp; 7487-88-9</td><td></td></tr><tr><td>2,1 g Calciumnitrit-Tetrahydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>13477-34-4</td><td></td></tr><tr><td>19,52 g HEPES (4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7365-45-9</td><td></td></tr> Auf <tr><td>pH 7,2 einstellen und bei Raumtemperatur</td><td></td><td></td><td></td> lagern</tr><tr><td>Mold</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PlasCLEAR Harz</td><td>Asiga</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plus 39&nbsp; Freiform-Pico 3D-Drucker</td><td>Asiga</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

folgenden endokardialen gewebe bewegungen über zelle ladungszustand des zebrafish embryos

Following Endocardial Tissue Movements via Cell Photoconversion in the Zebrafish Embryo

In der Embryogenese Zellen durchlaufen dynamische Veränderungen der Zelle Verhalten und Entschlüsselung der zellulären Logik hinter diesen Veränderungen ist ein grundlegendes Ziel auf dem Gebiet der Entwicklungsbiologie. Die Entdeckung und Entwicklung von Photoconvertible Proteinen haben unser Verständnis dieser dynamischen Veränderungen durch die Bereitstellung einer Methode auf, um optisch markieren Sie Zellen und Gewebe unterstützt. Jedoch während Ladungszustand, Time-Lapse-Mikroskopie und anschließende Bildanalyse sich sehr erfolgreich bei der Aufdeckung zelluläre Dynamik in Organe wie das Gehirn oder das Auge als haben, diesen Ansatz dient in der Regel nicht in den Entwicklungsländern Herz Herausforderungen durch die schnelle Bewegung des Herzens während der Diastole. Dieses Protokoll besteht aus zwei Teilen. Der erste Teil beschreibt ein Verfahren zur Photoconverting und anschließend tracking endokardialen Zellen (EDZ) im Zebrafisch ventrikulären Kanal (AVC) und ventrikulären Herz-Ventil-Entwicklung. Die Methode beinhaltet zeitlich stoppen das Herz mit einem Medikament in Reihenfolge für genaue Ladungszustand stattfinden. Herzen sind wieder erlaubt schlagen nach dem Entfernen der Drogen- und Embryonalentwicklung wird normal fortgesetzt, bis das Herz wieder für die hochauflösende Darstellung von Photoconverted EDZ einen Zeitpunkt später Entwicklung gestoppt wird. Der zweite Teil des Protokolls beschreibt eine Analysemethode Bild um die Länge einer Photoconverted oder nicht Photoconverted Region in AVC in jungen Embryonen zu quantifizieren, indem Sie das Fluoreszenzsignal aus der dreidimensionalen Struktur auf eine zweidimensionale Karte zuordnen . Zusammen, die beiden Teile des Protokolls ermöglicht zu prüfen, die Herkunft und das Verhalten von Zellen, aus denen der Zebrafisch AVC und ventrikulären Herzklappe und können potenziell studierst Mutanten, Morphants oder Embryonen, die mit behandelt wurden beantragt werden Reagenzien, die AVC und/oder Ventil Entwicklung stören.

Ein Beispiel für ein Embryo Photoconverted um 48 hpf und wieder bei 80 hpf ist in Abbildung 2, Filme 1 und 2dargestellt. Kaede irreversibel 405 nm Licht aussetzen in Bezug auf ihre differentiell farbigen Konvertiten aus dem Protein aus seiner fluoreszierende grüne Form, fluoreszierende rote Form, damit das Verhalten von Zellen mit entweder grün oder ihre rote Form mit einzuhaltenden beschriftet Nachbarn bei Ventil-Bildung. Es...

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode für den Ladungszustand Kaede fluoreszierenden Proteins in endokardialen Zellen der lebenden Zebrafischembryo, die es die Verfolgung von endokardialen Zellen während der ventrikulären Kanal und ventrikulären Herz-Ventil-Entwicklung ermöglicht .

Folgenden endokardialen Gewebe Bewegungen über Zelle Ladungszustand des Zebrafish Embryos

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Endokardzellen während der Bildung des atrioventrikulären Kanals und der Herzklappen zu verfolgen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der kardialen Entwicklung zu beantworten, z. B. um zu verstehen, wie sich Endokardzellen in verschiedenen Arten von Mutanten verhalten. Die Verfolgung von Zellen während der AVC und der Klappenbildung ist aufgrund des schnellen Herzschlags eine Herausforderung.Es macht es schwierig, Zellen mit der herkömmlichen Zeitraffermikroskopie zu verfolgen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie einige dieser Schwierigkeiten umgeht. Das Verfahren wird von Renee, einer Postdoktorandin in meinem Labor, demonstriert.Nachdem Sie eine Form gemäß dem Textprotokoll erstellt haben, pipettieren Sie etwa 1,5 Milliliter geschmolzene 1%Agarose in eine 35-Millimeter-Kunststoffauffangschale. Positionieren Sie dann die Kunststoffform in der flüssigen Agarose und achten Sie darauf, dass keine Luft zwischen der Form und der Agarose eingeschlossen wird. Stellen Sie die Schüssel bei vier Grad Celsius, bis die Agarose hart wird.Entferne dann die Kunststoffform von der Agarose. Geben Sie dann zwei Milliliter des zuvor vorbereiteten Eindeckmediums in die Eindeckschale und lassen Sie die Lösung 15 bis 30 Minuten in die Agarose diffundieren. In der Zwischenzeit schmelzen Sie ein Ein-Milliliter-Aliquot mit einem niedrigen Schmelzpunkt (LMP) Agarose, indem Sie das Rohr etwa fünf Minuten lang in einen 70 Grad Celsius heißen Block legen.Pipettieren Sie die LMP agarose auf und ab, um sie etwas abzukühlen. Geben Sie dann 25 Mikroliter acht Milligramm pro Milliliter Tricain und 40 Mikroliter einmolare BDM-Lösungen in das Röhrchen. Mischen Sie, indem Sie auf und ab pipettieren.Übertragen Sie dann das Rohr in einen 38 Grad Celsius heißen Block, um die LMP-Agarose in ihrem flüssigen Zustand zu halten. Übertragen Sie die Embryonen in eine separate Schale, die zwei Milliliter Eindeckmedium enthält. Dann, wenn die Herzen aufgehört haben zu schlagen, übertragen Sie die Embryonen in die Aufstiegsschale und ordnen Sie sie mit einer Pinzette in den Vertiefungen an, so dass sie in einem 25-Grad-Winkel liegen, wobei die Schwänze in den tieferen Teil der Vertiefung zeigen, mit dem Eigelb nach oben.Wenn die Embryonen ungefähr an Ort und Stelle sind, entfernen Sie das Medium und betten Sie sie in etwa 200 Mikroliter 0,7%ige LMP-Agarose ein, die Tricain und BDM enthält. Stellen Sie dann die Positionen des Embryos neu ein und kippen Sie sie je nach Bedarf nach links oder rechts. Drücken Sie auf die Wände des eingekerbten Quadrats, damit überschüssige Agarose in die Seitenbereiche der Aufspannschale überlaufen kann.Warten Sie etwa fünf Minuten, bis die LMP-Agarose fest geworden ist, und geben Sie dann Eindeckmedium in die Schale. Die Embryonen sind nun bereit, photokonvertiert zu werden. Um die Photokonversion durchzuführen, verwenden Sie an einem aufrechten konfokalen Mikroskop, das mit 405-, 488- und 561-Nanometer-Laserquellen ausgestattet ist, durchgelassenes weißes Licht und eine Objektivlinse, um das Herz des Embryos zu lokalisieren.Prüfen Sie mit dem 561-Nanometer-Laser auf rote Kaede-Fluoreszenz. Verwenden Sie dann den 488-Nanometer-Laser, um das Endokard sichtbar zu machen. Wechseln Sie anschließend in der Mikroskopaufnahmesoftware in den FRAP-Modus.Wählen Sie dann eine Laserleistung von ca. 1 % sowohl für den 488- als auch für den 561-Nanometer-Laser aus. Während Sie sich auf die Interessenebene konzentrieren, wählen Sie einen Interessenbereich oder ROI aus. Anschließend werden die Zellen mit dem 405-Nanometer-Diodenlaser bei 25 % Laserleistung photokonvertiert und der ROI dreimal abgetastet.Sollte nicht genügend Kaede in der ROI photokonvertiert werden, scannen Sie den 405-Nanometer-Laser erneut dreimal über die Fläche. Kehren Sie in der Software in den TCS SP8-Modus zurück und erfassen Sie mit den 561- und 488-Nanometer-Lasern nacheinander im bidirektionalen Modus einen Z-Stapel. Nach der Photokonversion drücken Sie mit einer Glaspipette knapp über dem Kopf des Embryos leicht nach unten, um die LMP-Agarose zu brechen.Saugen Sie dann den Embryo vorsichtig auf. Um das BDM-haltige Medium wegzuspülen, werfen Sie den Embryo aus der Glaspipette in eine 85-Millimeter-Petrischale mit Embryomedium mit PTU aus. Übertragen Sie den Embryo in eine Vertiefung in einer Sechs-Well-Platte, die Embryomedium mit PTU enthält.Achten Sie bei diesem Schritt darauf, welcher Embryo in welche Vertiefung kommt, da dies wichtig ist, um die Position der photokonvertierten Zellen in späteren Entwicklungsstadien zu korrelieren. Nachdem die Embryonen nun aus dem BDM-haltigen Medium entnommen wurden, sollten ihre Herzen in etwa fünf Minuten wieder zu schlagen beginnen. Bringen Sie die Embryonen bei 28,5 Grad Celsius in die Dunkelheit zurück, damit sie sich normal weiter entwickeln können.Im gewünschten Stadium stoppen Sie das Herz und betten die Embryonen wieder ein, wie zuvor in diesem Video gezeigt, mit dem wichtigen Unterschied, dass die Embryonen in separaten, gekennzeichneten Schalen mit BDM behandelt werden müssen, um den Überblick zu behalten. Bei Embryonen bis zu 62 hpf erfassen Sie Z-Stapel des Endokards mit 561 bzw. 488 Nanometern für rote bzw. grün fluoreszierende Signale. Bei Embryonen, die älter als 62 hpf sind, verwenden Sie anstelle des 488-Nanometer-Lasers einen Multiphotonenlaser mit einem Wert von 940 Nanometern, um die grüne Kaede abzubilden.Bei Embryonen unter 48 hpf ist es möglich, die dreidimensionale AVC zur Analyse auf ein zweidimensionales Bild zu projizieren. Legen Sie zunächst einen Schwellenwert für das Bild fest. Löschen Sie dann Punkte, die außerhalb des Herzens liegen.Um eine manuelle Segmentierung durchzuführen, richten Sie das Bild links so aus, dass es mit dem Bild auf der rechten Seite übereinstimmt. Segmentieren Sie die Seite des Herzens, durch die der orangefarbene Vektor verläuft, und fügen Sie Punkte in Richtung des blauen Vektors hinzu. Interpolieren Sie anschließend die Querschnitte, und projizieren Sie die Farbintensität auf die Oberfläche.Passen Sie abschließend die Ausrichtung des AVC an, und projizieren Sie ihn auf eine 2D-Oberfläche. Ein Beispiel für ein embryonales Herz kurz nach der Photokonversion bei 48 hpf ist hier zu sehen. Die zytoplasmatische Kaede in mehreren Zellen der oberen Seite des AVC wurde von grün auf rot umgewandelt.Im selben Embryo mit 80 hpf ist es offensichtlich, dass sich die photokonvertierten Zellen vermehrt haben und auf die Innenseite der oberen atrioventrikulären Klappe gewandert sind. Ein Beispiel für einen 36-hpf-Embryo, bei dem die EdCs im Vorhof und Ventrikel photokonvertiert wurden, ist hier dargestellt. Der AVC wird dann zur einfacheren Visualisierung und Analyse in zwei Dimensionen projiziert und ermöglicht es, den Abstand zwischen den beiden photokonvertierten Bereichen zu quantifizieren.Bei diesem Verfahren ist es wichtig, die Zeit, in der das Herz stillsteht, so kurz wie möglich zu halten, um die normale Entwicklung nicht zu beeinträchtigen. Mit etwas Übung kann die Fotokonvertierung innerhalb von ca. 30 Minuten abgeschlossen werden, sofern alles im Voraus vorbereitet ist. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Endokardzellen nach der Photokonversion in lebenden Zebrafischembryonen verfolgen und Ihre Datensätze analysieren können.

following-endocardial-tissue-movements-via-cell-photoconversion

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Eine schnelle Weg zur Immunfärbung von Zebrafisch-Embryonen Herzen Verhalten beschrieben wird. Im Vergleich zu der ganze Berg Immunfärbung Ansatz, diese Methode drastisch erhöht die Penetration der Antikörper, die die Erzielung einer hohen Auflösung, dass zelluläre / subzelluläre Strukturen offenbaren sich im Herzen innerhalb von einer deutlich reduzierten Bearbeitungszeit ermöglicht.

Immunfärbung von Dissected Zebrafisch embryonale Herz

Hier stellen wir eine Methode zur lichtaktivierten Umschaltung von photoveränderbaren fluoreszierenden Proteinen (PCFPs) im lebenden Zebrafischembryo sowie die anschließende Verfolgung des photoveränderten Proteins zu bestimmten Zeitpunkten während der Entwicklung vor. Diese Methodik ermöglicht die Beobachtung zellbiologischer Vorgänge, die verschiedenen Entwicklungsprozessen in einem lebenden Wirbeltierorganismus zugrunde liegen.

Handy-Tracking Mit Photoconvertible Proteine ​​während der Zebrafisch-Entwicklung

Hier beschrieben ist ein Protokoll zur halbautomatischen Bilderzeugungsgewebespezifischer Fluoreszenz in Zebrafischembryos.

Semi-Automated Imaging von Gewebespezifische Fluoreszenz-in Zebrafischembryonen

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll um zu zeigen, wie die Zelle Ladungszustand durch UV-Einwirkung auf bestimmte Bereiche, die mit dem Ausdruck des fluoreszierenden Proteins, Eos, in lebenden Tieren erreicht wird.

Einzellige Ladungszustand im lebendigen intakten Zebrafisch

Hier zeigen wir den Prozess der Erstellung einer zellulären elektrische Spannung Reporter Zebrafisch Linie um embryonale Entwicklung, Bewegung, zu visualisieren und Fisch Tumorzellen in Vivo.

Visualisierung von zellulären elektrische Aktivität im frühen Zebrafish Embryos und Tumoren

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Entwicklung von Herzen im Zebrafisch in 4 Dimensionen (4D) zu visualisieren. 4-D-Bildgebung, über Licht-Blatt Fluoreszenz-Mikroskopie (LSFM) dauert 3-dimensionale (3D) Bilder im Laufe der Zeit entwickelnde Herzen zu rekonstruieren. Wir zeigen qualitativ und quantitativ die Scherspannung aktiviert endokardialen Kerbe Signalisierung während der Entwicklung der Kammer, die kardiale Trabeculation fördert.

Licht-Blatt Fluoreszenz-Mikroskopie, 4-dimensionale Bilder über die Auswirkungen der modulierende Schubspannung auf entwickelnden Zebrafisches Herzen erfassen

Wir beschreiben optimierte Werkzeuge zur Untersuchung des Zebrafischherzens in vivo mit Lichtblattfluoreszenzmikroskopie. Insbesondere schlagen wir helle kardiale transgene Linien vor und präsentieren neue sanfte Einbettungs- und Immobilisierungstechniken, die Entwicklungs- und Herzfehler vermeiden. Eine mögliche Datenerfassungs- und Analysepipeline, die an die kardiale Bildgebung angepasst ist, ist ebenfalls vorhanden.

Lichtblattmikroskopie der schnellen Herzdynamik in Zebrafischembryonen

Dieses Protokoll verwendet Lichtblatt-Bildgebung, um die kontraktile Funktion des Herzens in Zebrafischlarven zu untersuchen und Einblicke in die Herzmechanik durch Zellverfolgung und interaktive Analyse zu gewinnen.

4D-Lichtblatt-Bildgebung der Herzkontraktion von Zebrafischen

Dieses Protokoll beschreibt eine kostengünstige Lichtmikroskopiemethode zur Beurteilung der Herzmorphologie und -funktion in Zebrafischembryonen, die eine reproduzierbare Bewertung der Entwicklungskardiotoxizität ermöglicht, ohne dass fortschrittliche Bildgebungssysteme erforderlich sind.

Funktionelle kardiale Bildgebung in Zebrafischembryonen mittels Standardmikroskopie und Videoanalyse: Anwendungen in der Umwelt- und biomedizinischen Forschung

Protein-Spiegel in Zellen und Geweben werden oft dicht durch das Gleichgewicht der Proteinproduktion und Freigabe geregelt. Verwendung Fluoreszenzabklingzeit Nach Photokonversion (FDAP) können die Clearance-Kinetik von Proteinen experimentell in vivo gemessen werden.

Mess Protein Stabilität in Wohnzebrafischembryonen unter Einsatz von Fluoreszenz Decay Nach Photokonversion (FDAP)

Erfahren Sie, wie Sie Endokardzellen während der Atrioventrikularkanal- und Herzklappenbildung in lebenden Zebrafisch-Embryonen verfolgen. Diese Photokonversionsmethode mit Kaede-Protein überwindet die Herausforderungen der schnellen Herzaktion.

Folgenden endokardialen Gewebe Bewegungen über Zelle Ladungszustand des Zebrafish Embryos

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