Quantitative und Qualitative Methode für Sphingomyelin von LC-MS mit zwei stabilen isotopischer beschriftet Sphingomyelin Arten

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Menge und die Struktur jeder Sphingomyelin-Spezies in biologischen Proben genau zu analysieren. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Lipidbereich zu beantworten, die sich auf die Lipidbiologie und die Lipidbiologie beziehen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir eine Vielzahl von Sphingomyelin-Spezies in biologischen Proben mit Hilfe eines Chromatographie-Massenspektrometriesystems charakterisieren können. Nehmen Sie zunächst das Nährmedium aus einer 10 Zentimeter großen Gewebekulturschale mit HeLa-Zellen und spülen Sie die Zellen zweimal mit sechs Millilitern eiskaltem PBS aus.

Geben Sie dann einen Milliliter des eiskalten PBS in die 10 Zentimeter große Gewebekulturschale und verwenden Sie einen Zellschaber, um die Zellen zu ernten. Sobald Sie die Zellen von der Oberfläche der Schale entfernt haben, geben Sie sie in zwei Milliliter silikonisierte Kunststoffröhrchen. Entfernen Sie nach dem Zentrifugieren den Überstand und fügen Sie jedem Zellpellet einen Milliliter Methanol hinzu.

Dann die Röhren kurz durchwirbeln. Geben Sie dann die Proben in einen Bad-Ultraschallator und beschallen Sie sie fünf Minuten lang mit 200 Watt. Wenn Sie fertig sind, überführen Sie das gesamte Zellhomogenat in Reagenzgläser, die mit Teflon-ausgekleideten Schraubverschlüssen ausgestattet sind.

Geben Sie nun in jedes Reagenzglas einen Milliliter Methanol, einen Milliliter Chloroform, 0,8 Milliliter doppelt destilliertes Wasser in 50 Mikroliter à 10 Mikromolar eines internen Standards. Verschließen Sie die Röhrchen und wirbeln Sie sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur bei 2.500 U/min kräftig ein. Geben Sie dann zusätzlich einen Milliliter Chloroform und einen Milliliter doppelt destilliertes Wasser in jedes Röhrchen.

Wirbeln Sie die Röhren erneut fünf Minuten lang bei Raumtemperatur bei 2.500 U/min kräftig durch. Anschließend zentrifugieren Sie die Proben, um die wässrige und die organische Phase vollständig zu trennen. Die untere Phase in Einweg-Glasröhrchen überführen.

Geben Sie zwei Milliliter Chloroform in die Reagenzgläser. Dann werden die Röhren fünf Minuten lang bei Raumtemperatur bei 2.500 U/min kräftig vortext, um sich ausreichend mit der oberen Phase und den interphasischen Flusen zu vermischen. Nach einer zweiten Zentrifugation wird die modifizierte untere Phase zusammen mit der ersten unteren Phase in die Einwegglasröhrchen überführt.

Legen Sie nun die Glasröhrchen für ca. 60 Minuten unter einen Stickstoffstrahl und entfernen Sie die organischen Lösungsmittel in der gesammelten unteren Phase vollständig. Zum Schluss rekonstituieren Sie die Proben mit 500 Mikrolitern Methanol oder Ethanol. Die resultierende Mischung mit einem 0,02-Mikron-Filter in Glasfläschchen filtrieren.

Lagern Sie die Probe dann bei minus 20 Grad Celsius. Führen Sie serielle Verdünnungen der Standardverbindung durch und geben Sie 50 Mikroliter jeder Konzentration in separate Reagenzgläser. Bereiten Sie als Nächstes drei Qualitätskontrollproben vor, indem Sie der ersten Probe eine Menge innerhalb des Dreifachen der unteren Begrenzung der Standardkurve, für die zweite Probe eine Menge nahe der Mitte der Kurve und für die dritte Probe eine Menge nahe der oberen Grenze der Standardkurve hinzufügen.

Geben Sie dann das Zellhomogenat in einem Milliliter Methanol in jedes Reagenzglas und extrahieren Sie aus jeder Probe die gesamte Lipidfraktion mit der eben gezeigten Methode. Bereiten Sie zunächst die mobile Phase vor. Mischen Sie Acetonitril, Methanol und doppelt destilliertes Wasser in einem Verhältnis von zwei zu zwei zu eins für die wässrige Phase.

Verwenden Sie Isopropanol für die organische Phase in Glasflaschen mit teflonbeschichteten Schraubverschlüssen. Dann beschallen Sie beide beweglichen Phasen fünf Minuten lang in einem Wannen-Ultraschallgerät. Dann geben Sie Ameisensäure bis zu einer Endkonzentration von 26,4 Millimolar und Ammoniumhydroxid bei 14,9 Millimolar in jede mobile Phase.

Für die qualitative Analyse aktivieren Sie das Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie-System. Setzen Sie die Einlassröhrchen in die Glasflaschen ein, die die mobilen Phasen enthalten, und spülen Sie die HPLC-Leitungen. Verbinden Sie dann eine C18-HPLC-Säule mit dem HPLC-System.

Halten Sie die Temperatur im Säulenofen bei 50 Grad Celsius und konditionieren Sie die Säule mit der wässrigen mobilen Phase bei 100 Mikrolitern pro Minute. Legen Sie die Proben während des Laufs in ein Probengestell des Autosamplers. Stellen Sie die Parameter des dreifachen, vierfachen und vierfachen linearen Ionenfallen-Massenspektrometriesystems für die dreistufige Massenspektrometrie ein, wie in Tabelle eins und zwei des begleitenden Textprotokolls aufgeführt.

Stellen Sie außerdem die Parameter für die ersten und zweiten Vorläuferionen der interessierenden SM-Spezies ein, wie im begleitenden Textprotokoll ausführlicher beschrieben. Erstellen Sie eine Batch-Datei und senden Sie die Batch-Datei, um die Daten von MS mit drei Produktionenspektren jeder Sphingomyelin-Spezies durch Flüssigchromatographie zu erhalten: Elektrospray-Ionisations-Tandem-Massenspektrometrie. Erhalten Sie die dreiphasigen MS-Produktionenspektren der interessierenden Sphingomyelin-Spezies durch Flüssigkeitschromatographie und Elektrospray-Ionisations-Tandem-Massenspektrometrie.

Weisen Sie dann jedem MS drei Produktionenspektren des Sphingomyelins zu, indem Sie das Verhältnis von Masse zu Ladung der Produktionenspektren in der exakten Masse der langkettigen Sphingoid-Base und der interessierenden n-Acyl-Einheit vergleichen. Quantitative Analyse des Sphingomyelins mittels Flüssigkeitschromatographie, Elektrospray-Ionisation, Tandem-Massenspektrometrie, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben. Verarbeiten Sie dann die Daten zur Überwachung mehrerer Reaktionen mit der Software für die Datenintegration, um die Daten des Peakbereichs für das extrahierte Ionenchromatogramm jeder Sphingomyelin-Spezies zu erhalten.

Quantifizieren Sie jede Sphingomyelin-Spezies und erstellen Sie die Standardkurven, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben. Hier wird das Spektrum von chemisch synthetisiertem Sphingomyelin und Sphingomyelin in Lipidproben gezeigt, die aus HeLa-Zellen extrahiert wurden. Bemerkenswert ist, dass die Spektralintensität von demethyliertem Sphingosylphosphorylcholin in beiden Proben größer ist als die der SM-n-Acyl-Einheit.

Ebenfalls von Interesse ist, dass das Spektrum, das Sphingosin-1-phosphat entspricht, nützlich ist, um die Anzahl der Kohlenstoff- und Doppelbindungen der sphingoiden langkettigen Base des Sphingomyelins zu spekulieren. Bei der vorliegenden quantitativen Methode ist es entscheidend, Proben für die Erstellung der Kalibrierkurve zur Validierung dieser Methode präzise vorzubereiten. Die Kurvenanpassung für niedrige Konzentrationen wurde deutlich verbessert, indem der Gewichtungsfaktor gleich eins über x zum Quadrat verwendet wurde, verglichen mit dem Gewichtungsfaktor von eins oder eins über x.

Diese Technik ebnete Forschern aus Biologie und Industrie den Weg, eine Vielzahl von Sphingomyelin-Spezies in biologischen Proben und Industrieprodukten wie Kosmetika zu charakterisieren. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Menge und die Struktur jeder Sphingomyelin-Spezies in biologischen Proben genau analysieren können. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Absorptionsmitteln äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten, wie z. B. die Verwendung der richtigen Glasabnutzung.

Darüber hinaus ist es wichtig, Handschuhe zu tragen, um die Kontamination mit Lipiden aus den Händen zu verhindern.