Replikation von bestellt, Nonredundant Bibliothek von Pseudomonas Aeruginosa Stamm PA14 Transposon Insertion Mutanten

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, qualitativ hochwertige Kopien der geordneten, nicht redundanten Transposon-Mutantenbibliothek des Pseudomonas aeruginosa-Stammes PA14 zu generieren, die als PA14NR-Set bezeichnet wird. Dieses Protokoll behält die Integrität des PA14NR-Satzes während der Replikation bei und erzeugt qualitativ hochwertige Kopien dieser Bibliothek. Der Hauptvorteil dieses Protokolls besteht darin, dass es eine detaillierte Beschreibung aller Schritte bietet, die an der Bibliotheksreplikation, der Qualitätskontrolle und der ordnungsgemäßen Speicherung einzelner Mutanten beteiligt sind.

Obwohl dieses Protokoll für die Replikation des P14NR-Sets entwickelt wurde, kann es angepasst werden, um andere Bakterienbibliotheken zu replizieren. Im Allgemeinen haben Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten, da das Risiko einer Kontamination während des Replikationsprozesses besteht. Daher enthält dieses Protokoll detaillierte Schritt-für-Schritt-Anweisungen, um dieses Risiko zu verringern.

Unser Labor vertreibt das PA14NR-Set an die weltweite wissenschaftliche Gemeinschaft. Es wird empfohlen, die Bibliotheken vom Endbenutzer zu replizieren. Um Ihnen eine Orientierung zu geben, bieten wir ein Protokoll an, in dem detailliert beschrieben wird, wie Sie qualitativ hochwertige Kopien der Bibliothek erstellen können.

visuelle Demonstration dieses Protokolls ist von entscheidender Bedeutung, insbesondere die Schritte zur Vermeidung von Kreuzkontaminationen. Zum Selbstschutz sowie zum Schutz der Bakterienkulturen sollten beim Umgang mit der nicht-redundanten Transposon-Insertionsmutantenbibliothek des P-aeruginosa-Stammes PA14, der als PA14NR-Set bezeichnet wird, immer ein Laborkittel, Handschuhe und eine Maske getragen werden. Bereiten Sie LB-Agar-Platten vor, indem Sie etwa 60 Milliliter geschmolzenes LB-Agar in rechteckige Platten gießen.

Trocknen Sie die Platten vor der Verwendung etwa eine Stunde lang in einer sterilen Haube. Erstellen Sie ein steriles Feld mit einem Bunsenbrenner auf einer mit Ethanol abgewischten Tischplatte. Und stellen Sie Behälter mit geeigneten Lösungen für die Sterilisation von Replikatorstiften bereit.

Nehmen Sie eine PA14NR-Set-Masterplate aus dem minus 80 Grad Celsius Gefrierschrank und legen Sie sie auf Trockeneis in eine 4-Liter-Eispfanne. Nehmen Sie die 96-Well-Masterplatte, die aus dem Trockeneis repliziert werden soll, und legen Sie sie auf die Bank, um ein kurzes Auftauen zu ermöglichen. Richten Sie die Masterplate und die Agarplatte an der A1-Koordinate beider Platten in der oberen linken Ecke aus.

Markieren Sie die Position der A1-Koordinate auf der rechteckigen Agarplatte. Um die Replikatorstifte zu sterilisieren, tauchen Sie die Stifte 30 Sekunden lang in 250 Milliliter 0,3 bis 0,5 % Natriumhypochlorit. Klopfen Sie leicht auf den Replikator, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen, und tauchen Sie die Stifte 10 Sekunden lang in 250 Milliliter steriles Reinstwasser, gefolgt von 250 Millilitern 70 % Ethanol für 30 Sekunden und 250 Millilitern 95 % Ethanol für zwei Minuten.

Sterilisieren Sie die Replikatorstifte mit der Flamme, indem Sie den Replikator senkrecht zur Flamme des Bunsenbrenners halten, sich langsam der Flamme nähern, bis sich das Ethanol entzündet, und ihn dann sofort aus der Flamme ziehen. Die Flamme erlischt, sobald das gesamte Ethanol abgebrannt ist. Kühlen Sie die Stifte, indem Sie sie 30 Sekunden lang auf eine unbenutzte rechteckige Platte mit sterilem LB-Agar stecken.

Während die Replikator-Pins abkühlen, erwärmen Sie die Aluminiumdichtung von der PA14NR-Set-Masterplate kurz mit der Hand und ziehen Sie sie dann vorsichtig ab, wobei Sie darauf achten müssen, dass die Dichtung die Platte nicht retuschiert. Ziehe mit einer Pinzette alle Reste der Aluminiumdichtung ab. Setzen Sie die Replikator-Pins in die Masterplate ein, indem Sie den Replikator vorsichtig in alle vier Richtungen drücken und schwingen, um sicherzustellen, dass die Pins Kontakt mit den gefrorenen Bakterienkulturen in jeder der 96 Vertiefungen haben.

Achten Sie besonders auf Vertiefungen, die sich am äußeren Rand der Platte befinden, indem Sie Replikatorstifte gegen gefrorene Kulturen in den Vertiefungen am Rand der Platte drücken. Setzen Sie die Replikatorstifte vorsichtig auf die Oberfläche der Agarplatten. Bewegen Sie den Replikator in einer leichten kreisenden Bewegung, um viele Rasenflächen von etwa vier bis fünf Millimetern für jeden mutierten Stamm zu bilden.

Versiegeln Sie die PA14NR-Set-Masterplate mit einer neuen sterilen Aluminiumdichtung. Verwenden Sie eine Plattenrolle, um sicherzustellen, dass jede Vertiefung und die Ränder der Platte vollständig versiegelt sind. Setzen Sie die 96-Well-Masterplate wieder auf Trockeneis um.

Wischen Sie nach dem Umgang mit dem PA14NR-Set alle Arbeitsflächen mit 70 % Ethanol ab. Übertragen Sie die replizierte Agarplatte in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator und inkubieren Sie sie über Nacht. Stellen Sie vor Beginn dieses Vorgangs sicher, dass die Laminar-Flow-Haube frei von unnötigen Geräten ist, und schalten Sie das Haubengebläse mindestens 10 Minuten lang ein.

Wischen Sie die Oberflächen der Haube und alle Gegenstände, die sich in der Haube befinden, mit 70 % Ethanol ab. Füllen Sie mit einer elektronischen 12-Kanal-Pipette von 50 bis 1200 Mikrolitern jede Vertiefung eines 12-Milliliter-Deep-Well-Blocks mit 525 Mikrolitern LB-Flüssigbrühe, die geeignete Antibiotika enthält. Versiegeln Sie dann den Tiefbrunnenblock, bevor Sie ihn von der Laminar-Flow-Haube entfernen.

Übertragen Sie als Nächstes den mit Medien gefüllten Deep-Well-Block auf eine mit Ethanol abgewischte Tischplatte. Schaffen Sie ein steriles Feld mit einem Bunsenbrenner auf der Tischplatte und stellen Sie Behälter mit geeigneten Lösungen für die Sterilisation von Replikatorstiften auf. Tauchen Sie die Replikator-Pins in jede Lösung ein, wie zuvor gezeigt.

Sterilisieren Sie die Replikatorstifte durch Flammen. Kühlen Sie dann die Stifte ab, indem Sie sie 30 Sekunden lang in eine unbenutzte rechteckige Platte mit LB-Agar stecken. Platzieren Sie die Replikatorstifte vorsichtig auf der Agarplatte, die die gewachsenen Mutantenstämme enthält, und überprüfen Sie, ob die Stifte mit allen 96 Mutanten auf der Agarplatte in Kontakt stehen.

Tauchen Sie dann die Stifte fünf bis 10 Sekunden lang in die tiefen Vertiefungen mit LB-Flüssigbrühe. Vermeiden Sie es, die Seiten der Vertiefungen mit den Stiften zu berühren. Versiegeln Sie den Tiefbrunnenblock mit einer sterilen, atmungsaktiven Dichtungsmembran.

Verwenden Sie eine Plattenrolle, um sicherzustellen, dass jede einzelne Vertiefung richtig verschlossen ist. Wischen Sie alle Arbeitsflächen mit 70 % Ethanol ab, nachdem Sie das PA14NR-Set angefasst haben. Züchten Sie die inokulierten Flüssigkulturen in einem Hochgeschwindigkeitsschüttler bei 37 Grad Celsius und 950 U/min für 15 bis 16 Stunden.

Beginnen Sie damit, die Laminar-Flow-Haube zu reinigen und das Haubengebläse mindestens 10 Minuten lang einzuschalten. Wischen Sie alle Oberflächen der Haube und alle Gegenstände, die sich in der Haube befinden, mit 70 % Ethanol ab. Entfernen Sie die 96-Well-Platten aus der Plastikfolie.

Ziehen Sie das Plattenetikett für jede Platte ab, und platzieren Sie es entlang der Kante der Platte, die den Vertiefungen A1 bis H1 der Zielplatte am nächsten liegt. Heben Sie den Deckel der Zielplatte leicht an und platzieren Sie das Etikett an der unteren Kante, um das Etikett anzuzeigen, wenn die Platte mit einem Deckel abgedeckt ist. Entfernen Sie den Deep-Well-Block aus dem Hochgeschwindigkeitsschüttler und übertragen Sie den Block in die sterile Laminar-Flow-Haube.

Entfernen Sie vorsichtig die atmungsaktive Dichtungsmembran und ersetzen Sie sie durch eine Aluminiumdichtung. Drehen Sie den Tiefbrunnenblock mit sehr niedriger Geschwindigkeit herunter, um Kondenswasser aufzufangen. Da das Übertragen der Kulturen auf die Zielplatten das größte Risiko für eine mögliche Kontamination zwischen den Vertiefungen darstellt, ist es wichtig, alle Verfahren zur Aufrechterhaltung der Sterilität sorgfältig zu befolgen.

Setzen Sie den Tiefbrunnenblock wieder in die sterile Haube ein. Geben Sie mit einer elektronischen 12-Kanal-Pipette von 50 bis 1200 Mikrolitern und steril gefilterten Spitzen 525 Mikroliter Glycerin LB Flüssigbrühe in jede Vertiefung. Mischen Sie, indem Sie 300 Mikroliter dreimal vorsichtig mit einer elektronischen Pipette auf und ab pipettieren.

Berühren Sie die Spitzen an der Seite der Vertiefungen, bevor Sie die Spitzen injizieren, um ein Nachtropfen zu vermeiden. Füllen Sie die Pipette wieder mit neuen sterilen gefilterten Spitzen und füllen Sie die nächste Well-Reihe mit der Glycerin LB Flüssigbrühe-Mischung. Nachdem alle Vertiefungen mit der Glycerin-LB-Flüssigbrühemischung gefüllt wurden, ziehen Sie mit der elektronischen 12-Kanal-Pipette und den gefilterten Spitzen 900 Mikroliter Glycerin-Mutantenkulturmischung aus jeder Reihe des Deep-Well-Blocks heraus und geben Sie 150 Mikroliter in die Vertiefungen der entsprechenden Reihe in den Zielplatten ab, um sechs Kopien der Bibliotheksplatte zu erzeugen.

Verwenden Sie die sterile Aluminiumdichtung, um alle 96-Well-Zielplatten abzudecken, und verwenden Sie eine Plattenrolle, um die Plattenränder und alle Wells vollständig abzudichten. Achten Sie darauf, dass die Etikettenkennzeichnung nicht mit dem Aluminiumsiegel verdeckt wird. Nehmen Sie die versiegelten Platten von der Haube und legen Sie sie auf eine ebene, ebene Fläche in einen Gefrierschrank bei minus 80 Grad Celsius.

Wischen Sie alle Arbeitsflächen mit 70 % Ethanol ab, nachdem Sie die Bibliothek angefasst haben. Unter Verwendung des in diesem Video demonstrierten Protokolls wurden 12 Kopien des PA14NR-Sets repliziert, einschließlich Kontrollplatten, die aus vom Well-Typ PA14 inokulierten und nicht inokulierten Wells bestehen, die in einem voreingestellten Muster interkaliert wurden. Die Kontrollplatten wurden nach der Replikation auf LB-Agarplatten visuell inspiziert, um sicherzustellen, dass die erwarteten Wachstumsmuster vorhanden sind.

38 mutierte Stämme wurden nach dem Zufallsprinzip aus einer der neu generierten Kopien des PA14NR-Sets ausgewählt, und eine PCR-Amplifikation mit beliebigen Primern wurde durchgeführt, um die Identität der Transposon-Mutanten zu bestätigen. Die anschließende Sequenzierung der DNA-Fragmente bestätigte die Mutantenidentität von 35 der 38 getesteten Mutanten. Nach der Beherrschung dauert die Replikation der gesamten Bibliothek etwa 80 Stunden.

Bei der Anwendung dieses Protokolls ist es wichtig, jederzeit auf die Sterilität des Arbeitsbereichs zu achten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie qualitativ hochwertige Kopien des P14NR-Sets oder anderer Bakterienbibliotheken generieren können. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Pseudomonas gefährlich sein kann und bei der Durchführung dieses Protokolls immer persönliche Schutzausrüstung getragen werden sollte.

Dieses Protokoll bewahrt die nicht-redundante Mutantenbibliothek von Pseudomonas aeruginosa PA14, die nach wie vor eine wichtige Ressource ist, nicht nur für das Hochdurchsatz-Screening, sondern auch als Quelle für individuelle Mutationen in den meisten Genen von Pseudomonas aeruginosa.