Name: Replikation von bestellt, Nonredundant Bibliothek von Pseudomonas Aeruginosa Stamm PA14 Transposon Insertion Mutanten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-04T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 35 s
Description: Lernen Sie die Replikation der PA14NR-Mutantenbibliothek von Pseudomonas aeruginosa mit Qualitätskontrolle und Kontaminationsprävention. Dieses Protokoll ermöglicht Forschern die Erzeugung hochwertiger Kopien für mikrobiologische Studien.

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Wir möchten danken Lisa Philpotts der MGH Treadwell virtuelle Bibliothek für ihre Führung in der Datenbanksuche. Diese Arbeit wurde unterstützt von der Cystic Fibrosis Foundation (YONKER16G0 und HURLEY16G0) und NIH NIAID (BPH und ADE: R01 A1095338).

Die Autoren Berichten keine finanziellen Interessenkonflikte. Eliana Drenkard und Frederick Ausubel teilgenommen bei der Erstellung die PA14 nonredundant Transposon mutierte Bibliothek. Bryan Hurley und Lael Yonker derzeit Haus und verteilen die mutierte Bibliothek als Teil der Abteilung für Pädiatrie am Massachusetts General Hospital.

P. aeruginosa PA14NR ist eine wertvolle Ressource für die wissenschaftliche Gemeinschaft. Nach dem März 2017 Dataset aus Clarivate Analytics Essential Science Indicators Datenbank, Liberati Et al. (2006) 37, beschreibt den Bau des PA14NR-Sets, rangiert in den Top 1 % der Mikrobiologie Publikationen. Google Scholar berichtet über 600 Zitate von Liberati Et al. (2006) original-Manuskript ab August 2017. Die Bibliothek hat eine wichtige Rolle bei der Aufklärung der...

Pseudomonas Aeruginosa ist ein phänotypisch und genotypisiert vielfältig und anpassbar gramnegatives Bakterium in Boden, Wasser, sowie die meisten menschlichen Umgebungen und Mikroflora der Haut vorhanden. Im Vergleich zu vielen Bakterienarten, hat p. Aeruginosa eine relativ große Genom von 5,5-7 Mbp mit hohen G + C-Gehalt (65-67 %). Darüber hinaus ein erheblicher Teil seiner Gene metabolische Anpassungsfähigkeit beteiligt sind und sind Teil des regulatorischen Netzwerken ermöglicht große Flexibilität bei der Reaktion auf Umweltstress1. P. Aeruginosa drückt eine Fülle von Virulenzfaktoren, Neigung, Form Biofilme Exponate besitzt die Fähigkeit, Antworten durch mehrere Quorum-sensing-Wege zu koordinieren und zeigt eine bemerkenswerte Fähigkeit, Antibiotika-Resistenz zu entwickeln und Toleranz2,3,4,5,6,7,8. Diese Attribute stellen große Herausforderungen für die Behandlung von Infektionen durch p. Aeruginosa.
Chronische p. Aeruginosa Infektion können bei vielen Krankheitszuständen auftreten. Cystische Fibrose (CF), eine genetische Krankheit, die durch Mutation des Gens Cystic Fibrosis Transmembrane Leitwert Regulator (CFTR) verursacht wiederum eingedickten, infizierte Sekrete in den Atemwegen, progressive Bronchiektasen und letztlich zum Tod respiratorische Insuffizienz9. Erwachsenenalter sind die Mehrzahl der Patienten mit CF chronisch mit p. Aeruginosa, infiziert, eine Schlüsselrolle in der Morbidität und Mortalität dieser Krankheit10zugeordnet spielt. Darüber hinaus sind Patienten mit schweren Verbrennungen Verletzungen11, Tracheotomien12, Gelenkersatz13oder indwelling Katheter14 für p. Aeruginosa Infektion im Zusammenhang mit den Bakterien die Fähigkeit Form gefährdet Biofilme und Flucht zu Host Entzündungsreaktionen15. Kolonisierung weiter, auftritt ohne Konkurrenz, nachdem eine Multi-Antibiotika resistente oder tolerantere Bevölkerung durch Breitspektrum, sequentielle antimikrobielle Behandlung12,16,17 ausgewählt ist , 18. besseres Verständnis der Pathogenese von p. Aeruginosa haben erhebliche Auswirkungen auf zahlreiche Krankheitszustände.
Mehrere p. Aeruginosa klinische Isolaten, einschließlich Belastungen PAO1, PA103, PA14 und PAK, haben ausgiebig untersucht, um verschiedene Funktionen von p. Aeruginosa Pathogenese zu untersuchen. Stamm PA14 ist eine klinische Isolate, die gehört zu den häufigsten klonalen Gruppen weltweit19,20 und nicht ausgiebig im Labor passagiert. PA14is hoch virulenten in vertebrate Modelle der Infektion, mit einer bemerkenswerten Endotoxin Profil21, Pili Struktur22, Pathogenität Inseln23, Typ III-Sekretion System (SSTT), Zytotoxizität gegenüber Säugetieren Zellen24 und Profile in antibiotische Resistenz und Dauerhaftigkeit25. Darüber hinaus PA14 ist auch in zahlreichen Wirt-Pathogen-Modellsystemen hoch virulenten, einschließlich pflanzenblattes Infiltration Modelle26,27,Caenorhabditis Elegans Infektion Modelle28, 29, Insekt Modelle30,31, sowie Maus Lungenentzündung Modelle32,33 und Hautverbrennungen Modelle34.
Genomweite mutierte Bibliotheken sind Sammlungen von isogener Mutanten in nicht benötigten Gene, die sehr leistungsfähige Werkzeuge um die Biologie des Organismus zu verstehen, ermöglicht die Analyse der Genfunktion auf genomischer Ebene darstellen. Zwei in der Nähe von Sättigung Transposon Einfügung mutierten Bibliotheken gebaut in p. Aeruginosa gibt es derzeit für den Vertrieb. Die Einfügung Sehenswürdigkeiten der Transposons sind für beide Bibliotheken ermittelt worden. Diese sogenannten nonredundant Bibliotheken erleichtern genomweite Studien von Bakterienstämmen verringernd, erheblich Zeit und Kosten beteiligt Screening fußgelenkes zufällige Transposon Mutanten. P. Aeruginosa PAO1 Transposon mutierte Bibliothek, gebaut in der MPAO1 von Belastungen PAO1 mit Transposons ISPhoA/ hah zu isolieren und istLacZ/ hah35, wird kuratiert von Manoil Labor, Universität von Washington. Die Bibliothek besteht aus einer Sequenz verifiziert Sammlung von 9.437 Transposon-Mutanten, die große Genom deckt und enthält zwei Mutanten für die meisten Gene36. Informationen über die p. Aeruginosa PAO1 Transposon mutierten Bibliothek steht in der Öffentlichkeit, Internet zugänglichen Manoil Lab-Website unter http://www.gs.washington.edu/labs/manoil/libraryindex.htm zur Verfügung. P. Aeruginosa Stamm PA14 nonredundant Transposon Einfügung mutierten Bibliothek (PA14NR eingestellt) Baujahr Belastung PA14 mit Transposons MAR2xT7 und TnPhoA37 derzeit Department of Pediatrics verteilt wird am Massachusetts General Hospital. Das PA14NR-Set umfasst eine Sammlung von mehr als 5.800 Mutanten mit einzelnen Transposon Einfügungen in nicht benötigten Gene37. Details über den Bau des PA14NR-Sets sind in der Öffentlichkeit, Internet zugänglichen Website http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/home.cgi?section=NR_LIB beschrieben, die enthält auch eine Vielzahl von Online-Such-Tools zur Erleichterung der Nutzung des PA14NR Satz.
Das ursprüngliche PA14NR Set umfasste 5.459 Mutanten, ausgewählt aus einer umfangreichen Bibliothek von ca. 34.000 zufällige Transposon Einfügung Mutanten, die 4.596 vorhergesagten PA14 Gene entspricht 77 % aller vorhergesagten PA14 Gene37entsprechen. Seit dem Bau der Bibliothek im Jahr 2006 neue Mutanten hinzugefügt wurden, und derzeit das PA14NR Set beinhaltet mehr als 5.800 Mutanten-38 , die etwa 4.600 PA14 Gene darstellen. Die Mehrheit der PA14 Transposon Mutanten wurden in der Wildtyp Hintergrund37generiert. Einzelheiten über jedes Mitglied der mutierten Bibliothek, einschließlich genetischen Hintergrund gibt es entweder durch die Online-Datenbank zu suchen, oder durch das Herunterladen der Nonredundant Bibliothek-Tabellenkalkulation, beide Funktionen auf der Website PA14 (http:// pa14.MGH.Harvard.edu/cgi-bin/pa14/Home.cgi). Die Mehrheit der Mutanten entstanden mit Hilfe der MAR2xT7 (MrT7) Transposon, mit einer kleinen Gruppe mit der TnPhoA (PhoA) Transposon37erstellt. Jede Transposon hat eine Antibiotika-Resistenz-Kassette, die mutierten Auswahl mit Gentamicin (MrT7) oder Kanamycin (PhoA) ermöglicht. Die PA14NR Gruppe von Mutanten in 63 96-Well-Platten gespeichert und enthält zwei zusätzliche 96-Well-Steuerelement, die Platten, die aus Wildtyp PA14 beimpft und nicht inokulierten Brunnen Zwischenspiele in einem vorgegebenen Muster. Die 96-Well-Plattenformat gepaart mit der Online-Recherche-Tools erheblich erleichtert die kundenspezifische Entwicklung von screening-Tests, mit denen Benutzer auf einfache Weise Gene mutierten Phänotypen zugeordnet. Die Online-Such-Tools erleichtern auch die Suche und Auswahl von zusätzlichen relevanten Mutanten für weitere Studien erforderlich.
Die PA14 und PAO1 Transposon mutierten Bibliotheken sind sehr wichtige globale Ressourcen für die wissenschaftliche Gemeinschaft, und sie ergänzen einander in überprüfen die Funktion der unbekannte Gene und Wege von dieser bakteriellen Erreger. Zufälligerweise hat seit dem Bau der PAO1 und PA14 Transposon Mutation Bibliotheken, voll-DNA-Sequenzierung Genomanalyse viele p. Aeruginosa Isolate gezeigt, dass PAO1 und PA14 zu verschiedenen wichtigen Subclades von P. Aeruginosa gehören Phylogenie7,39,40,41. Da klinische p. Aeruginosa Isolate werden gefunden verteilt die Stammesgeschichte, die Tatsache, dass PAO1 und PA14 zu verschiedenen p. Aeruginosa gehören Untergruppen steigert den Wert der beiden Transposon Mutation Bibliotheken für vergleichende Studien.
Publikationen, beschreibt die Konstruktion und screening von bakteriellen mutierten Bibliotheken, einschließlich p. Aeruginosa Bibliotheken35,sind37,42, leicht zugänglich in der Literatur. Sind jedoch nach bestem Wissen und gewissen, keine veröffentlichten Protokolle beschreibt Einzelheiten der Verfahren und Techniken, die für die Replikation, Wartung und Validierung von bakteriellen mutierten Bibliotheken verfügbar.
Die in dieser Publikation beschriebenen Methodik beschreibt eine Reihe von drei Protokollen, die die Nutzung zu erleichtern und Wartung des PA14NR-Sets. Das erste Protokoll beschreibt Replikation der Bibliothek als Empfänger des PA14NR-Sets empfohlen. Das zweite Protokoll enthält Richtlinien für den Streifen, Anbau und Lagerung von einzelnen durch Mutation entstehende Variationen über das PA14NR-Set identifiziert. Das dritte Protokoll beschreibt qualitätskontrolltechniken, einschließlich PCR Verstärkung der Fragmente von Transposon Mutanten und anschließende Sequenzierung, mutierte Identität zu bestätigen. Dieser Satz von Protokollen kann auch für die Replikation und Wartung anderer Bakterien mutierten Bibliotheken oder Sammlungen angepasst werden. Die Replikation von bakteriellen mutierten Bibliotheken oder Sammlungen wird dringend empfohlen, zur Erhaltung der Integrität der "master-Kopie" (Originalversion erhalten). Replikation von mehreren Kopien der PA14NR-Set für die Routinelabor minimiert die Wahrscheinlichkeit der interwell Kontamination von der master-Kopie.

<table><tbody><tr><td>Materialien für die Bibliotheksreplikation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterile 96-Well-Gewebekultur, Karton mit 50</td><td>Corning Life Sciences</td><td>353072</td><td>über Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Sterile 96 Well Clear V-Bottom 2000&mu; L Deep Well Plates, Koffer mit 25</td><td>Corning Life Sciences</td><td>3960</td><td>via Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Nunc OmniTray (rechteckige Platten), Koffer mit 60</td><td>Thermo Scientific Rochester</td><td>242811</td><td>via Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Rechteckige Eispfanne, Midi (4L)</td><td>Corning Life Sciences</td><td>432104</td><td>via Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Secure-Gard Cone Mask, Koffer mit 300</td><td>Cardinal Health</td><td>AT7509</td><td>via Fisher Scientific</td></tr><tr><td>AluminaSeal, Packung mit 100</td><td>Stück Diversified Biotech</td><td>ALUM-100</td><td>über Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Breathe-Easy Membran, Packung mit 100</td><td>Stück Diversified</td><td>Biotech BEM-1</td><td>über Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Steril, einzeln verpackt, 50 ml Lösungstrog/Reagenzreservoir, Karton mit 100</td><td>Stück Sorenson</td><td>S50100</td><td>über Westnet Incorporated</td></tr><tr><td>Plattenwalze</td><td>VWR</td><td>60941-118</td><td>via VWR</td></tr><tr><td>Cryo Laser Labels - CRYOLAZRTAG 2.64" x 0.277", Packung mit 16 Blatt</td><td>GA International</td><td>RCL-11T1-WH</td><td>via Labtag.com (Schablone zum Drucken auch bei Labtag.com erhältlich)</td></tr><tr><td>96-Well-Replikator</td><td>V & P Scientific, Inc.</td><td>Custom 407C, 3,18 mm Stiftdurchmesser, 57 mm lang</td><td>über V & P Scientific, Inc.</td></tr><tr><td>Multitron Pro, 3mm Schüttelinkumeter</td><td>Infors HT</td><td>l10003P</td><td>über Infors HT</td></tr><tr><td>Picus 12 Kanal 50-1200&mu; L Elektronische Pipette</td><td>Sartorius</td><td>735491PR</td><td>über Sartorius</td></tr><tr><td>Filterspitzen 50-1200&mu; L, Packung mit 960</td><td>Biohit</td><td>14-559-512</td><td>via Fisher Scientific; verwenden Sie elektronische Mehrkanal-kompatible Spitzen</td></tr><tr><td>Trockeneis</td><td>Anwenderspezifisch Anbieter<</td><td></td><td></td></tr><tr><td>em>Materialien für die individuelle Mutantenlagerung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Premium Mikrozentrifugenröhrchen: 1,5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-130</td><td>via Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Pipetten (P1000, P200, P20, P2)</td><td>Gilson</td><td>F167370</td><td>über Gilson</td></tr><tr><td>Materialien für die Qualitätskontrolle PCR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Premium Mikrozentrifugenröhrchen: 1,5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-130</td><td>über Fisher</td></tr><tr><td>Scientific NanoDrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-2000</td><td>über ThermoFisher</td></tr><tr><td>PCR Thermocycler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Omnistrips PCR-Röhrchen mit gewölbten Deckeln</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB0404</td><td>über Fisher Scientific</td></tr><tr><td>ART Barrier Pipettenspitzen mit geringer Retention (10 μl, 100 μl, 1000 μl)</td><td>Molecular BioProducts, Inc.</td><td>Z676543 (10 μl), Z676713 (100 μl), Z676802 (1000 μl)</td> <td>über Sigma-Aldrich-Pipetten</td></tr><tr><td>(P1000, P200, P20, P2)</td><td>Gilson</td><td>F167370</td><td>über Gilson</td></tr><tr><td>Fisherbrand Premium Mikrozentrifugenröhrchen: 1,5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-130</td><td>über Fisher Scientific</td></tr><tr><td>MasterPure DNA-Aufreinigungskit</td><td>Epizentrum</td><td>MCD85201</td><td>über Epicentre Technologies Corp</td></tr><tr><td>GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder, gebrauchsfertig</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM1333</td><td>über ThermoFisher</td></tr><tr><td>RediLoad Ladepuffer</td><td>Invitrogen</td><td>750026</td><td>über ThermoFisher</td></tr><tr><td>Chemicals<</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>em>Chemicals for Library and Individual Mutant Storage</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glycerol MB Grade, 1L</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5516</td><td>über Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>LB Bouillon</td><td></td><td></td><td>pro 1L dH2O: 10g Trypton, 5g Hefeextrakt, 5g NaCl, 1ml 1N NaOH (Aktuelle Protokolle in der Molekularbiologie.&nbsp; Wiley, 1994.)</td></tr><tr><td>Trypton</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T7293</td><td>über Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Hefeextrakt</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y1625</td><td>über Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td>über Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Natriumhydroxid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8045</td><td>über Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>LB&nbsp; Agar</td><td></td><td></td><td>Siehe Zubereitung oben, fügen Sie 15g Bacto Agar hinzu</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5306</td><td>über Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Gentamicin Sulfat, 10g</td><td>BioReagent</td><td>1405-41-0</td><td>über Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Kanamycin sulfat</td><td>Gibco</td><td>11815024</td><td>über ThermoFisher</td></tr><tr><td>Ethanol, 190 proof</td><td>Dekon</td><td>04-355-221</td><td>über Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Chemicals for Quality Control PCR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primers</td><td>User-preferred vendor</td><td></td><td>Siehe Primer in Tabelle 3</td></tr><tr><td>Corning cellgro Molecular Biology Grade Water</td><td>Corning</td><td>46000CV</td><td>via Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Taq Polymerase Buffer</td><td>Invitrogen</td><td>10342020</td><td>via ThermoFisher</td></tr><tr><td>Taq DNA Polymerase, rekombinante</td><td>Invitrogen</td><td>10342020</td><td>via ThermoFisher</td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Invitrogen</td><td>10297018</td><td>über ThermoFisher</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>A9539</td><td>über Sigma-Aldrich</td></tr></tbody></table>

replikation von bestellt, nonredundant bibliothek von pseudomonas aeruginosa stamm pa14 transposon insertion mutanten

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Pseudomonas Aeruginosa ist ein phänotypisch und genotypisiert vielfältig und anpassbar Gramnegative Bakterium in der menschlichen Umgebung allgegenwärtig. P. Aeruginosa ist in der Lage, Biofilme bilden, Antibiotika-Resistenz zu entwickeln, produzieren Virulenzfaktoren und schnell entwickeln im Verlauf einer chronischen Infektion. So können p. Aeruginosa führen, wodurch erhebliche Morbidität in bestimmten Patientengruppen sowohl akute und chronische, zur Behandlung von Infektionen, schwierig. P. Aeruginosa Sorte PA14 ist eine menschliche klinische Isolat mit einer erhaltenen Genom-Struktur, die eine Vielzahl von Säugetieren und nonvertebrate Gastgeber PA14 eine attraktive Belastung für das Studium dieser Erreger infiziert. Im Jahr 2006 wurde eine nonredundant Transposon Einfügung mutierten Bibliothek mit 5.459 Mutanten entsprechend 4.596 vorhergesagten PA14 Gene generiert. Seitdem hat die Verteilung der PA14 Bibliothek die Forschungsgemeinschaft zum besseren Verständnis der Funktion einzelner Gene und komplexe Pfade von p. Aeruginosaerlaubt. Erhaltung der Integrität der Bibliothek durch den Replikationsprozess erfordert ordnungsgemäße Handhabung und präzise Techniken. Zu diesem Zweck stellt diese Handschrift Protokolle, die im Detail beschreiben die Schritte in Bibliothek Replikation, Bibliothek-Qualitätskontrolle und ordnungsgemäße Lagerung der einzelnen Mutanten beteiligt.

Zwölf neue Kopien des PA14NR-Sets wurden wiederholt mit Protokoll ich und eine Qualitätskontrolle Beurteilung der neuen Kopien erzeugt wurde mit Protokoll III durchgeführt.
PA14NR Set mutierte Platten zusammen mit Steuerplatten, bestehen aus Wildtyp PA14 beimpft und nicht inokulierten Brunnen in einem vorgegebenen Muster (Abbildung 4A) eingelagert, wurden wiederholt nach Methology beschrieben im Pro...

Pseudomonas Aeruginosa Infektion verursacht erheblichen Morbidität in gefährdeten Gastgeber. Die nonredundant Transposon Einfügung mutierten Bibliothek von p. Aeruginosa Belastungen PA14, als PA14NR festgelegt, vereinfacht die Analyse der Gen-Funktionalität in zahlreichen Prozessen. Hier ist ein Protokoll, qualitativ hochwertige Kopien der PA14NR Set mutierten Bibliothek zu generieren.

Replikation von bestellt, Nonredundant Bibliothek von Pseudomonas Aeruginosa Stamm PA14 Transposon Insertion Mutanten

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, qualitativ hochwertige Kopien der geordneten, nicht redundanten Transposon-Mutantenbibliothek des Pseudomonas aeruginosa-Stammes PA14 zu generieren, die als PA14NR-Set bezeichnet wird. Dieses Protokoll behält die Integrität des PA14NR-Satzes während der Replikation bei und erzeugt qualitativ hochwertige Kopien dieser Bibliothek. Der Hauptvorteil dieses Protokolls besteht darin, dass es eine detaillierte Beschreibung aller Schritte bietet, die an der Bibliotheksreplikation, der Qualitätskontrolle und der ordnungsgemäßen Speicherung einzelner Mutanten beteiligt sind.Obwohl dieses Protokoll für die Replikation des P14NR-Sets entwickelt wurde, kann es angepasst werden, um andere Bakterienbibliotheken zu replizieren. Im Allgemeinen haben Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten, da das Risiko einer Kontamination während des Replikationsprozesses besteht. Daher enthält dieses Protokoll detaillierte Schritt-für-Schritt-Anweisungen, um dieses Risiko zu verringern.Unser Labor vertreibt das PA14NR-Set an die weltweite wissenschaftliche Gemeinschaft. Es wird empfohlen, die Bibliotheken vom Endbenutzer zu repliz

replication-ordered-nonredundant-library-pseudomonas-aeruginosa

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Quelle: Kazi, M. I., et. al., Generierung von Transposon-Insertionsbibliotheken in gramnegativen Bakterien für die Hochdurchsatz-Sequenzierung. J. Vis. exp. (2020)Dieses Video zeigt die Selektion, Quantifizierung und Konservierung von Gram-negativen Empfängerbakterien, die Transposon-Insertionen auf der Grundlage von Kanamycin-Resistenz tragen.

Isolierung gramnegativer Bakterien mit genomischen Transposon-Insertionen

Hier beschreiben wir ein Protokoll, mit dem Mini-himar1 mariner Transposon-vermittelte Mutagenese zur Erzeugung einer hohen Dichte Insertionsmutante Bibliothek-Bildschirm, zu isolieren und zu identifizieren Roman Alginat-Regulatoren in der prototypischen Pseudomonas aeruginosa Stamm PAO1.

Identifizierung neuer Gene, die mit Alginat-Produktion verbunden in<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Mit Mini-<em&gt; Himar1</em&gt; Mariner Transposon-vermittelte Mutagenese

Enterobacter sp. Ysu wächst in Glucose-Minimalsalzmedium. Auxotrophe werden durch Transformation mit einem transposome die zufällig fügt sich in das Wirtsgenom erzeugt. Mutanten werden durch Replika-Plattierung aus komplexen Medium, um Minimalmedium gefunden. Unterbrochen Gene durch Gen Rettungs- und Sequenzierung identifiziert.

Erzeugung Enterobacter Sp. Ysu Auxotrophe Mit Transposon-Mutagenese

Hier war die Macht der ein Transposon-vermittelten zufällige einführen eines nicht-kodierende DNA-Elements verwendet, um seine optimale chromosomalen Position zu lösen.

Bestimmung der optimalen chromosomalen Speicherorte für eine DNA-Element in Escherichia coli mit einem neuartigen Transposon-vermittelte Ansatz

Präsentiert hier ist eine einfache Methode zum Erstellen einer High-Density Transposon Einfügung Bibliothek in Escherichia coli oder Shigella Flexneri mit bakteriellen Konjugation. Dieses Protokoll ermöglicht die Erstellung einer Sammlung von Hunderten von Tausenden von einzigartigen Mutanten in Bakterien durch die zufällige genomische Einfügung ein Transposon.

Schaffung einer dichten Transposon Insertion Bibliothek verwenden bakterielle Konjugation in Enterobacterial Stämme wie Escherichia Coli oder Shigella flexneri

Wir beschreiben hier eine Technik, die verbindet Transposon Mutagenese mit Hochdurchsatz-Sequenzierung zu identifizieren und quantifizieren Transposon Leptospiral Mutanten im Gewebe nach einem Zweikampf von Hamstern. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um Bildschirm Mutanten für überleben und Verbreitung bei Tieren und kann auch auf in-vitro- Studien angewendet werden.

Hochdurchsatz-parallele Sequenzierung Maßnahme Fitness Leptospira Interrogans Transposon Insertion Mutanten während Golden syrischen Hamster Infektion

Hier präsentieren wir eine experimentelle Methode, um die Rolle des multicopy Plasmide in der Entwicklung von Antibiotika-Resistenzen zu testen.

Testen die Rolle des Multicopy Plasmide in der Entwicklung von Antibiotika-Resistenzen

Wir beschreiben eine Methode zur Generierung von sättigungsverstärkenden Mutationsbibliotheken in gramnegativen Bakterien und der anschließenden Herstellung von DNA-Amplikonbibliotheken für die Sequenzierung mit hohem Durchsatz. Als Beispiel konzentrieren wir uns auf den ESKAPE-Erreger Acinetobacter baumannii, aber dieses Protokoll ist für eine Vielzahl von Gram-negativen Organismen zugänglich.

Generieren von Transposon-Einfügungsbibliotheken in gramnegativen Bakterien für die Sequenzierung mit hohem Durchsatz

Dieses Protokoll stellt eine schnelle und effiziente Methode zur Identifizierung genetischer Faktoren dar, die an verschiedenen Arten von Motilitäten bei Pseudomonas aeruginosa beteiligt sind.

Hochdurchsatzmethode zur Beobachtung von Motilitätsphänotypen bei Pseudomonas aeruginosa

Protokoll beschreibt die Anwendung einer Messzelle für wachsende und Analyse von mikrobiellen Biofilmen für konfokale Laser Scanning Mikroskopie (CLSM).

Pseudomonas aeruginosa und Saccharomyces cerevisiae Biofilm im Flow Cells

Lernen Sie die Replikation der PA14NR-Mutantenbibliothek von Pseudomonas aeruginosa mit Qualitätskontrolle und Kontaminationsprävention. Dieses Protokoll ermöglicht Forschern die Erzeugung hochwertiger Kopien für mikrobiologische Studien.

Replikation von bestellt, Nonredundant Bibliothek von Pseudomonas Aeruginosa Stamm PA14 Transposon Insertion Mutanten

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