Name: Methode für High-Speed Strecke Verletzungen der menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleitet Neuronen in einem 96-Well-Format (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-20T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Lernen Sie eine Methode zur Erzeugung von Dehnungsverletzungen an humanen iPS-Zell-abgeleiteten Neuronen im 96-Well-Format. Dieses Modell ermöglicht hochdurchsatzfähige phänotypische Arzneimittelscreenings für Neurotrauma-Forschung.

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Diese Arbeit wird teilweise durch ein Stipendium der National Institutes of Health (R21NS098129) unterstützt. Wir würden gerne bestätigen hervorragende technische Unterstützung von SueSan Chen, Jonathan Tan, Courtney Cavanaugh, Shi Kai Ng und Feng Yuan Bu, der entwarf und baute eine Struktur zur Unterstützung der Lichter bei high-Speed bildgebenden Experimenten in dieser Handschrift beschrieben verwendet .

<ol><li>Faul, M., L, X. u, Wald, M. M., Coronado, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFaul%2C+M+%22Traumatic+brain+injury+in+the+United+States%3A+emergency+department+visits%2C+hospitalizations%2C+and+deaths%2C+2002-2006%22">Traumatic brain injury in the United States: emergency department visits, hospitalizations, and deaths, 2002-2006</a>. , (2010).</li>
<li>Kabadi, S. V., Faden, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+strategies+for+traumatic+brain+injury%3A+improving+clinical+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective strategies for traumatic brain injury: improving clinical translation.</a> Int J Mol Sci. 15 (1), 1216-1236 (2014).</li>
<li>Kiskinis, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathways+disrupted+in+human+ALS+motor+neurons+identified+through+genetic+correction+of+mutant+SOD1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Pathways disrupted in human ALS motor neurons identified through genetic correction of mutant SOD1.</a> Cell Stem Cell. 14 (6), 781-795 (2014).</li>
<li>Smith, D. H., Wolf, J. A., Lusardi, T. A., Lee, V. M., Meaney, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+tolerance+and+delayed+elastic+response+of+cultured+axons+to+dynamic+stretch+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">High tolerance and delayed elastic response of cultured axons to dynamic stretch injury.</a> J Neurosci. 19 (11), 4263-4269 (1999).</li>
<li>Wolf, J. A., Stys, P. K., Lusardi, T., Meaney, D., Smith, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traumatic+axonal+injury+induces+calcium+influx+modulated+by+tetrodotoxin-sensitive+sodium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Traumatic axonal injury induces calcium influx modulated by tetrodotoxin-sensitive sodium channels.</a> J Neurosci. 21 (6), 1923-1930 (2001).</li>
<li>Lusardi, T. A., Wolf, J. A., Putt, M. E., Smith, D. H., Meaney, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+acute+calcium+influx+after+mechanical+stretch+injury+in+vitro+on+the+viability+of+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Effect of acute calcium influx after mechanical stretch injury in vitro on the viability of hippocampal neurons.</a> J Neurotrauma. 21 (1), 61-72 (2004).</li>
<li>Magou, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+a+high+throughput+axon+injury+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Engineering a high throughput axon injury system.</a> J Neurotrauma. 28 (11), 2203-2218 (2011).</li>
<li>Morrison, B. 3rd, Cater, H. L., Benham, C. D., Sundstrom, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+model+of+traumatic+brain+injury+utilising+two-dimensional+stretch+of+organotypic+hippocampal+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">An in vitro model of traumatic brain injury utilising two-dimensional stretch of organotypic hippocampal slice cultures.</a> J Neurosci Methods. 150 (2), 192-201 (2006).</li>
<li>Cater, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretch-induced+injury+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures+reproduces+in+vivo+post-traumatic+neurodegeneration%3A+role+of+glutamate+receptors+and+voltage-dependent+calcium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Stretch-induced injury in organotypic hippocampal slice cultures reproduces in vivo post-traumatic neurodegeneration: role of glutamate receptors and voltage-dependent calcium channels.</a> J Neurochem. 101 (2), 434-447 (2007).</li>
<li>Kang, W. H., Morrison, B. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+tolerance+to+mechanical+deformation+developed+from+organotypic+hippocampal+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Biomech+Model+Mechanobiol%22%5BJournal%5D)">Functional tolerance to mechanical deformation developed from organotypic hippocampal slice cultures.</a> Biomech Model Mechanobiol. 14 (3), 561-575 (2015).</li>
<li>Sherman, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretch+Injury+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell+Derived+Neurons+in+a+96+Well+Format%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell Derived Neurons in a 96 Well Format.</a> Sci Rep. 6, 34097(2016).</li>
<li>Hardy, W. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+Head+Injury+Mechanisms+Using+Neutral+Density+Technology+and+High-Speed+Biplanar+X-ray%5BTitle%5D)+AND+%22Stapp+Car+Crash+J%22%5BJournal%5D)">Investigation of Head Injury Mechanisms Using Neutral Density Technology and High-Speed Biplanar X-ray.</a> Stapp Car Crash J. 45, 337-368 (2001).</li>
<li>Hardy, W. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+study+of+the+response+of+the+human+cadaver+head+to+impact%5BTitle%5D)+AND+%22Stapp+Car+Crash+J%22%5BJournal%5D)">A study of the response of the human cadaver head to impact.</a> Stapp Car Crash J. 51, 17-80 (2007).</li>
<li>Sunkara, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+room+temperature+bonding+of+thermoplastics+and+poly%28dimethylsiloxane%29%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Simple room temperature bonding of thermoplastics and poly(dimethylsiloxane).</a> Lab Chip. 11 (5), 962-965 (2011).</li>
<li>Johnson, V. E., Stewart, W., Smith, D. H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22285252">Axonal pathology in traumatic brain injury.</a> Exp Neurol. 246, 35-43 (2013).</li>
<li>Lacour, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flexible+and+stretchable+micro-electrodes+for+in+vitro+and+in+vivo+neural+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Biol+Eng+Comput%22%5BJournal%5D)">Flexible and stretchable micro-electrodes for in vitro and in vivo neural interfaces.</a> Med Biol Eng Comput. 48 (10), 945-954 (2010).</li>
<li>Yu, Z., Morrison, B. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+mild+traumatic+brain+injury+induces+functional+alteration+of+the+developing+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Experimental mild traumatic brain injury induces functional alteration of the developing hippocampus.</a> J Neurophysiol. 103 (1), 499-510 (2010).</li>
<li>Tcw, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Efficient+Platform+for+Astrocyte+Differentiation+from+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">An Efficient Platform for Astrocyte Differentiation from Human Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Stem Cell Reports. 9 (2), 600-614 (2017).</li>
<li>Muffat, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+derivation+of+microglia-like+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Efficient derivation of microglia-like cells from human pluripotent stem cells.</a> Nat Med. 22 (11), 1358-1367 (2016).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Der Schlüssel zur Erlangung eines konsistenten, wendet Biofidelic Phänotyp in diesem Modell eine konsistente Biofidelic mechanische Beleidigung. Dieses Modell kann Puls Dauer so kurz wie 10-15 ms, generieren die Pulsdauern für menschliche Kopf Einflüsse nach cadaveric Experimente12,13ähneln. Die Konsistenz dieser Beleidigung richtet sich nach der Ausrichtung der Platte mit dem Eindringkörper Block und konsequente Schmierung der Eindringkörper. Wenn der Eindringkörper Block gut ausgerichtet ist, gibt es kein Trend in der angewandten Belastung in Zeilen oder Spalten (Abbildung 2). Eine dünne Schicht Gleitmittel erstellt in der Regel weniger Reibung als eine dicke Schicht und zähe Fette sind nicht empfohlen, da sie das Silikon foul und behindern den Durchgang des Lichtes während Mikroskopie. Die derzeitige Phase Verdrängung Amplitude kann wesentlich unterschreiten die zwangsverschiebung Amplitude wenn viele Eindringkörper verwendet werden, und die vorgeschriebenen Bühne Verdrängung Amplitude ist groß (> 3 mm). Jedoch während die tatsächliche Verschiebung kleiner als die zwangsverschiebung an große Amplituden ist, bleibt es wiederholbar (Abb. 2 b). Also, große, tatsächliche Verschiebungen Amplituden zuverlässig erhalten Sie durch einen vorgeschriebenen Wert über den gewünschten Wert eingeben. Verdrängung Amplitude zählt nur weil es einen leicht aufgezeichneten Proxy für die Peak-Membran-Sorte, die direkt die mechanische Beleidigung misst, die Pathologie induziert. Daher ist für die Bestimmung der Membran Belastung von Bühne Verschiebung beschriebene Verfahren entscheidend. Dieser Prozess sollte wiederholt werden, wenn alle wichtigen Änderungen an das System, das die Interaktion zwischen der Platte und der Eindringkörper, zum Beispiel, wenn verschiedene beeinflussen Durchmesser Eindringkörper, verschiedene Eindringkörper Materialien oder Beschichtungen oder verschiedene Arten von Silikon Talsohle Teller dienen. Der Prozess der Neuausrichtung des Eindringkörpers Blocks und Bestimmung der Nullstellung sollte zu Beginn jedes Experiment wiederholt werden. Eine schematische Darstellung der ausdehnende Vorrichtung ist in Abbildung 1dargestellt. CAD-Modelle benötigt, um das Gerät zu reproduzieren sind als zusätzliches Material zur Verfügung gestellt: "Verletzung Gerät - Vollversammlung - generische 3D. SCHRITT "; die zugehörige Stückliste zur Verfügung gestellt alsergänzenden Tabelle1: Custom gebaut Geräte - BOM.xlsx. Siehe auch ergänzende 2 96 gut Tischplatte _loader – Belegung Verdrahtung Diagram.xlsx, beschreibt die Verkabelung Anschlüsse, die verschiedenen Komponenten der Systeme zu verbinden. "Interconnector_circuit_board.dip" beschreibt eine Platine, die die Kabel miteinander verbindet.
Wenn das Gerät mit der Bühne in der Mitte des Bewegungsbereichs deaktiviert ist, wird die Bühne bewegen, nachdem die Stromversorgung unterbrochen ist, da es federbelastet ist. Wenn die Stromversorgung wiederhergestellt ist, erkennt die Feedback-Schleife einen großen Unterschied zwischen der letzten bekannten vorgeschriebenen Position und die aktuelle Position. Dadurch wird die Bühne plötzlich zu bewegen, um die Position war es in, wenn das Gerät ausgeschaltet wurde. Dieser plötzliche Bewegungen kann Fehler in der Ausgabe des Encoders, verursachen, so darauf geachtet werden, sollte um das Gerät zu deaktivieren, nur dann, wenn es in seiner unpowered Position an der Spitze des Bewegungsbereichs ruht.
Die Herstellung Klemme dient zur Platte Körper und Silikon unten in einer Art und Weise zusammenzubringen, die optimale Verklebung ermöglicht. Zu diesem Zweck gibt es drei wichtige Funktionen im Design präsentiert die zusätzliche Datei "Presse sterben - generische 3D. SCHRITT ". Erstens ist die Klemme Kennzeichenhalter Körper parallel zum Boden Silikon. Wenn dies richtig gebaut wird, erfordert es keine Anpassung nach der Ersteinrichtung. Zweitens bietet die Schicht aus Schaumstoff in die Klemme eine kleine Menge der Compliance unter der Platte vollständig starres System einen plötzlichen Anstieg von NULL Spannkraft auf unendliche Spannkraft theoretisch erleben würden, wenn die Klemme geschlossen wurde. Die Position der Querlatte und Schraube der Klemme sind verstellbar, so dass der Abstand zwischen den beiden Seiten der Schelle fein abgestimmt werden kann.
Alle Anstrengungen sollten zu einem hellen, weißen Hintergrund hinter dem Punkt gut unten während der Belastung Charakterisierung Experimente erfolgen. Je besser der Kontrast in diesen Bildern, desto leichter wird es, automatisieren Sie den Prozess zur Messung der Höhe und Breite des Punktes, der mühsam werden kann für einen menschlichen Operator eine große Experiment zu analysieren sein. Hochgeschwindigkeits-Videographie der Unterseite eines Brunnens in einer 96-Well-Platte stellt Herausforderungen, da die Wände des Brunnens tendenziell Schatten werfen. Die Verwendung einer Lichtkuppel oder axiale Streulicht, die entlang der Sichtlinie der Kamera beleuchten kann, ohne das Bild verdunkelt eliminiert Schatten oder spiegelnde Reflexionen, die mit einer herkömmlichen Lichtquelle entstehen würden. Die hellste verfügbare Lichtquelle sollte verwendet werden, da heller Beleuchtung Bilder mit einer kurzen Belichtungszeit erworben werden kann. Kurze Belichtungszeiten zu Bewegungsunschärfe minimieren. Aktualisieren der Leuchtdioden (LEDs) in der axialen Streulicht ermöglicht kürzere Belichtungszeiten bei High-Speed-video Akquisition. Die LEDs können durch Öffnen der axialen Streulicht, entfernen die Aktie LEDs aufgerüstet werden, Montage 4 high-Power LED arrays in den hinteren Bereich mit LEDs Inhaber, Anschluss an eine Konstante Stromversorgung und Zusammenbau der axialen Streulicht (siehe Tabelle des Materialien für Katalog-Nummern). Der Nachteil der Modernisierung der LEDs ist, dass die passiv gekühlten LEDs für mehr als ein paar Sekunden durch die Gefahr der Überhitzung eingehalten werden können. Daher ist ein anderes Licht für die Ausrichtung der Post-Block und Kamera Anpassung erforderlich.
Die vorgestellte Methode zur Quantifizierung der Membran Belastung durch die Messung der Ausdehnung eines Punktes auf der Membran gestempelt ist relativ grob, aber können für mehrere Bohrlöcher in einer robusten Weise skalieren. Stamm-Bereich gut unten kann etwas ausführlicher mit digitaler Bildkorrelation charakterisiert werden. Diese Technik beinhaltet die gesprenkelten Strahlbild auf den Sockel des Brunnens und dann imaging bei High-Speed-während der Verformung. Kommerzieller Software lässt dann Stamm an jedem Punkt im Bild durch die Verfolgung der Entwicklung des gesprenkelten Musters zu quantifizieren.
Dieses Protokoll stellt einen facettenreiche, klinisch relevante, Stretch Verletzungen Phänotyp in HiPSCNs. Zelltod, Neurit Degeneration und Neurit Sicken sind alle gut dokumentierte Folgeerscheinungen von TBI bei Menschen und Tiermodelle15. Der Schlüssel zum Erfolg in diesem Modell ist zur Gründung und Aufrechterhaltung gesunde Kulturen. Im Allgemeinen ist ein Zelle Kultur Protokoll mit herkömmlichen starren Platten entwickelt eine lohnende Ausgangspunkt für dehnbare Platte Kultur. Allerdings muss immer die Möglichkeit, dass die fraglichen Zellen anders auf Silikon reagiert ggf. berücksichtigt werden. Dies gilt insbesondere für HiPSCNs, die sehr empfindlich auf Kulturbedingungen sind. Einige Beispiele für die Optimierung der Zellkonzentration Dichte und Laminin werden im Abschnitt Vertreter Ergebnisse (Abbildung 3, Abbildung 4) geliefert. Aktivierung des Silikons mit Plasmabehandlung ist von entscheidender Bedeutung. Silikon ist hydrophob und Plattierung; in seinem natürlichen Zustand wird es nicht an Laminin oder anderen Molekülen zur Förderung Zellhaftung binden. Plasmabehandlung rendert die Oberfläche hydrophil und reaktive Gruppen macht. Diese Änderungen ermöglichen Adhäsionsmoleküle an das Silikon zu binden und zu fördern Zellhaftung. Es ist wichtig zu beachten, dass die Wirkung der Plasma-Behandlung innerhalb von Minuten zerstreut, es sei denn, die Oberfläche in Flüssigkeit eingetaucht ist, und so Verfahren, bei denen die aktivierte Oberfläche Trocknen so schnell wie möglich durchgeführt werden sollte. Eine einfache Möglichkeit zu prüfen, ob die Wirkung der Plasmabehandlung abgeklungen ist ist ein Tröpfchen des Wassers auf der Oberfläche zu platzieren. Auf unbehandelten Silikon wird das Droplet, Perle, während auf Plasma behandelt Silikon, es verteilt wird. Mit der HiPSCNs, die wir verwendet (siehe Tabelle der Materialien), der Hersteller empfiehlt die Laminin mit der Zellsuspension als Pre-Beschichtung hinzufügen. Dieses Protokoll wurde dieser Ansatz erfolgreich integriert. Zwar die Segmentierung in der Theorie mit open-Source-Software oder allgemeine Programmiersprachen, erreicht werden kann, ist ein hohes Maß an Kompetenz mit diesen Tools erforderlich, um gute Ergebnisse zu erzielen. Neuriten sind häufig schwer zu Hintergrundsignal unterscheiden, weil sie so schlank sind. Wir empfehlen daher, die Nutzung der kommerziellen Software-Tools, die von hohen Inhalt Mikroskopie Unternehmen mit speziellen Modulen zur Segmentierung und Quantifizierung von Neuronen, verteilt, wenn sie verfügbar sind. Auch mit kommerzieller Software ist es ratsam, Exportieren von Bildern der Segmentierung, visuell Richtigkeit zu überprüfen.
Es gibt einige Einschränkungen, die verbunden sind mit der Arbeit in dehnbare Platten im Vergleich mit konventionellen, starren Platten zu arbeiten. Dehnbare Platten können wie gewohnt mit Luft Ziele abgebildet werden. Bildgebung mit Immersion Ziele ist jedoch sehr schwierig. Objektiv-Öl kann das Silikon beschädigen. Darüber hinaus übt das Ziel Druck auf die Silikonmembran, wie es nach oben bewegt. Dieser Druck verdrängt die Membran vertikal, macht es schwierig, die Probe in den Mittelpunkt zu rücken. Die silikonmembranen derzeit verwendet in der Herstellung der Platten sind etwa 250 µm dick. Diese Dicke überschreitet die Brennweite der vielen high-Power, Eintauchen Ziele. Besondere Sorgfalt müssen die Membranen lag perfekt flach vor spannen um die Ebenheit erforderlich für die Mikroskopie zu erreichen. Autofokus-Systeme können Abweichungen in der Ebenheit der fertigen Platte zu einem gewissen Grad ausgleichen. Zukünftige Versionen des Protokolls können die Membran vor Spannung, bevor es an die Platte oben nach Ebenheit gewährleistet gebunden ist. Das Klebstoff-freie Verfahren für die Verklebung der Silikonmembran, die Platte oben14 gilt als eine wichtige Stärke des aktuellen Protokolls. Es eliminiert das Risiko von Neurotoxizität von den Kleber als auch Abweichungen in Ebenheit durch ungleichmäßige Dicke der Klebstoffschicht.
Multi-Elektroden werden häufig in Experimenten mit HiPSCNs verwendet, um ihre Reife und Funktionalität zu bewerten. Leider sind diese Systeme nicht kompatibel mit diesem Modell, denn die Zelle anzuchtsubstrat starr. Es ist möglich eine dehnbare Multi-Elektroden-Array zu erstellen, obwohl dies bisher nur in einem einzigen gut nachgewiesen format16,17. Beachten Sie, dass Eindringkörper einzeln aus dem Eindringkörper Block entfernt werden können, so dass einige Brunnen nicht eingerückt sind und als Shams dienen können. Entfernen des Eindringkörpers Einzug verhindert aber nicht vollständig beseitigen, mechanische laden, da gibt es noch träge Bewegung der Flüssigkeit in den Vertiefungen, während die Bühne bewegt. Es lohnt sich vergleichen diese Brunnen, Brunnen in Platten, die nie Gegenstand Bühne Bewegung um einen pathologischen Einfluss der flüssigen Bewegung zu messen waren. Das Array der Eindringkörper im Block sollten auch Bisymmetric (symmetrische von vorne nach hinten und seitlich). Diese Vorsichtsmaßnahme wird sichergestellt, dass die Platte gleichmäßig während der Einrückung, geladen wird, so dass die Bühne nicht zur Seite kippen und verursachen die Stäbe in der Lagerung zu binden.
Eines der primären Herausforderungen zu therapeutischen Innovationen in Neurotrauma ist die Komplexität und Heterogenität der Erkrankung. Trauma gilt gleichzeitig multi-modale Stress für jeden Zelltyp in das zentrale Nervensystem. Neuronen zuverlässig aus menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (HiPSCs) generiert worden und sind jetzt weit verbreitet von kommerziellen Anbietern. Innovation in diesem Bereich schnell verläuft, und anderen neuronalen Zelltypen wie Astrozyten18 und Mikroglia19 stammen auch von HiPSCs. Es können möglicherweise bald die Zelle-autonomen Antworten jedes dieser Zelltypen Trauma in Vitro und dann kokultur verschiedene Zelltypen zu verstehen, wie sie kommunizieren nach dem Trauma zu isolieren. Auf diese Weise kann es letztlich möglich, die klinische Herausforderung von unten, neu erstellen, um es gründlich in einem menschlichen System zu verstehen sein. Dieser Ansatz unterscheidet sich von den herkömmlichen Ansatz unter Berufung auf Nager-Modelle und hat das Potenzial, neue Erkenntnisse zu generieren, die zu den ersten Therapien für diese gemeinsame, verheerende und hartnäckigen Erkrankung führen.

TBI ist eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität in den Vereinigten Staaten verursacht rund 52.000 Todesfälle und 275.000 Krankenhausaufenthalte pro Jahr1. Mehr als 30 klinische Studien der Kandidat Therapeutika für TBI wurden ohne einen einzigen Erfolg2durchgeführt. Dieses einheitliche Versagen legt nahe, dass Mensch-spezifische Prozesse der Pathophysiologie beobachtet in gängigen vorklinischen Nager-Modelle menschlichen TBI trennen.
Das Aufkommen des HiPSCNs schuf Neurotrauma in einem menschlichen in-vitro- Modell zu lernen. Drogen-screening mit HiPSCN-basierte Modelle kann Ergebnisse liefern, die mehr vorausschauende klinischen Erfolg als Modelle Nagetiere Zellen beschäftigt sind. HiPSCNs können auch genetisch manipuliert werden, um zu isolieren und die Wirkung der einzelnen menschlichen genetischen Varianten auf Pathologie3studieren.
In diesem Manuskript beschriebene Methode soll die einzigartigen Vorteile der HiPSCN-basierte Krankheit Modellierung bis Neurotrauma bringen. In-vitro- Stretch Verletzungen Modelle von Neurotrauma sind gut etablierte4,5,6 mit primären Nagetier Zellen und menschlichen neuronalen Krebszelllinien. Die meisten dieser Modelle erzeugen Strecke durch pneumatisch laden eine Silikonmembran. Dieser Ansatz ist wirksam bei einer einzigen-well-Format aber schwierig, bis hin zu einem Multi-well-Format7bewährt. Infolgedessen gab es nie ein hohen Durchsatz-Bildschirm für Agenten, Stretch verletzte Neuronen zu behandeln.
In diesem Modell erstreckt sich die Membran durch Einrückung von unten mit einer starren Eindringkörper. Dieser Ansatz hat immer wieder gezeigt, klinisch relevante Pathologie in Vitro in einzelnen Brunnenanlagen8,9,10zu generieren. Unsere jüngsten Arbeit hat gezeigt, dass es leicht auf einem 96-Well-Format skaliert unter Beibehaltung Pulsdauern in der Größenordnung von zehn Millisekunden11, das ist die Zeit, die Domäne der Kopf Auswirkungen Veranstaltungen12,13geschlossen.
Zusammenfassend lässt sich sagen sind die wichtigsten Vorteile dieses Modells in-vitro- Verletzung der 96-Well-Format, die Verwendung von HiPSCNs und klinisch relevanten Zeitbereich der Beleidigung.

<table><tbody><tr><td>.010" Silikonfolie</td><td>Specialty Manufacturing, Inc</td><td>#70P001200010</td><td>Polydimethylsiloxan (PDMS) Platte</td></tr><tr><td>Sparkleen</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>#043204</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 256665</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>#12-565-600</td><td>Bodenlose 96 Well Platte</td></tr><tr><td>Kim Tücher</td><td>ULINE</td><td>S-8115</td><td></td></tr><tr><td>Plasmareiniger</td><td>Harrick Plasma</td><td>#PDC-001-HC</td><td></td></tr> <tr><td>(3-Aminopropyl) Triethoxysilan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#440140</td><td>APTES</td></tr><tr><td>Pergamentpapier</td><td>Reynolds</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Dome Light</td><td>CCS inc</td><td>LFX2-100SW</td><td></td></tr><tr><td>Dome Light Netzteil</td><td>CCS inc</td><td>PSB-1024VB</td><td></td></tr><tr><td>Axial Diffuse Lighting Unit&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Siemens</td><td>Nerlite DOAL-75-LED</td><td>Diffuses Axiallicht</td></tr><tr><td>High Power LED Array&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>CREE</td><td>XLamp CXA2540</td><td>Hochleistungs-LED-Array&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>LED-Halter</td><td>Molex</td><td>1807200001 LED-Halter</td><td>&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>LED-Netzteil</td><td>Mean Well</td><td>HLG-320H-36B</td><td>Konstantstrom-Netzteil&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>FastCam Viewer Software&nbsp;</td><td>Photron</td><td></td><td>Kameraobjektiv</td></tr><tr><td>Fastcam Mini UX50</td><td>Photron</td><td>N/A</td><td>High Speed Kamera</td></tr><tr><td>Micro-NIKKOR 105mm f/2.8</td><td>Nikon</td><td>#1455</td><td>High Speed Kamera Objektiv</td></tr><tr><td>0,1 mg/mL Poly-L-Ornithin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#P4597</td><td></td></tr><tr><td>iCells</td><td>Cellular Dynamics International</td><td>#NRC-100-010-001</td><td></td></tr><tr><td>iCell Medien</td><td>Zellulardynamik International</td><td>#NRM-100-121-001&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>iCell supplement</td><td>Cellular Dynamics International</td><td>#NRM-100-031-001</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#L2020</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>#H3570</tr><tr><td>Calcein AM</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>#C3099</tr><tr><td>Schwingspulenaktuator&nbsp;</td><td>BEI Kimco</td><td>LA43-67-000A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Optisches Längenmessgerät&nbsp;</td><td>Renishaw</td><td>T1031-30A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Servoantrieb</td><td>Copley Controls</td><td>Xenus XTL&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Controller</td><td>National Instruments</td><td>cRIO 9024 Echtzeit-PowerPC-Controller&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>cRIO-Chassis</td><td>National Instruments</td><td>cRIO 9113</td><td></td></tr><tr><td>Digitaleingangsmodul</td><td>National Instruments</td><td>NI 9411</td><td></td></tr><tr><td>Datenerfassungs-Chassis</td><td>National Instruments</td><td>NI 9113</td><td></td></tr><tr><td>LabVIEW</td><td>National Instruments</td><td></td><td>Steuerungssoftware</td></tr><tr><td>hiPSCNs</td><td>Cellular Dynamics International</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

methode für high-speed strecke verletzungen der menschlichen induzierten pluripotenten stammzellen abgeleitet neuronen in einem 96-well-format

Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format

Schädel-Hirn-Trauma (SHT) ist eine klinische Herausforderung mit hoher Morbidität und Mortalität. Trotz jahrzehntelanger präklinische Forschung sind keine bewährten Therapien für TBI entwickelt worden. Dieses Papier stellt eine neuartige Methode zur präklinischen Neurotrauma Forschung vorhandenen präklinische Modellen ergänzen. Es stellt menschliche Pathophysiologie durch den Einsatz von menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleitet Neuronen (HiPSCNs). Es erreicht laden Puls Dauer ähnlich wie die Beladung Dauer der klinischen geschlossen Kopf Auswirkungen Verletzungen. Das Unternehmen beschäftigt eine 96-Well-Format, die erleichtert das Hochdurchsatz Experimenten und effiziente Nutzung von teuren Zellen und Kultur Reagenzien macht. Silikonmembranen sind zuerst behandelt, um neurotoxische ausgehärtete Polymer zu entfernen und dann verklebt kommerzielle 96-Well-Platte stellen, dehnbare 96-Well-Platten schaffen. Ein Custom-Built Gerät wird verwendet, um einige oder alle der gut Böden von unten, einrücken, induzieren äquibiaxial mechanische Belastung, der Zellen in der Kultur in den Vertiefungen mechanisch verletzt. Die Beziehung zwischen Eindringtiefe und mechanischer Belastung richtet sich empirisch mit high-Speed-Videografie gut Böden bei Einzug. Zellen, einschließlich HiPSCNs, können auf diese silikonmembranen mit modifizierten Versionen von konventionellen Zelle Kultur Protokolle kultiviert werden. Fluoreszierende mikroskopische Aufnahmen von Zellkulturen werden erworben und analysiert nach einer Verletzung in einem semi-automatischen Mode, die Höhe der Verletzung in jede Vertiefung zu quantifizieren. Das vorgestellte Modell ist optimiert für HiPSCNs aber könnte theoretisch auf andere Zelltypen angewendet werden.

Die Bahre Gerät ist in der Lage, Bewegung der Bühne wiederholbar mit Pulsdauern so kurz wie 10-15 ms abhängig von der Amplitude des Impulses (Abbildung 2A). Die Puls-Amplituden sind höchst wiederholbar, aber die Impulsdauer variiert von ca. 1 ms zwischen Wiederholungen. Die tatsächlichen Puls Amplitude weicht von der vorgeschriebenen Puls Amplitude wenn eine große Anzahl von Brunnen werden geladen, und die vorgeschriebene Amplitude hoch (siehe Abb. 2 b). Mit zunehmender Amplitude Phase Hubraum über 3 mm unterschreitet die tatsächliche Verdrängung Amplitude zunehmend die zwangsverschiebung Amplitude (siehe Abbildung 2 b). Sorgfältige Ausrichtung des Blocks Post entfällt jeder Trend in der Membran Belastung in Zeilen oder Spalten (Abbildung 2). An der 3,5 mm vorgeschrieben Bühne Verdrängung Amplitude (3,3 mm tatsächliche Verdrängung Amplitude) mit 52 Brunnen nicht eingerückt, der mittlere Lagrange-Stamm an allen Standorten gut wurde 0.451 (Standardabweichung der Mittel für alle Standorte = 0,051, Mittelwert der Standardabweichungen für alle Standorte = 0,065, n = 5 Messungen pro Well). Diese Ergebnisse werden hier auf Vollständigkeit vorgestellt, obwohl einige von ihnen bereits gemeldeten11 wurden.
Eine optimale, unverletzte Kultur haben wenige oder gar keine Klumpen von mehr als 5 Zellen. Neuriten werden einzelnen, langen, schlanken und geschwungenen mit wenig oder gar keine Zeichen von Anspannung oder Sicken (Abb. 3A). Unter idealen Bedingungen die Lebensfähigkeit der Kulturen sollte eng nähern sich die Tragfähigkeit gemäß Datenblatt des Herstellers (in der Regel 60-70 %) und Kulturen auf Silikon sollte ähneln denen auf herkömmlichen starren Kultursubstrate ( gepflegt Abb. 3 b). Neuriten möglicherweise oder möglicherweise nicht auf einem low-Power-Hellfeld-Mikroskop sichtbar. Laminin Konzentration und Zelldichte beeinflussen Kulturen zu Studienbeginn und nach Verletzungen. Erhöhung der Zelle Dichte erhöht die Anzahl und Größe der Klumpen, die sich in der Kultur gebildet. Erhöhung der Konzentration von Laminin oft entgegen dieser Effekt (Abb. 3A). Allerdings erhöht die Laminin Konzentration abgestumpft zu viel die Empfindlichkeit der Kulturen zu Verletzungen (Abbildung 4). Die optimale Laminin-Konzentration für unverletzt Kulturen war 50 µg/mL von Laminin (Abbildung 3), aber die optimale Trennung zwischen der Schein und Stretch verletzte Bevölkerung erhielt bei 10 µg/mL von Laminin (Abbildung 4). Höhere Konzentrationen von Laminin reduziert die Empfindlichkeit der Kulturen zu Verletzungen in kürzester Zeitpunkte (Abbildung 4), aber auch verbesserte Grundlinie Zellviabilität zu längeren Zeitpunkten (z.B.7 Tage). Zusammenfassend lässt sich sagen lohnt es sich, die Laminin-Konzentration für jedes experimentelle Szenario zu optimieren.
Membran-Stamm, bildgebenden Zeitpunkt nach der Verletzung, Laminin Konzentration und Zelldichte ausgeübt eine statistisch hoch signifikant Haupteffekt auf die Neuriten Länge pro Zelle (ANOVA, p &lt; 0,001). Die Wirkung der Membran Belastung Neuriten Länge pro Zelle hatte statistisch hoch signifikante Wechselwirkungen mit posttraumatischen bildgebenden Punkt und Laminin Konzentrationszeit (ANOVA, p &lt; 0,001) und eine statistisch signifikante Wechselwirkung mit Zelle Dichte (ANOVA, p &lt; 0,05). Ebenso Membran Belastung, posttraumatischen cell imaging Zeitpunkt, Dichte und Laminin Konzentration aller ausgeübt eine statistisch hoch signifikant Hauptwirkung im Zellviabilität (ANOVA, p &lt; 0,001). Die Wirkung der Membran Belastung im Zellviabilität hatte eine statistisch hoch signifikante Interaktion mit der posttraumatischen bildgebenden Zeitpunkt (ANOVA, p &lt; 0,001) und eine statistisch signifikante Wechselwirkung mit der Zelldichte (ANOVA, p &lt; 0,05). Diese Ergebnisse belegen, dass Timing, Zelldichte und Laminin Konzentration üben einen wichtigen Einfluss auf die Beziehung zwischen der angewandten Beleidigung und experimentelle Ergebnisse so jeweils sorgfältig optimiert werden sollte.
Niedrige Zellviabilität und Perlen Neuriten, zusammen mit verkümmerte Neuriten Wachstum zeigen, dass giftige Kulturbedingungen, die aus unsachgemäßer entstehen können Silikon vorbereitet. Überspringen oder Verkürzung der Wasser einweichen oder den Ofen trocken kann lassen absorbiert Ethanol oder Wasser in die Membran, bzw. die in den Medien zu verbreiten und betonen die Zellen können. Gut verletzte Kulturen werden Zellviabilität, verkürzte oder fehlende Neuriten, wulstige Neuriten und Neuriten, die straff oder gespannten aussehen reduziert haben. Verletzung kann verursachen Klumpenbildung in Zellkulturen, die waren gut dispergierte vor Verletzungen. Große Klumpen können die morphologische Analyse verwechseln. Für die morphologische Analyse sollten die Schadensschwelle optimiert werden, so dass spürbare Veränderungen auftreten, aber Zellen noch vorhanden, mit einigen Neuriten sind.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57305/57305fig1.jpg"> Abbildung 1 : A beschriftet schematische des Geräts Verletzungen. (A) Draufsicht (B) isometrische Ansicht, Vorderansicht (C), (D) Rechte Seitenansicht. Die Maßstabsleiste gilt grundsätzlich für die orthogonalen (A, B und D). <a href="/files/ftp_upload/57305/57305fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57305/57305fig2.jpg"> Abbildung 2 : Kinematik der mechanischen Beleidigung. (A) die Bühne Verschiebung Geschichten über 5 Impulse bei einer Reihe von vorgegebenen Amplituden (vorgeschriebene Amplituden sind in der Legende aufgeführt) Wenn keine Brunnen geladen sind. (B) die Bühne Verschiebung Geschichten über 10 Impulse bei einer Reihe von vorgegebenen Amplituden (vorgeschriebene Amplituden sind in der Legende aufgeführt) als 52 Brunnen werden geladen. (C) die durchschnittliche Belastung in jede Vertiefung mit Bühne Verdrängung Amplitude von 3,3 mm (n = 5 Messungen pro Bohrloch, durchschnittliche Standardfehler pro Bohrloch = 0.029). Beachten Sie, dass C4-F4 und C9-F9 ungedehnten Kontroll-Vertiefungen sind. Diese Zahl wurde von Sherman Et Al. modifiziert 11 <a href="/files/ftp_upload/57305/57305fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57305/57305fig3.jpg"> Abbildung 3 : Optimierung der Kultur Bedingungen auf Silikon. (A) die Wirkung unterschiedlicher Dichte und Laminin Zellkonzentration auf HiPSCN Kulturen auf Silikon. Verklumpung steigt mit zunehmender Zelldichte und abnehmender Laminin Konzentration. Dichte und Laminin Zellkonzentration muss optimiert werden, um Mono-zerstreut Kulturen zu erreichen. Mono-zerstreut Kulturen sind weniger anfällig für Artefakte während Quantifizierung. Beachten Sie, dass der dynamische Bereich Visualisierung von den Neuriten optimieren angepasst worden. Infolgedessen sind die viel hellere Soma gesättigt. Diese Präsentation wird bevorzugt auf die Alternative der Optimierung des dynamischen Bereichs in Bezug auf die Soma, die viel Dimmen Neuriten fast unsichtbar macht. Die Bedingung, die durch das rote Quadrat hervorgehoben wurde als optimal für in-vitro- Stretch Verletzung Experimente. (B) unter optimalen Bedingungen, Kulturen auf silikonmembranen erscheinen ähnlich wie Kulturen auf herkömmlichen starren Substraten. Die linke Tafel zeigt HiPSCNs bei 33.750 Zellen/cm2 mit 3,3 µg/mL Laminin auf eine herkömmliche, starre 96-Well-Platte (das anzuchtsubstrat Zelle ist eine Gewebekultur behandelt zyklische Olefin-Copolymer) kultiviert. Im Rechte Bereich reproduziert das Panel in rot von (A) beschrieben. Skalieren von Balken = 100 µm. <a href="/files/ftp_upload/57305/57305fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57305/57305fig4.jpg"> Abbildung 4 : Die Verletzung Phänotyp und seine Abhängigkeit von Laminin Konzentration. (A) gesunde Kultur, mit 10 µg/mL Laminin und 67.500 Zellen/cm2. Neuriten sind längst keine Perlen. Es gibt einige Tote Kerne und einige Klumpen. (B) Kultur mit der gleichen Kulturbedingungen, mit 57 % Spitze Dehnung verletzt und nach 4 Std. Neuriten verkürzt abgebildet oder fehlen, und einige haben Perlen (durch Pfeile angedeutet). Es gibt weniger Calcein AM-positiven Zellen und Calcein AM-negativer (d.h.tot) Kerne. Unter den Überlebenden Zellen verklumpen Verletzung gestiegen. (C) 4 h nach der Verletzung, lehnt Neuriten Länge pro Zelle mit zunehmender Belastung in einer Weise, die von der Laminin-Konzentration abhängt. (D) 4 h nach der Verletzung, lehnt Zellviabilität mit zunehmender Belastung in einer Weise, die von der Laminin-Konzentration abhängt. (E) 24 Stunden nach der Verletzung, lehnt Neuriten Länge pro Zelle mit zunehmender Belastung in einer Weise, die von der Laminin-Konzentration abhängt. (F) 24 Stunden nach der Verletzung, lehnt Zellviabilität mit zunehmender Belastung in einer Weise, die von der Laminin-Konzentration abhängt. (n = 4 pro bar, Fehlerbalken sind ± 1 Standardabweichung, Maßstabsleisten = 100 µm). Dehnungswerte sind aus Bühne Verschiebung anhand von Daten aus einer Vorveröffentlichung von Sherman Et Al. abgeleitet. 11 <a href="/files/ftp_upload/57305/57305fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Ergänzende Abbildung1: Technische Zeichnung des Eindringkörpers. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Figure_1.pdf" target="_blank">Klicken Sie bitte hier, um diese Zahl zu downloaden.</a>
Ergänzende Tabelle 1: Custom Built Geräte. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Table_1-Custom_Devices-Bill_of_Materials.xlsx" target="_blank">Klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>
Ergänzende Tabelle 2:96 gut Platte-Loader Pinout Schaltplan. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Table_2-96_Well_Plate_Loader.xlsx" target="_blank">Klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>
Ergänzende Code Datei 1: CAD-Zeichnungen des Geräts Verletzungen. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_1-Injury_Device-FULL_ASSEMBLY-Generic_3D.STEP" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>
Ergänzende Code File 2: CAD-Zeichnungen der Platte Herstellung Schelle. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_2-Press_Die-Generic_3D.STEP" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>
Ergänzende Code Datei 3: 3D-Darstellung der Stempel Geometrie, geeignet für den Einsatz mit einem 3D-Drucker. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_3-stamp.STL" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>
Ergänzende Code Datei 4: SubVI für MuStLiMo_si_initialize.vi, die ein SubVI für motion_control.vi ist. Parameter für Bewegung verwandelt Einträge in Dialogfeldern. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_4-compute_init_param.vi" target="_blank">Klicken Sie bitte hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Code Datei 5: SubVI für mehrere geraden Linie Moves_simplified.vi, die ein SubVI für motion_control.vi ist. Parameter für Bewegung verwandelt Einträge in Dialogfeldern. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_5-compute_parameters.vi" target="_blank">Klicken Sie bitte hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Code Datei 6: SubVI für position_tracker.vi. Zähler Spuren Verschiebung von linearen Encoder-Eingang. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_6-Counter-Continuous_Output.vi" target="_blank">Klicken Sie bitte hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Codedatei 7: LabVIEW-Projekt stützen. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_7-in_vitro_neurotrauma.lvproj" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>
Ergänzende Code File 8: Top Level VI, die das Gerät bewegt. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_8-motion_control.vi" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>
Ergänzende Code Datei 9: SubVI für motion_control.vi. Führt die schnelle Verschiebung, die die Platte erstreckt. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_9-Multiple_Straight_Line_Moves_simplified.vi" target="_blank">Klicken Sie bitte hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Code Datei 10: SubVI für motion_control.vi. Führt die langsame Verschiebung, die die Bühne bewegt. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_10-MuStLiMo_si_initialize.vi" target="_blank">Klicken Sie bitte hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Code Datei 11: SubVI für motion_control.vi. Grundstücke (in der Regel Blickwinkels) Hubraum Geschichte in der Systemsteuerung motion_control.vi. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_11-plot_displacement.vi" target="_blank">Klicken Sie bitte hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Code Datei 12: Top Level VI, in dem die Verschiebung Geschichte aufgezeichnet. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_12-position_tracker.vi" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>
Ergänzende Code File 13: enthält Variable2, die kommuniziert, zwischen motion_control.vi und position_tracker.vi. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_13-Untitled_Library_2.lvlib" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>
Ergänzende Code Datei 14: Schematische für Leiterplatte. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_14-interconnector_circuit_board.dch" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>
Ergänzende Code Datei 15: Layout für Leiterplatte. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_15-interconnector_circuit_board.dip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>

Hier präsentieren wir eine Methode für eine menschliche in Vitro Modell der Stretch Verletzungen in einem 96-Well-Format auf einer Zeitskala für Trauma auswirken. Dazu gehören Methoden für die Herstellung von dehnbaren Platten, Quantifizierung der mechanischen Beleidigung, Kultivierung und verletzte Zellen, Bildgebung und hohe Inhaltsanalyse, Verletzungen zu quantifizieren.

Methode für High-Speed Strecke Verletzungen der menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleitet Neuronen in einem 96-Well-Format

Traumatic brain injury (TBI) is a major clinical challenge with high morbidity and mortality. Despite decades of pre-clinical research, no proven ...

Das übergeordnete Ziel dieses Modells ist es, einen klinisch relevanten Neurotrauma-Phänotyp in einem 96-Well-Format zu erstellen, um einen effizienten und gleichzeitigen Vergleich von Verletzungen zu ermöglichen, die unter mehreren experimentellen Bedingungen erlitten wurden. Der Hauptzweck dieses Modells besteht darin, hochgradig phänotypische Wirkstoffforschungsscreenings bei Neurotraumata mit humaninduzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Neuronen zu ermöglichen. Die in diesem Modell verwendeten Platten behalten die branchenübliche 96-Well-Plattengeometrie bei und sind weiterhin mit bestehenden High-Content-Screening-Maschinen wie Roboterarmen und automatisierten Mikroskopen kompatibel.Legen Sie zunächst eine bodenlose 96-Well-Platte mit der Unterseite nach oben für 60 Sekunden bei hoher Leistung in einen 200-Watt-Plasmareiniger. Legen Sie dann die Platte mit der Unterseite nach unten für 200 Milliliter frisch zubereitetes 1,5%APTES in entionisiertem Wasser für 20 Minuten in einen Abzug. Positionieren Sie nach 10 Minuten Inkubation mit einer Pinzette eine plasmabehandelte Silikonmembran auf einem 7,5 x 11 Zentimeter großen Pergamentpapierrechteck und richten Sie eine 7,5 x 11,05 Zentimeter große Aluminiumplatte auf dem unteren Teil der Plattenherstellungsklammer aus.Richten Sie dann mit einer Pinzette die Silikonmembran und das Pergamentpapier auf der Aluminiumplatte aus. Am Ende der Beschichtungszeit die bodenlose Platte aus dem APTES-Bad nehmen und die überschüssige Lösung abschütteln. Tauchen Sie die bodenlose Platte jeweils fünf Sekunden lang in zwei aufeinanderfolgende 200-Milliliter-Wasserbäder und schütteln Sie das überschüssige Wasser ab.Setzen Sie nach dem vollständigen Trocknen mit Druckluft die bodenlose Platte in den oberen Teil der Plattenherstellungsklammer ein und schließen Sie die Klemme vorsichtig, um die bodenlose Platte und das Silikon zusammenzudrücken. Um den Eindringblock auszurichten, befestigen Sie die Platte mit Tischklemmen auf dem Tisch des Streckgeräts unter einer Kamera mit Live-Feed und platzieren Sie eine Domleuchte über dem Gerät. Starten Sie die Instrumentensteuerungssoftware auf dem Computer, der an das Verletzungsgerät angeschlossen ist, und klicken Sie auf das Startfenster, um das In-vitro-Neurotrauma-Projekt auszuführen.Doppelklicken Sie im Projektfenster auf die virtuellen Instrumente Motion Control und Position Tracker. Schließen Sie den Käfig, der das Verletzungsgerät umgibt, und klicken Sie auf den Pfeil im virtuellen Bewegungssteuerungsinstrument, um das Instrument auszuführen. Klicken Sie unten an, um den Tisch auf zwei Millimeter Kontakt mit den Eindringkörpern abzusenken, und klicken Sie dann auf Stopp, um das virtuelle Instrument zu stoppen.Klicken Sie im Projektfenster mit der rechten Maustaste auf Achse Eins und klicken Sie auf Interaktives Testpanel. Geben Sie im erscheinenden Fenster 500 Einheiten in das Feld Zielposition ein, um die Schrittweite auf 50 Mikrometer einzustellen. Klicken Sie dann wiederholt auf "Los", bis die Platte zum ersten Mal Kontakt mit Eindringkörpern hat, und prüfen Sie, ob sich das von der Kamera angezeigte Live-Bild berührt.Die vertikale Position der Bühne wird oben links im interaktiven Testpanel-Fenster angezeigt. Senken Sie die Platte weiter ab, bis alle Vertiefungen Kontakt mit den Eindringkörpern aufgenommen haben, und bewegen Sie die Kamera und den Tisch nach Bedarf, um die gesamte Platte zu betrachten. Notieren Sie sich die gemeldete vertikale Bühnenposition, wenn alle Beiträge in Kontakt sind, und schließen Sie den interaktiven Testbereich.Führen Sie als Nächstes das virtuelle Instrument für die Bewegungssteuerung aus und klicken Sie auf "Oben", um die Bühne anzuheben, und verwenden Sie die Stopp-Taste, um das virtuelle Instrument zu stoppen, wenn sich die Bühne in Position befindet. Öffnen Sie die Tür, um das Gerät zu deaktivieren, lösen Sie dann die Sethschraube an der Ecke, die zuerst Kontakt hatte, um die Ecke abzusenken, und ziehen Sie die gegenüberliegende Schraube fest, um die Ecke anzuheben, die zuletzt Kontakt hatte. Wiederholen Sie das Absenken, Beobachten und Einstellen des Blocks, bis die Platte gleichzeitig mit allen Eindringkörpern in Kontakt kommt.Eine sorgfältige Ausrichtung des Eindringkörperblocks ist wichtig, um eine gleichmäßige Verletzung über alle Vertiefungen der Platte zu erreichen. Öffnen Sie die Tür, um das Gerät wieder zu deaktivieren, und stecken Sie die Zurrschrauben in ihre Löcher am Eindringkörper. Ziehen Sie dann die Schrauben fest und notieren Sie sich die Tischposition, die von der interaktiven Testtafel gemeldet wird, wenn die Platte in Kontakt kommt.Um die Platte zu dehnen, ändern Sie den Dateinamen im Feld "Dateipfad" in der Position zur Überprüfung des virtuellen Instruments in einen eindeutigen Dateinamen und klicken Sie auf den Pfeil "Ausführen". Legen Sie die Tiefe und Dauer des Eindrucks sowie die Felder "Verletzung" und "Verletzungsdauer" im virtuellen Instrument des Bewegungssteuerungsfelds fest. Wenn sich die Platte in der Nullposition befindet, führen Sie das virtuelle Instrument des Bewegungsbedienfelds aus und klicken Sie auf Verletzen, um die Platte einzurücken.Klicken Sie auf Oben, um die Bühne nach oben zu bewegen, klicken Sie auf Stopp, wenn sich die Platte in der oberen Position befindet, und öffnen Sie die Tür, um die Verletzungsvorrichtung zu deaktivieren. Überprüfen Sie dann den Verschiebungsverlauf des Tisches, der im virtuellen Instrument des Positionstrackers angezeigt wird, um zu bestätigen, dass die angegebene maximale Verschiebung angewendet wurde, und exportieren Sie die Daten in ein geeignetes Tabellenkalkulationsprogramm. Um die Dehnung der Silikonmembran zu beurteilen, legen Sie die Platte nach der Plasmabehandlung auf eine weiche Oberfläche und grundieren Sie den kleinen Vorsprung auf einem Stempel mit Tinte von einem Permanentmarker.Führen Sie den Stempel in die erste Vertiefung ein, die getestet werden soll, und klopfen Sie, um eine gute Farbübertragung zu gewährleisten. Wenn alle Vertiefungen gestanzt sind, platzieren Sie die Hochgeschwindigkeitskamera auf einem Auslegerstativ über der Verletzungsvorrichtung, wobei das Objektiv auf die kleinste nummerierte Blendenzahl eingestellt ist, so dass das Sichtfeld 12 Eindringkörper in einem Drei-mal-Vier-Raster enthält. Wenn Sie sich in der Nullpunktposition befinden, klicken Sie mit einem Klick auf die Aufnahmetaste in der Kamerasoftware, damit der Auslöser eingelesen und das helle, diffuse axiale Licht eingeschaltet werden kann.Ziehen Sie dann die Platte wie gerade gezeigt ein und schalten Sie das Axiallicht aus. Um eine Zellkultur zu schädigen, geben Sie 100 Mikroliter mit Laminin behandelte, vom Menschen induzierte pluripotente Stammzell-abgeleitete Neuronen in jede Vertiefung der plasmabehandelten Platte und lassen Sie die Zellen 15 Minuten lang bei Raumtemperatur an der Plattenunterseite anhaften, bevor Sie die Platte in den Zellkultur-Inkubator legen. Klemmen Sie die Platte nach zwei bis drei Tagen Kultur auf den Tisch des Verletzungsgeräts und passen Sie die Position des Deckels an, um die Platte zu sichern, ohne die Kulturen der Umgebungsluft auszusetzen.Ziehen Sie dann die Platte in der Nullpunktposition ein, wie gerade gezeigt. Eine optimale, unverletzte Kultur hat wenige, wenn überhaupt, Klumpen von mehr als fünf Zellen, und die Neuriten sind einzeln, lang, schlank und gekrümmt, mit wenig oder gar keinem Abperlen. Unter idealen Bedingungen sollte die Lebensfähigkeit der Kulturen der im Datenblatt des Herstellers angegebenen Lebensfähigkeit nahe kommen, und die Kulturen auf Silikon sollten denen auf herkömmlichen starren Kultursubstraten ähneln.Eine Erhöhung der Zelldichte erhöht die Anzahl und Größe der Klumpen, die sich in Kultur bilden, während eine Erhöhung der Lamininkonzentration diesem Effekt typischerweise entgegenwirkt. In Kulturen, die mit einem Spitzenstamm von 57 % verletzt wurden, sind die Neuriten vier Stunden nach der Verletzung verkürzt oder fehlen, und einige weisen Kügelchen auf, deren Verklumpung durch die verbleibenden lebensfähigen Zellen demonstriert wird. Insbesondere verringern höher dosierte Lamininbehandlungen die Schwere der Schädigung der Zellkulturen in konzentrationsabhängiger Weise, was sich in einer Zunahme der Neuritenlänge und der Zellviabilität in den mit höherer Laminin behandelten Kulturen zeigt.Bei diesem Verfahren ist es wichtig, die Vorlaufzeiten zu berücksichtigen. Zum Beispiel dauert die Membranentgiftung drei Tage, und die hergestellten Platten sollten über Nacht aushärten, bevor sie verwendet werden. Vergessen Sie nicht, dass das Verletzungsgerät eine leistungsstarke Schwingspule enthält, um seine Bewegung anzutreiben, und man sollte sich immer von dem Gerät fernhalten, wenn es aktiv ist, und das Gerät nur ausschalten, wenn sich der Tisch am oberen Ende seines Verfahrwegs befindet.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Protokolle für die neuronale Differenzierung von pluripotenten menschlichen Stammzellen (hPSCs) sind oft zeitaufwendig und erfordern erhebliche Zellkultur Fähigkeiten. Hier haben wir ein kleines Molekül-basierte Differenzierung Verfahren zu einem multititre Plattenformat angepasst, die eine einfache, schnelle und effiziente Erzeugung von menschlichen Nervenzellen in einer kontrollierten Art und Weise.

Schnelle und effiziente Erzeugung von Neuronen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen in einem Multititre Platte Format

Das Video demonstriert eine Methode zur Erzeugung exzitatorischer kortikaler Neuronen aus humaninduzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs). Bei der Induktion von Doxycyclin exprimieren die hiPSCs Neurogenin-2, einen neuronalen spezifischen Transkriptionsfaktor. Durch die Verwendung spezifischer Medien und die Co-Kultivierung mit Astrozyten erleichtert dieser Prozess die Differenzierung der hiPSCs in Neuronen mit synaptischen Verbindungen.

Differenzierung humaner induzierter pluripotenter Stammzellen in Neuronen auf Mikroelektroden-Arrays

Dieses Video zeigt die Etablierung einer Co-Kultur von humanen induzierten Neuronen (iNs) und induzierten Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (iOPCs). iNs werden mit iOPCs in einer Co-Kultur gemischt und dann inkubiert, um die Reifung von iNs zu Neuronen und iOPCs zu Oligodendrozyten zu unterstützen. Neuronen bilden synaptische Verbindungen mit anderen Neuronen und Oligodendrozyten, während Oligodendrozyten Myelinscheiden um die Axone der Neuronen bilden.

Eine Co-Kultur-Methode zur Modellierung von Neuron-Oligodendrozyten-Interaktionen

Dieses Video zeigt den Prozess der Differenzierung menschlicher iPSCs in Motoneuronen. Die Begründung beinhaltet die Verwendung von iPSCs, die genetisch verändert wurden, um bestimmte Transkriptionsfaktoren zu exprimieren. Wenn dieses Antibiotikum in einem Medium kultiviert wird, das Doxycyclin enthält, löst es die Expression von Transkriptionsfaktoren aus und fördert dadurch die Differenzierung von iPSCs in Motoneuronen-Vorläuferzellen. Letztendlich werden die Vorläuferzellen in einem...

Differenzierung von künstlich hergestellten humanen induzierten pluripotenten Stammzellen in funktionelle Motoneuronen

Dieses Video zeigt den Prozess der Induktion von Dehnungsverletzungen an humanen induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Neuronen (hiPSCNs). Die Zellen werden in einer bodenlosen Multiwell-Platte entnommen, an der eine Silikonmembran befestigt ist. Kontrollierte mechanische Belastung wird auf die Membran ausgeübt, um eine Störung des Zytoskeletts und eine Schädigung der Zellmembran zu induzieren, wodurch ein Phänotyp einer Dehnungsverletzung in den Zellen induziert wird.

Ein In-vitro-Modell der Dehnungsverletzung in humanen induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Neuronen

Dendritischen Dornen von Pyramidenneuronen sind die Websites der meisten Synapsen im Gehirn von Säugetieren Kortex. Diese Methode beschreibt ein 3D-quantitative Analyse der Wirbelsäule Morphologien in der menschlichen kortikalen Pyramiden glutamatergen Neuronen aus induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleitet.

Dreidimensionale Quantifizierung der dendritischen Dornen von Pyramidenzellen aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen

Menschliche induzierte pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) gelten als ein leistungsfähiges Werkzeug für die Arzneimittel- und Chemikalien-Screening und für die Entwicklung neuer in vitro- Modelle für die Toxizitätstests, einschließlich Neurotoxizität. Hier wird ein detailliertes Protokoll zur Differenzierung von hiPSCs in Neuronen und Glia beschrieben.

Protokoll zur Differenzierung von human induzierten pluripotenten Stammzellen in Mischkulturen von Neuronen und Glia für Neurotoxizitätstests

Dieses Protokoll beschreibt ein detailliertes Verfahren zur Aussetzung und Kultivierung von neuronen menschlichen Stammzellen, die zuvor mehrere Wochen lang von neuronalen Vorläufern in vitro unterschieden wurden. Das Verfahren erleichtert bildgebende Assays von Neuriten, Synapsen und spät exemitten neuronalen Markern in einem Format, das mit Lichtmikroskopie und High-Content-Screening kompatibel ist.

Post-Differenzierung Replating von Human Pluripotent Stem Cell abgeleiteten Neuronen für High-Content Screening von Neuritogenese und Synapse Reifung

Wir stellen Ihnen hier ein Protokoll für die Differenzierung der menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen in jeder Somiten Derivat (Myotom, Sklerotom Dermatome und Syndetome) in chemisch definierten Bedingungen, die hat Anwendungen in zukünftigen Krankheit Modellierung und zellbasierte Therapien in der orthopädischen Chirurgie.

In vitro-Generation der Somiten Derivate aus menschlichen induzierten Zellen pluripotenten Stammzellen

Dieser Artikel beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von iTenozyten durch die Erzeugung von iPSC-abgeleiteten mesenchymalen Stromazellen mit kombinierter Überexpression von Sklerose unter Verwendung eines lentiviralen Vektors und uniaxialer Streckung über einen 2D-Bioreaktor.

Generierung von induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten iTenozyten durch kombinierte Sklera-Überexpression und uniaxiale 2D-Spannung

Dieses Protokoll zielt darauf ab, dorsal-ventral fusionierte Assembloide auf Mehrelektrodenarrays stabil zu plädieren, um die Epilepsie in vitro zu modellieren.

Eine Multi-Elektroden-Array-Plattform zur Modellierung von Epilepsie unter Verwendung von humanen pluripotenten Stammzellen abgeleiteten Gehirnassembloiden

Lernen Sie eine Methode zur Erzeugung von Dehnungsverletzungen an humanen iPS-Zell-abgeleiteten Neuronen im 96-Well-Format. Dieses Modell ermöglicht hochdurchsatzfähige phänotypische Arzneimittelscreenings für Neurotrauma-Forschung.

Methode für High-Speed Strecke Verletzungen der menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleitet Neuronen in einem 96-Well-Format (Video) | JoVE Journal

Methode für High-Speed Strecke Verletzungen der menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleitet Neuronen in einem 96-Well-Format

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