Methode für High-Speed Strecke Verletzungen der menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleitet Neuronen in einem 96-Well-Format

Das übergeordnete Ziel dieses Modells ist es, einen klinisch relevanten Neurotrauma-Phänotyp in einem 96-Well-Format zu erstellen, um einen effizienten und gleichzeitigen Vergleich von Verletzungen zu ermöglichen, die unter mehreren experimentellen Bedingungen erlitten wurden. Der Hauptzweck dieses Modells besteht darin, hochgradig phänotypische Wirkstoffforschungsscreenings bei Neurotraumata mit humaninduzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Neuronen zu ermöglichen. Die in diesem Modell verwendeten Platten behalten die branchenübliche 96-Well-Plattengeometrie bei und sind weiterhin mit bestehenden High-Content-Screening-Maschinen wie Roboterarmen und automatisierten Mikroskopen kompatibel.

Legen Sie zunächst eine bodenlose 96-Well-Platte mit der Unterseite nach oben für 60 Sekunden bei hoher Leistung in einen 200-Watt-Plasmareiniger. Legen Sie dann die Platte mit der Unterseite nach unten für 200 Milliliter frisch zubereitetes 1,5%APTES in entionisiertem Wasser für 20 Minuten in einen Abzug. Positionieren Sie nach 10 Minuten Inkubation mit einer Pinzette eine plasmabehandelte Silikonmembran auf einem 7,5 x 11 Zentimeter großen Pergamentpapierrechteck und richten Sie eine 7,5 x 11,05 Zentimeter große Aluminiumplatte auf dem unteren Teil der Plattenherstellungsklammer aus.

Richten Sie dann mit einer Pinzette die Silikonmembran und das Pergamentpapier auf der Aluminiumplatte aus. Am Ende der Beschichtungszeit die bodenlose Platte aus dem APTES-Bad nehmen und die überschüssige Lösung abschütteln. Tauchen Sie die bodenlose Platte jeweils fünf Sekunden lang in zwei aufeinanderfolgende 200-Milliliter-Wasserbäder und schütteln Sie das überschüssige Wasser ab.

Setzen Sie nach dem vollständigen Trocknen mit Druckluft die bodenlose Platte in den oberen Teil der Plattenherstellungsklammer ein und schließen Sie die Klemme vorsichtig, um die bodenlose Platte und das Silikon zusammenzudrücken. Um den Eindringblock auszurichten, befestigen Sie die Platte mit Tischklemmen auf dem Tisch des Streckgeräts unter einer Kamera mit Live-Feed und platzieren Sie eine Domleuchte über dem Gerät. Starten Sie die Instrumentensteuerungssoftware auf dem Computer, der an das Verletzungsgerät angeschlossen ist, und klicken Sie auf das Startfenster, um das In-vitro-Neurotrauma-Projekt auszuführen.

Doppelklicken Sie im Projektfenster auf die virtuellen Instrumente Motion Control und Position Tracker. Schließen Sie den Käfig, der das Verletzungsgerät umgibt, und klicken Sie auf den Pfeil im virtuellen Bewegungssteuerungsinstrument, um das Instrument auszuführen. Klicken Sie unten an, um den Tisch auf zwei Millimeter Kontakt mit den Eindringkörpern abzusenken, und klicken Sie dann auf Stopp, um das virtuelle Instrument zu stoppen.

Klicken Sie im Projektfenster mit der rechten Maustaste auf Achse Eins und klicken Sie auf Interaktives Testpanel. Geben Sie im erscheinenden Fenster 500 Einheiten in das Feld Zielposition ein, um die Schrittweite auf 50 Mikrometer einzustellen. Klicken Sie dann wiederholt auf "Los", bis die Platte zum ersten Mal Kontakt mit Eindringkörpern hat, und prüfen Sie, ob sich das von der Kamera angezeigte Live-Bild berührt.

Die vertikale Position der Bühne wird oben links im interaktiven Testpanel-Fenster angezeigt. Senken Sie die Platte weiter ab, bis alle Vertiefungen Kontakt mit den Eindringkörpern aufgenommen haben, und bewegen Sie die Kamera und den Tisch nach Bedarf, um die gesamte Platte zu betrachten. Notieren Sie sich die gemeldete vertikale Bühnenposition, wenn alle Beiträge in Kontakt sind, und schließen Sie den interaktiven Testbereich.

Führen Sie als Nächstes das virtuelle Instrument für die Bewegungssteuerung aus und klicken Sie auf "Oben", um die Bühne anzuheben, und verwenden Sie die Stopp-Taste, um das virtuelle Instrument zu stoppen, wenn sich die Bühne in Position befindet. Öffnen Sie die Tür, um das Gerät zu deaktivieren, lösen Sie dann die Sethschraube an der Ecke, die zuerst Kontakt hatte, um die Ecke abzusenken, und ziehen Sie die gegenüberliegende Schraube fest, um die Ecke anzuheben, die zuletzt Kontakt hatte. Wiederholen Sie das Absenken, Beobachten und Einstellen des Blocks, bis die Platte gleichzeitig mit allen Eindringkörpern in Kontakt kommt.

Eine sorgfältige Ausrichtung des Eindringkörperblocks ist wichtig, um eine gleichmäßige Verletzung über alle Vertiefungen der Platte zu erreichen. Öffnen Sie die Tür, um das Gerät wieder zu deaktivieren, und stecken Sie die Zurrschrauben in ihre Löcher am Eindringkörper. Ziehen Sie dann die Schrauben fest und notieren Sie sich die Tischposition, die von der interaktiven Testtafel gemeldet wird, wenn die Platte in Kontakt kommt.

Um die Platte zu dehnen, ändern Sie den Dateinamen im Feld "Dateipfad" in der Position zur Überprüfung des virtuellen Instruments in einen eindeutigen Dateinamen und klicken Sie auf den Pfeil "Ausführen". Legen Sie die Tiefe und Dauer des Eindrucks sowie die Felder "Verletzung" und "Verletzungsdauer" im virtuellen Instrument des Bewegungssteuerungsfelds fest. Wenn sich die Platte in der Nullposition befindet, führen Sie das virtuelle Instrument des Bewegungsbedienfelds aus und klicken Sie auf Verletzen, um die Platte einzurücken.

Klicken Sie auf Oben, um die Bühne nach oben zu bewegen, klicken Sie auf Stopp, wenn sich die Platte in der oberen Position befindet, und öffnen Sie die Tür, um die Verletzungsvorrichtung zu deaktivieren. Überprüfen Sie dann den Verschiebungsverlauf des Tisches, der im virtuellen Instrument des Positionstrackers angezeigt wird, um zu bestätigen, dass die angegebene maximale Verschiebung angewendet wurde, und exportieren Sie die Daten in ein geeignetes Tabellenkalkulationsprogramm. Um die Dehnung der Silikonmembran zu beurteilen, legen Sie die Platte nach der Plasmabehandlung auf eine weiche Oberfläche und grundieren Sie den kleinen Vorsprung auf einem Stempel mit Tinte von einem Permanentmarker.

Führen Sie den Stempel in die erste Vertiefung ein, die getestet werden soll, und klopfen Sie, um eine gute Farbübertragung zu gewährleisten. Wenn alle Vertiefungen gestanzt sind, platzieren Sie die Hochgeschwindigkeitskamera auf einem Auslegerstativ über der Verletzungsvorrichtung, wobei das Objektiv auf die kleinste nummerierte Blendenzahl eingestellt ist, so dass das Sichtfeld 12 Eindringkörper in einem Drei-mal-Vier-Raster enthält. Wenn Sie sich in der Nullpunktposition befinden, klicken Sie mit einem Klick auf die Aufnahmetaste in der Kamerasoftware, damit der Auslöser eingelesen und das helle, diffuse axiale Licht eingeschaltet werden kann.

Ziehen Sie dann die Platte wie gerade gezeigt ein und schalten Sie das Axiallicht aus. Um eine Zellkultur zu schädigen, geben Sie 100 Mikroliter mit Laminin behandelte, vom Menschen induzierte pluripotente Stammzell-abgeleitete Neuronen in jede Vertiefung der plasmabehandelten Platte und lassen Sie die Zellen 15 Minuten lang bei Raumtemperatur an der Plattenunterseite anhaften, bevor Sie die Platte in den Zellkultur-Inkubator legen. Klemmen Sie die Platte nach zwei bis drei Tagen Kultur auf den Tisch des Verletzungsgeräts und passen Sie die Position des Deckels an, um die Platte zu sichern, ohne die Kulturen der Umgebungsluft auszusetzen.

Ziehen Sie dann die Platte in der Nullpunktposition ein, wie gerade gezeigt. Eine optimale, unverletzte Kultur hat wenige, wenn überhaupt, Klumpen von mehr als fünf Zellen, und die Neuriten sind einzeln, lang, schlank und gekrümmt, mit wenig oder gar keinem Abperlen. Unter idealen Bedingungen sollte die Lebensfähigkeit der Kulturen der im Datenblatt des Herstellers angegebenen Lebensfähigkeit nahe kommen, und die Kulturen auf Silikon sollten denen auf herkömmlichen starren Kultursubstraten ähneln.

Eine Erhöhung der Zelldichte erhöht die Anzahl und Größe der Klumpen, die sich in Kultur bilden, während eine Erhöhung der Lamininkonzentration diesem Effekt typischerweise entgegenwirkt. In Kulturen, die mit einem Spitzenstamm von 57 % verletzt wurden, sind die Neuriten vier Stunden nach der Verletzung verkürzt oder fehlen, und einige weisen Kügelchen auf, deren Verklumpung durch die verbleibenden lebensfähigen Zellen demonstriert wird. Insbesondere verringern höher dosierte Lamininbehandlungen die Schwere der Schädigung der Zellkulturen in konzentrationsabhängiger Weise, was sich in einer Zunahme der Neuritenlänge und der Zellviabilität in den mit höherer Laminin behandelten Kulturen zeigt.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, die Vorlaufzeiten zu berücksichtigen. Zum Beispiel dauert die Membranentgiftung drei Tage, und die hergestellten Platten sollten über Nacht aushärten, bevor sie verwendet werden. Vergessen Sie nicht, dass das Verletzungsgerät eine leistungsstarke Schwingspule enthält, um seine Bewegung anzutreiben, und man sollte sich immer von dem Gerät fernhalten, wenn es aktiv ist, und das Gerät nur ausschalten, wenn sich der Tisch am oberen Ende seines Verfahrwegs befindet.