CRISPR-vermittelten Verlust der Funktionsanalyse in zerebelläre Untermodul Zellen mit In Utero Elektroporation-basierte Gentransfer

Das übergeordnete Ziel dieses auf Elektroporation basierenden in vivo Gentransfer-Ansatzes ist es, die Rolle von Genen von Interesse bei der Differenzierung von Kleinhirn-Körnerzellen mit Hilfe von CRISPR-vermittelten Funktionsverlustanalysen zu bewerten. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen in den Entwicklungsneurowissenschaften und den Neuroonkologien zu beantworten, z. B. zur Identifizierung der Moleküle, die für die normale Kleinhirnentwicklung und die Bildung von Hirntumoren wichtig sind. Das Verfahren der In-utero-Elektroporation wird von Dr. Lena Herbst, einer Postdoktorandin aus dem Labor von Professor Peter Lichter, demonstriert, und dann wird die folgende Immunhistochemie von Dr. Weijun Feng, einem Postdoktoranden aus dem Labor von Dr. Haikun Di, durchgeführt.

Der Hauptvorteil dieser Methode besteht darin, dass man sich bemüht, Gene, die für sie in den Kleinhirnzellen interessant sind, mit Hilfe der CRISPR-cas9-Technologien auszuschalten, anstatt die Kombination von Knock-out-Tieren zu erzeugen. Obwohl diese Methode Einblicke in die Genfunktionen während der normalen Kleinhirnentwicklung geben kann, kann sie auch auf andere Systeme angewendet werden, wie z. B. die Entwicklung anderer physischer Hirnregionen und die Modellierung von Hirntumoren. Beginnen Sie damit, eine Kapillare aus Borosilikatglas in einen Mikropipettenabzieher zu laden und zu ziehen, um eine feine Spitze zu erzeugen.

Beschriften Sie die Kapillarspitze mit schwarzer Tinte, um sie während der Injektion besser sichtbar zu machen, und zeichnen Sie eine Skalierung auf das Glas. Schneiden Sie die Spitze unter einem Stereomikroskop mit einem Lineal und einer scharfen Nadelpinzette auf eine Länge von etwa sechs Millimetern ab und erzeugen Sie eine scharfe, einseitig abgeschrägte Kante. Filtrieren Sie eine 1%schnelle grüne Stammlösung durch einen Nullpunktfilter mit 22 Mikrometern, um Farbstoffpartikel aus der Lösung zu entfernen.

Mischen Sie die Single-Guide-RNA-Plasmide zu gleichen Teilen mit dem Luciferase-Reporterplasmid bis zu einer Endkonzentration von mindestens einem Mikrogramm pro Milliliter für jedes Plasmid. Färben Sie die Plasmidlösung mit Schnellgrün bei einer Endkonzentration von 0,5 %Nachdem Sie eine schwangere CD-1-Maus mit Isofluran betäubt haben, legen Sie die Maus auf den Rücken auf ein Heizkissen und verabreichen Sie ein Analgetikum. Tragen Sie Augensalbe auf, um Augentrockenheit während der Operation zu verhindern.

Fixieren Sie die Linse mit Klebeband und sterilisieren Sie den Bauch mit einem Desinfektionsmittel. Decken Sie die Maus mit Gaze ab, so dass nur der Operationsbereich freiliegt. Nachdem Sie einen etwa zwei Zentimeter langen Hautschnitt gemacht haben, lokalisieren Sie die Linea alba und verwenden Sie eine stumpfe Stoffschere, um einen etwas kleineren zweiten Schnitt durch das Bauchfell zu machen.

Befeuchten Sie die geöffnete Bauchhöhle mit vorgewärmtem sterilem PBS. Verwenden Sie anschließend eine Ringzange, um die Gebärmutterhörner vorsichtig aus der Bauchhöhle zu entfernen. Fassen Sie die Gebärmutterwand an der Lücke zwischen den Dottersäcken zweier benachbarter Embryonen und ziehen Sie vorsichtig.

Vermeiden Sie jeglichen Druck auf den Embryo, während Sie ihn durch den Schnitt ziehen. Nachdem die Gebärmutterhörner extrahiert wurden, aspirieren Sie etwa 10 bis 15 Mikroliter farbige Plasmidlösung mit der vorbereiteten Glaskapillare. Vermeiden Sie während dieses Vorgangs Luftblasen.

Halten Sie den Embryo vorsichtig mit einer Ringzange fest und lokalisieren Sie den Halsbereich. Dringen Sie mit der Spitze der Glaskapillare langsam in das dorsale Hinterhirn ein und gelangen Sie in den vierten Ventrikel. Injizieren Sie etwa einen Mikroliter der Plasmidmischung.

Vergewissern Sie sich, dass die gefärbte DNA nicht aus dem Gehirn ausgetreten ist und als rautenförmige Struktur sichtbar ist. Hier ist es am wichtigsten, den gesamten Bereich des vierten Ventrikels mit Plasmidlösung zu füllen, um die DNA auch in den distalen Teil des Kleinhirnprimordiums zu transportieren. Achten Sie gleichzeitig darauf, dass Sie während dieses Vorgangs keine Blutungen verursachen.

Platzieren Sie eine Platinpinzette, die mit Elektrodenplatten mit einem Durchmesser von fünf Millimetern ausgestattet ist, seitlich über dem Kopf des Embryos, wobei der Minuspol das Ohr bedeckt und der Pluspol am Kleinhirnprimordium über der Gebärmutterwand positioniert ist, und legen Sie elektrische Rechteckimpulse an. Wenn alle Embryonen elektroporiert wurden, setzen Sie die Gebärmutterhörner vorsichtig wieder in die Bauchhöhle ein und füllen Sie sie mit sterilem PBS. Lassen Sie die Gebärmutterhörner in eine natürliche Position gleiten.

Schalten Sie die Anästhesie aus und setzen Sie das Tier mit dem Bauch nach unten in einen neuen Käfig, damit es sich erholen kann. Fixieren Sie das Kleinhirn vor der Kryosektion über Nacht in fünf Millilitern 4%PFA in PBS pro Gehirn bei vier Grad Celsius. Am nächsten Tag wird das fixierte Kleinhirn auf zehn Milliliter 30%ige Saccharose in PBS pro Gehirn übertragen und über Nacht bei vier Grad Celsius inkubiert.

Am nächsten Tag, nachdem das Gewebe auf den Boden der Röhre gesunken ist, entfernen Sie das Gehirn aus der Saccharose und saugen Sie die restliche Saccharoselösung mit einem Stück Zellulosefilterpapier auf. Tauchen Sie anschließend jedes Kleinhirn in eine Mischung mit optimaler Schnitttemperatur in einer Einweg-Kunststoffform und frieren Sie es auf Trockeneis ein. Schneiden Sie den Kryoblock mit einem Kryostaten in 10 Mikrometer dicke Abschnitte und halten Sie die Abschnitte bis zur Verwendung bei minus 80 Grad Celsius.

Wenn Sie bereit sind, mit der Immunfärbung fortzufahren, trocknen Sie die Objektträger zuerst 30 Minuten lang bei Raumtemperatur und waschen Sie sie dann zweimal für jeweils 10 Minuten in PBS. Kreisen Sie die Schnitte mit einem Flüssigblocker ein und inkubieren Sie die Schnitte eine Stunde lang bei Raumtemperatur in Blocklösung. Fügen Sie Primärantikörper gegen die interessierenden Moleküle in der Blockierungslösung hinzu und inkubieren Sie über Nacht bei vier Grad Celsius.

Waschen Sie die Objektträger dreimal für jeweils 10 Minuten mit 0,1 % PBS-haltigem Triton. Geben Sie dann einen Fluorophor-konjugierten Sekundärantikörper hinzu, der in einer DAPI-haltigen Blockierungslösung verdünnt ist, und inkubieren Sie die Schnitte eine Stunde lang bei Raumtemperatur im Dunkeln. Waschen Sie die Objektträger dreimal für jeweils 10 Minuten in PBS-T, montieren Sie dann die Objektträger und halten Sie sie bis zur Bildgebung bei vier Grad Celsius.

hek293T-Zellen, die stabil Streptococcus pyogenes Cas9 exprimieren, wurden mit sgRNA transfiziert, die Plasmide exprimiert und auf sie abzielt. Die GFP-Expression in lebenden Zellen wurde 48 Stunden nach der Transfektion mit einem fluoreszierenden Zell-Imager überwacht. Dieses Bild zeigt eine betroffene sgRNA-Sequenz basierend auf der GFP-Expression.

Dieses Bild zeigt einen Mangel an GFP-Expression, der auf eine ineffektive sgRNA-Sequenz zurückzuführen ist. Diese Bilder zeigen die Immunfärbung von GFP, Ki67 und p27 im Kleinhirn von einer p7-rosa26-LSL-cas9-Knock-in-Maus mit floxierter Stoppkassette und stromabwärts bicistronischen cas9- und EGFP-Sequenzen, die einer Elektroporation an E13.5 mit einem Cre-Plasmid unterzogen wurde, das Kontroll-sgRNA exprimiert. Der Abschnitt ist mit DAPI gegengefärbt.

Man beachte GFP-exprimierende Zellen in der äußeren Körnerzellschicht, die mit Ki67 markiert ist. Einmal gemeistert, kann diese Operation in weniger als 30 Minuten pro Maus durchgeführt werden. Bei diesem Eingriff ist es wichtig, daran zu denken, den Embryo sehr vorsichtig zu behandeln, immer Kapillaren mit scharfen Spitzen zu verwenden und die Elektroden in einem genauen Winkel zu positionieren, um sicherzustellen, dass die elektrischen Impulse an das Dach des vierten Ventrikels abgegeben werden.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der medizinischen Wissenschaften, um die ursächlichen Faktoren der neurologischen Störungen, einschließlich der Hirntumoren im Kleinhirn der Maus, zu erforschen.