Name: Die Wege zur Aktivierung der Caspase bimolekulare Fluoreszenz Ergänzung mit Beleuchtung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Lernen Sie die bimolekulare Fluoreszenzkomplementation (BiFC) zur Visualisierung der Caspase-Aktivierung in lebenden Zellen. Diese Methode ermöglicht die Echtzeitbeobachtung von Caspase-Dimerisierung während der Apoptose.

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Wir möchten alle bisherigen Mitglieder des Bouchier-Hayes Lab zu würdigen, die für die Entwicklung dieser Technik beigetragen. Diese Arbeit wurde teilweise durch einen Texas Children Hospital Pediatric Pilot Award, LBH finanziert. Wir danken für die Erlaubnis, in Zusammenarbeit mit ihrem Team veröffentlichte Daten gehören Joya Chandra (MD Anderson, Houston, Texas). Die Entwicklung der beschriebenen Reagenzien wurde durch die Zytometrie und Zellkern Sortierung am Baylor College of Medicine unterstützt mit Mitteln aus dem NIH (NIAID P30AI036211 NCI P30CA125123 und NCRR S10RR024574) und die Unterstützung des Joel M. Sederstrom

1. Vorbereitung der Zellen und Kultur Gerichte
Hinweis: Führen Sie Schritte 1-3 in einer Gewebekultur Laminar-Flow-Haube. Tragen Sie Handschuhe.
<ol><li>Wenn unten Glasschalen, bestreichen Sie das Glas mit Fibronektin. Fahren Sie mit Schritt 1.2, wenn Kunststoffgeschirr verwenden.<ol>
<li>Machen Sie eine 0,1 mg/mL Lösung von Fibronektin: 1 mL 1 mg/mL Fibronektin Lösung in 9 mL 1 X PBS verdünnen.</li>
		<li>Bedecken Sie den Glasboden von jedem Bohrloch mit 0,5-1 mL Fibronektin und 1-5 min bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
		<li>Mit einer Pipette, sammeln die Fibronektin-Lösung und Lagerung bei 4 ° C. Hinweis: Die Fibronektin-Lösung kann mehrfach wiederverwendet werden.</li>
		<li>Das Glas einmal mit 1-2 mL 1 X PBS waschen und aspirieren von PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Platte 1 x 105 Zellen pro Bohrloch einer 6-Well-Platte in der entsprechenden Zelle 2 mL Kultur Medien (siehe Tabelle 1 für Zellzahlen für verschiedene große Brunnen verwenden). Wenn eine Zelllinie, die stabil die Caspase BiFC Komponenten ausdrückt (siehe Diskussion), Platte 2 x 105 Zellen und fahren Sie mit der Behandlungsschritt (Schritt 3).</li>
	<li>Können Sie Zellen, die Schüssel über Nacht bei 37 ° C in einer Gewebekultur Inkubator einzuhalten.</li>
</ol>2. die Transfektion von Zellen, die Caspase BiFC Komponenten einzuführen
<ol><li>Transfizieren Sie Zellen mit dem entsprechenden Transfektion Reagenz. Hinweis: Dieses Protokoll beschreibt die Anweisungen für Lipofectamine 2000, die für minimale Toxizität optimiert wurde. Dieses Protokoll wird in Hela-Zellen, Zellen MCF7 und LN18 erfolgreich eingesetzt. Wenn zusätzliche Transfektion Reagenzien folgen Sie den Anweisungen des Herstellers und nach Bedarf zu optimieren.<ol>
<li>750 µL reduzierte Serum Medien in ein steriles Röhrchen 12 µL des Transfection Reagens hinzufügen.</li>
		<li>In 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
		<li>Fügen Sie 10 ng ein Reporter Plasmid (ein Plasmid Codierung ein fluoreszierendes Protein, z.B. rot fluoreszierende Protein [Ausschreibung], die die transfizierten Zellen beschriften wird) zu einem sterilen 1,5 mL Schlauch für jedes gut zu transfiziert werden.</li>
		<li>Fügen Sie 20 ng jeder Caspase BiFC Plasmids (z. B.20 ng von Caspase-2 prodomain [Pro C2]-VC und 20 ng von C2 Pro-VN) für jedes Rohr (Tabelle 2).</li>
		<li>Bringen Sie jedes Rohr bis zu einem Gesamtvolumen von 100 µL durch Hinzufügen von reduzierten Serum Medien.</li>
		<li>Fügen Sie mit Hilfe einer Pipette p200 hinzu, 100 µL der Transfektion Reagenzlösung aus Schritt 2.1.2 Plasmid-Mischung in gewissem Sinne tropfenweise.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Plasmid-Transfection Reagens Mischung für 20 min bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Aspirieren Sie die Medien aus den Zellen mit einer Pipette oder mit Absaugung und dann mit einer Pipette p1000 pipette 800 µL Serum freier Medien sanft auf der Seite des Brunnens.</li>
		<li>Fügen Sie mithilfe einer Pipette p200 200 µL der DNA-Lipid-Komplex tropfenweise in jede Vertiefung.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Zellen in einer Gewebekultur Inkubator bei 37 ° C für 3 h.</li>
		<li>Kümmert sich nicht um die Monolage stören, entfernen die Serum freier Medien enthält die DNA-Lipid-komplexe durch Absaugen mit Absaugung oder mit einer Pipette.</li>
		<li>Pipette 2 mL vorgewärmten (37 ° C) komplette Wachstumsmedien sanft an der Seite von jedem Bohrloch.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inkubation der Zellen bei 37 ° C in einer Gewebekultur-Inkubator für 24-48 h für optimale Protein-Expression.</li>
</ol>(3) Induktion von Caspase-Aktivierung
<ol><li>Behandlung mit einem Medikament oder Anregung, die Caspase Aktivierung ca. 24 h nach Transfektion induziert.<ol>
<li>Fügen Sie die gewünschte Konzentration des Medikaments vorgewärmt (37 ° C) bildgebenden Medien (komplette Wachstumsmedien ergänzt mit Hepes [20 mM, pH 7,2-7,5] und 2-Mercaptoethanol [55 µM]) und Mischung sanft (Tabelle 3).</li>
		<li>Aspirieren Sie die Medien aus den Zellen mit einer Pipette oder mit Absaugung und dann mit einer Pipette, pipette, 2 mL der Lösung von 3.1.1 sanft auf der Seite des Brunnens.</li>
		<li>Geben Sie bildgebende Medien ohne die Droge in einer als einer unbehandelten Kontrolle.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inkubieren Sie die Zellen in einer Gewebekultur Inkubator bei 37 ° C oder gehen Sie zu Schritt 4.3 für ein Time-Lapse-Experiment.</li>
</ol>4. Caspase BiFC Datenerfassung
<ol><li>
Caspase BiFC für einzelne Punkt Erwerb
	<ol>
<li>Schalten Sie das Mikroskop und fluoreszierende Lichtquelle, die Anweisungen des Herstellers.</li>
		<li>Finden Sie die Zellen unter dem RFP Filter und konzentrieren sich auf die Reporter-gen-Fluoreszenz.</li>
		<li>Mit einer Hand-Stückzähler, zählen Sie alle RFP-positiven Zellen im Gesichtsfeld. Notieren Sie die Nummer.</li>
		<li>Unter Beibehaltung der gleichen Gesichtsfeld, wechseln Sie zu der GFP-Filter (oder YFP Filter falls vorhanden) und mit einer Hand-Stückzähler, die Anzahl der Erythrozyten, die auch grün sind (Venus-positiv). Und schalten Sie zwischen den beiden Filtern, um sicherzustellen, dass nur die roten Blutkörperchen für Venus-Positivität ausgewertet werden her. Notieren Sie die Nummer (Abbildung 3).</li>
		<li>Zählen Sie mindestens 100 RFP-positiven Zellen aller drei Einzelbereiche der Platte.</li>
		<li>In jedem Bereich Berechnung des Prozentsatzes der Venus positiven transfizierten Zellen (d.h. Erythrozyten, die auch grün sind). Durchschnitt der sich daraus ergebenden Prozentsätze um die Standardabweichung zu erhalten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Dreidimensionale Bildgebung von Caspase BiFC
	<ol>
<li>Schalten Sie das Mikroskop nach den Anweisungen des Herstellers und starten Sie der Datenerfassungs-Software zu.</li>
		<li>Wählen Sie die 60 X oder 63 X Öl Ziel und geben Sie einen Tropfen Öl auf das Ziel</li>
		<li>Ort der Kulturschale auf den Mikroskoptisch mit dem richtigen Plattenhalter.</li>
		<li>Mit entweder einem Epifluoreszenz Lichtquelle und das Mikroskop Okular oder die konfokale Laser und dem Computer-Bildschirm, navigieren Sie zu einem Feld von Interesse.</li>
		<li>Konzentrieren Sie sich auf die Reporter-Fluoreszenz der RFP Laser-oder Filter.</li>
		<li>Wenn Epifluoreszenz bis zu diesem Zeitpunkt verwendet wurde, wechseln Sie die Lichtquelle in der konfokalen Laser und visualisieren Sie das live-Bild der Zellen als durch die Kamera erworben und von der Datenerfassungs-Software auf dem Computerbildschirm angezeigt.</li>
		<li>Mit dem Joystick-Steuerung und das Fokussierrad, Feinabstimmung der Fokus und die Position der Zellen so, dass die Zellen in der Mitte des Sucher. Wählen Sie Zellen, die von einander getrennt sind und nicht überlappen.</li>
		<li>Geben Sie die Laserleistung Prozentsatz auf 50 % und die Belichtungszeit bei 100 ms für Venus und RFP als Ausgangspunkt, um die optimalen Einstellungen für das Experiment verwendet zu bestimmen.</li>
		<li>Schalten Sie live erfassen und untersuchen Sie das resultierende Bild und die dazugehörige Anzeige Histogramme für beide Kanäle.</li>
		<li>Wenn das Signal niedrig und das Bild schwer ist auszumachen, erhöhen Sie der Prozentsatz Laser macht und/oder Belichtung Zeit in Schritten, bis das Signal im Bild gut aussieht.</li>
		<li>Stellen Sie sicher, dass das Signal nicht Sättigung erreicht. Überprüfen Sie das Display Histogramm, um sicherzustellen, dass eine deutliche Spitze sichtbar für jeden Fluor ist. Wenn der Gipfel die gesamte Histogrammanzeige umfasst, geben Sie unteren Laser macht und Belichtung Einstellungen (Abbildung 2).</li>
		<li>Visualisieren Sie (unbehandelte oder nicht transfizierten) Kontrollzellen unter den gleichen Bedingungen zu gewährleisten, dass das Signal spezifisch ist. Hinweis: Einzelne Farbe Transfectants kann auch zur Kontrolle für Crossover, aber wenn die Signale räumlich unterschiedliche (z.B. mitochondriale versus cytosolischen sind) ist dies nicht notwendig.</li>
		<li>Wählen Sie oder öffnen Sie das Z-Stapel-Modul in der Mikroskop-Software.</li>
		<li>Verwenden den Fokussierknopf, ungefähre der Fokuslage entspricht der Mitte der Zelle.</li>
		<li>Stellen Sie den Fokus in eine Richtung, bis die Zelle nicht mehr sichtbar ist, wählen Sie diese Option als die Top-Position.</li>
		<li>Stellen Sie den Fokus in die entgegengesetzte Richtung, bis die Zelle wieder nicht mehr sichtbar ist, und wählen Sie diese Option als die untere Position.</li>
		<li>Wählen Sie die optimale Schrittweite (in der Regel ca. 20 µm) und die Übernahme um die Kamera ein Bild automatisch in jedem Kanal jeweils 20 µm Schritte zwischen den oberen und unteren Positionen zu beauftragen.</li>
		<li>Verwenden Sie 3D Rendering-Software, um das 3D Bild (Abbildung 4Film 1) rekonstruieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Time-Lapse Bildgebung von Caspase BiFC
	<ol>
<li>Mindestens 1 h vor dem Experiment, schalten Sie das Mikroskop und stellen Sie die Temperatur auf 37 ° C.</li>
		<li>Wählen Sie die 40 X, 60 X oder 63 X Öl Ziel und geben Sie einen Tropfen Öl auf das Ziel.</li>
		<li>Ort der Kulturschale auf den Mikroskoptisch mit dem richtigen Plattenhalter.</li>
		<li>Wenn eine CO2 Quelle verfügbar ist, legen Sie die CO2 -Lieferung-Gerät (in der Regel eine Plexiglas Deckel befestigt, die Röhre, die das CO2liefert) auf den Kennzeichenhalter. Der CO-2 -Ebene auf 5 % festgelegt und schalten Sie die CO2 Controller von innerhalb der Software. Wenn eine CO-2 -Quelle nicht verfügbar ist, sind 20 mM Hepes, die Medien zu puffern.</li>
		<li>Navigieren Sie zu einem Feld von transfizierten Zellen und visualisieren Sie das live-Bild der Zellen als durch die Kamera erworben und von der Datenerfassungs-Software auf dem Computer-Bildschirm mit dem RFP Laser angezeigt.</li>
		<li>Geben Sie nach Schritte 4.2.8-4.2.12 die Einstellungen für Prozentsatz Laser Power und Belichtung Zeit für den RFP-Laser. Halten Sie diese Werte so niedrig wie möglich, während noch in der Lage, das Fluoreszenzsignal zu erkennen.</li>
		<li>Mit einer positiven Kontrolle (Beispiele siehe Tabelle 3 ), folgen Schritte 4.2.8-4.2.12, geben Sie die Einstellungen für Prozentsatz Laser macht und Belichtung für das Laserlicht YFP probieren. Halten Sie diese Werte so gering wie möglich, während noch in der Lage, Venus Signal zu erkennen.</li>
		<li>Wählen Sie für jede Vertiefung der Platte eine Anzahl von unterschiedlichen Positionen, die eine oder mehrere Zellen, die mit dem Ausdruck der Reporters enthalten.</li>
		<li>Geben Sie das Zeitintervall zwischen den Einzelbildern Zeitraffer und totale Anzahl der Frames getroffen werden. Stellen Sie sicher, es ist Zeit, um die ausgewählten Positionen zu erwerben, bevor das nächste Bild ist zu achten.</li>
		<li>Jede Position erneut zu besuchen und zu korrigieren und den Fokus bei Bedarf aktualisieren.</li>
		<li>Um für fokale Drift zu korrigieren, die durch Veränderungen in der Temperatur oder externen Vibrationen entstehen können, schalten Sie den Fokus-Drift-Korrektur-System (falls vorhanden).</li>
		<li>Beginnen Sie den Zeitraffer und sichern Sie Ihre Daten.</li>
		<li>Analysieren Sie die Daten über verfügbare imaging-Software (Abbildung 5Movie 2).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Split fluoreszierende Proteine, Caspase induzierte Nähe zu messen. Split-Venus wurde für diese Technik gewählt, weil es sehr hell ist, photostabil und die Umfaltung ist sehr schnell 13. So kann die Analyse der Venus Umfaltung auf Caspase induzierte Nähe in der Nähe von Echtzeit-Schätzungen von Caspase Proteindynamik Interaktion bieten. Venus ist aufgeteilt in zwei leicht überlappende Fragmente, die N-Terminus von Venus (Venus-N oder VN) bestehend aus ...

Die Caspase-Protease-Familie sind bekannt für ihre kritischen Rollen in Apoptose und angeborene Immunität 1. Wegen ihrer Bedeutung bestimmen, wann, wo und wie effizient bestimmte Caspasen aktiviert bieten entscheidende Einblicke in die Mechanismen der Caspase Aktivierung Wege. Die Bildgebung basierende Protokoll hier beschriebenen ermöglicht die Visualisierung der ersten Schritte in der Caspase-Kaskade Aktivierung. Diese Technik nutzt die dynamische Protein: Protein-Interaktionen, dass Laufwerk Caspase-Aktivierung.
Die Caspasen können in zwei Gruppen unterteilt werden: der Initiator Caspasen (Caspase-1, -2,-4-5, -8,-9,-10 und-12) und der Henker Caspasen (Caspase-3,-6 und-7). Der Henker Caspasen befinden sich in der Zelle als vorgeformte Dimere und werden durch Spaltung zwischen den großen und kleinen Untereinheit 2aktiviert. Wenn aktiviert, Spalten sie zahlreiche strukturelle und regulatorische Proteine wiederum Apoptose 3. Der Initiator Caspasen sind die ersten Caspasen in einen Pfad aktiviert werden und in der Regel die Aktivierung der Henker Caspasen auslösen. Im Gegensatz zum Henker Caspasen werden durch Dimerisierung 4,5Initiator Caspasen aktiviert. Diese Dimerisierung wird durch Rekrutierung von inaktiven Monomeren zu bestimmten hohem Molekulargewicht komplexe bekannt als Aktivierung Plattformen erleichtert. Montage der Aktivierung Plattformen unterliegt einer Reihe von spezifischen Protein: Protein-Interaktionen. Diese sind vermittelt durch konserviertes Protein Interaktion Motive in der proform Initiator Caspase vorhanden und gehören der Tod Domäne (DD), Tod-Effektor-Domäne (DED) und Caspase Recruitment Domain (CARD) 6 (Abb. 1A). Aktivierung-Plattformen umfassen in der Regel einen Rezeptor und eine Adapter-Protein. Der Rezeptor wird in der Regel bei der Bindung eines Liganden induziert eine Konformationsänderung, die die Oligomerisierung von zahlreichen Molekülen ermöglicht aktiviert. Der Rezeptor rekrutiert dann entweder die Caspase direkt oder Adapter-Moleküle, die wiederum die Caspase in die Anlage bringen. So kommen zahlreiche Caspase-Moleküle in der Nähe schönem Dimerisierung. Dies wird als induzierte Nähe Modell 7bezeichnet. Sobald dimerized, erfährt die Caspase Autoprocessing, die dazu dient, das aktive Enzym 4,8zu stabilisieren. Montage von Apaf1 Apoptosome wird z. B. durch Cytochrom c nach seiner Entlassung aus den Mitochondrien in einem Prozess namens mitochondrialen Außenmembran Permeabilisierung (MOMP) ausgelöst. Apaf1 Rekruten wiederum Caspase-9 durch eine Interaktion, die durch eine Karte in beiden Proteine 9vermittelt wird. Ähnlich wie Protein-Interaktionen führen in der Montage von CD95 Tod induzieren, komplexen Signalisierung (DISC), der zur Aktivierung der Caspase-8 führt; die PIDDosome, die Caspase-2 aktivieren können; und verschiedenen Inflammasome-komplexe, die Aktivierung der Caspase-1 10,11,12zu initiieren. So, sind Initiator Caspasen, spezifische Aktivierung Plattformen rekrutiert, durch einen gemeinsamen Mechanismus, wodurch induzierte Nähe und Dimerisierung, ohne die Aktivierung nicht erfolgt.
Caspase bimolekulare Fluoreszenz-Ergänzung (BiFC) ist ein Imaging-basierte Test, der entwickelt wurde, um diesen ersten Schritt bei der Aktivierung von Initiator Caspasen Messen ermöglicht direkten Visualisierung der Caspase induzierte Nähe nach Aktivierung Plattform Montage. Diese Methode nutzt die Eigenschaften des geteilten fluoreszierenden Proteins Venus. Venus ist ein heller und mehr photostabilen Version gelb fluoreszierenden Proteins (YFP), die in zwei nicht-fluoreszierende und leicht überlappende Fragmente unterteilt werden kann: der N-Terminus von Venus (Venus N oder VN) und dem C-Terminus der Venus (Venus C oder VC). Diese Fragmente behalten die Fähigkeit zu entfalten und fluoreszierende wenn in unmittelbarer Nähe 13. Jedes Fragment Venus ist mit der prodomain der Caspase ist an der Aktivierung Plattform bindet den minimalen Teil der Caspase verschmolzen. Dadurch behalten die Caspasen nicht enzymatische Aktivität und daher ist die gleichzeitige Analyse der nachgeschalteten Ereignisse im Zusammenhang mit endogenen Veranstaltungen möglich. Die Venus Fragmente Zurückfaltung, wenn die Caspase-Prodomains zur Aktivierung Plattform rekrutiert und induzierte Nähe zu unterziehen. (Abbildung 1 b). Die daraus resultierende Venus Fluoreszenz lässt sich präzise und speziell die subzelluläre Lokalisation, die Kinetik und die Effizienz der Versammlung der Initiator Caspase Aktivierung Plattformen in einzelnen Zellen überwachen. Bilddaten können erworben werden, durch konfokale Mikroskopie oder standard Fluoreszenz-Mikroskopie und kann auf eine Reihe von verschiedenen Mikroskopie Ansätzen einschließlich angepasst werden: Zeitraffer imaging zu verfolgen Caspase-Aktivierung in Echtzeit; hochauflösende Bildgebung für die präzise Bestimmung der subzellulären Lokalisierung; und Endpunkt Quantifizierung der Effizienz der Aktivierung.
Diese Technik wurde zuerst entwickelt, um die Aktivierung von Caspase-214zu untersuchen. Während die Aktivierung Plattform für Caspase-2 angenommen wird, die PIDDosome, bestehend aus den Rezeptor PIDD (p53-induzierte Protein mit einer Domäne Tod) und der Adapter RAIDD (RIP-assoziierte ICH-1/CAD-3 homologen Protein mit einer Domäne Tod), PIDDosome-unabhängige Caspase-2 Aktivierung wurde berichtet. Dies deutet darauf hin, dass zusätzliche Aktivierung Plattformen für Caspase-2 15,16vorhanden. Trotz nicht zu wissen, die volle Komponenten der Aktivierung der Caspase-2-Plattform, hat die Caspase BiFC Technik für erfolgreiche Befragung der Caspase-2 Signalwege auf der molekularen Ebene 14,17erlaubt. Wir haben dieses Protokoll für die inflammatorischen Caspasen (Caspase-1,-4 und-5-12) auch erfolgreich angepasst 18 und im Prinzip der gleiche Ansatz sollte ausreichen, ebenso jede der verbleibenden Initiator Caspasen zu analysieren. Dieses Protokoll kann entsprechend angepasst werden, andere Wege zu untersuchen wurden Dimerisierung ist eine wichtige aktivierende Zeichen. STAT-Proteine werden zum Beispiel durch Dimerisierung nach Phosphorylierung von Janus Kinase (JAK) 19aktiviert. So konnte das BiFC System einsetzbar für STAT Aktivierung sowie viele andere Wege, die durch dynamische Proteininteraktionen geregelt zu visualisieren. Das folgende Protokoll bietet schrittweise Anleitungen für die Einführung der Reporter in Zellen sowie Methoden zur Bildaufnahme und Analyse.

<table><tbody><tr><td>6-Well-Unbeschichtet Nr. 1,5 20 mm Glasbodenschalen</td><td>Mattek</td><td>P06G-1.5-20-F</td><td></td></tr><tr><td>Menschliches Plasma Fibronektin Gereinigtes Protein</td><td>Millipore</td><td>FC010-10MG</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Sigma</td><td>D8537-6x500ML</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 Reagenz</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>OPTI MEM I</td><td>Invitrogen</td><td>31985088</td><td></td></tr><tr><td>C2-Pro VC Plasmid</td><td>Addgene</td><td>49261</td><td></td></tr><tr><td>C2-Pro VN Plasmid</td><td>Addgene</td><td>49262</td><td></td></tr><tr><td>Entzündungs-Caspase-BiFC-Plasmide</td><td></td><td></td><td>erhältlich auf Anfrage von LBH</td></tr><tr><td>HeLa-Zellen, die die C2-Pro BiFC-Komponenten</td><td></td><td></td> stabil exprimieren, <td>erhältlich auf Anfrage von LBH</td></tr><tr><td>DsRed Mito Plasmid</td><td>Clontech</td><td>632421</td><td>ähnliche Plasmide, die als fluoreszierende Reporter verwendet werden können, finden sich auf Addgene</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Invitrogen</td><td>15630106</td><td></td></tr><tr><td>2 Mercaptoethanol 1000X</td><td>Invitrogen</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>q-VD-OPH</td><td>Apex Bio</td><td>A1901</td><td></td></tr></tbody></table>

die wege zur aktivierung der caspase bimolekulare fluoreszenz ergänzung mit beleuchtung

Lighting Up the Pathways to Caspase Activation Using Bimolecular Fluorescence Complementation

Die Familie Caspase Proteasen spielen eine entscheidende Rolle in Apoptose und angeborene Immunität. Unter diesen eine Untergruppe, bekannt als Initiator Caspasen sind die ersten, die in diesen Bahnen aktiviert werden. Zu dieser Gruppe gehören Caspase-2-9-8, sowie die inflammatorischen Caspasen, Caspase-1,-4 und-5. Der Initiator Caspasen sind alle durch Dimerisierung nach der Einstellung zu bestimmten Multi-komplexe genannt Aktivierung Plattformen aktiviert. Caspase bimolekulare Fluoreszenz-Ergänzung (BiFC) ist ein Imaging-basierte Ansatz dem geteilt fluoreszierende Proteine fusioniert, Initiator Caspasen verwendet, um die Rekrutierung von Initiator Caspasen zu ihrer Aktivierung-Plattformen und die daraus resultierenden visualisieren induzierte Nähe. Diese Fluoreszenz bietet eine Anzeige von einer der frühesten für Initiator Caspase Aktivierung erforderlichen Schritte. Mit einer Reihe von verschiedenen Mikroskopie-basierte Ansätze, bieten diese Technik quantitative Daten über die Effizienz der Caspase-Aktivierung auf einem Niveau der Bevölkerung sowie die Kinetik der Caspase-Aktivierung und die Größe und Anzahl der Aktivierung von caspase komplexe pro Zelle.

Ein Beispiel von Caspase-2 BiFC durch DNA-Schäden induzierte ist in Abbildung 3dargestellt. Camptothecin, eine Topoisomerase ich Inhibitor, wurde verwendet, um DNA-Schäden und Caspase-2 Aktivierung induzieren. Das rot fluoreszierende Protein mCherry diente als Reporter zu zeigen, dass die Zellen die BiFC Sonde auszudrücken und zu helfen, die Gesamtzahl der Zellen zu visualisieren. Venus Fluoreszenz ist grün dargestellt und die großen Puncta stellen Caspase-2 ...

Dieses Protokoll beschreibt Caspase bimolekulare Fluoreszenz-Ergänzung (BiFC); eine Imaging-basierte Methode, die verwendet werden, um induzierte Nähe der Initiator Caspasen, zu visualisieren, das ist der erste Schritt in ihre Aktivierung.

Die Wege zur Aktivierung der Caspase bimolekulare Fluoreszenz Ergänzung mit Beleuchtung

The caspase family of proteases play essential roles in apoptosis and innate immunity. Among these, a subgroup known as initiator caspases are the first ...

Das übergeordnete Ziel dieser Methodik ist es, einen der ersten Schritte bei der Aktivierung eines Initiators Caspasen zu visualisieren. Dieser Schritt wird als induzierte Nähe bezeichnet und tritt auf, wenn Caspase-Moleküle während des apoptotischen Zelltods zusammenkommen, um aktive Dimere zu bilden. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Caspase-Feld zu beantworten, z. B. wann, wo und wie effizient bestimmte Initiator-Caspasen aktiviert werden können.Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass man den Aufbau von Caspase-Aktivierungskomplexen in lebenden Zellen in Echtzeit visualisieren kann. Bei dieser biomolekularen Fluoreszenz-Komplementationsmethode werden Fragmente des Thyroxinproteins Venus verwendet, die in eine Caspase infundiert wurden. Die Fragmente sind nicht von sich aus fluoreszierend, aber wenn die Caspase eine induzierte Nähe erfährt, bringt dies die beiden Venushälften zusammen und sie leuchten auf.Um die Zellen zu transfizieren, geben Sie zunächst 12 Mikroliter des Transfektionsreagenzes zu 750 Mikrolitern reduziertem Serummedium in einem sterilen Röhrchen. Inkubieren Sie die Mischung fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Geben Sie dann 10 Nanogram

lighting-up-pathways-to-caspase-activation-using-bimolecular

Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Die subzelluläre Lokalisierung von Proteinen ist bei der Bestimmung der räumlich-zeitliche Regulation der zellulären Signalübertragung wichtig. Hier beschreiben wir bimolekularen Fluoreszenz Komplementation (BIFC) als eine einfache Methode zur Überwachung der räumlichen Wechselwirkungen von Proteinen in der Zelle.

Bimolekularen Fluoreszenz Komplementation

Dieses Video beschreibt BiFC-PALM ― eine Kombination aus photoaktivierter Lokalisationsmikroskopie und bimolekularer Fluoreszenzkomplementierung ― zur Beurteilung von Protein-Protein-Wechselwirkungen. BiFC beinhaltet die Fusion von zwei fluoreszierenden Proteinfragmenten mit zwei interagierenden Proteinen von Interesse. Wenn die beiden Proteine interagieren, werden die Fragmente in die Nähe gebracht, wodurch die beiden Teile zusammenkommen und ein funktionsfähiges fluoreszierendes Protein...

Bimolekulare Fluoreszenz-Komplementierungs-gekoppelte photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie

Dieses Video zeigt die Aktivierung von Caspase-Proteinen in menschlichen Makrophagen unter Verwendung von bimolekularen Fluoreszenz-Komplementations-Reporterproteinen. Die Pro-Domänen von Caspase-1 sind mit nicht-fluoreszierenden Fragmenten von Venusproteinen fusioniert, die zu Inflammasom-Komplexen rekrutiert werden. Die Nähe von Inflammasomen induziert die Rückfaltung und Fluoreszenz von Venusfragmenten, was die Caspase-Aktivierung in den Makrophagen bestätigt.

Visualisierung der Caspase-Aktivierung in humanen Monozyten-abgeleiteten Makrophagen

Die hier beschriebene Methode wird verwendet, um die apoptotische Signalkaskade in definierten Schritten zu induzieren, um die Aktivität eines anti-apoptotischen bakteriellen Effektorproteins zu entschlüsseln. Diese Methode kann auch zur induzierbaren Expression von pro-apoptotischen oder toxischen Proteinen oder zur Störung von Interferenzen mit anderen Signalwegen verwendet werden.

Anlegen eines induzierbaren Expression System zu Störungen der bakteriellen Virulenzfaktoren mit Intrazelluläre Signal Studieren

Protein-Wechselwirkungen werden in Zellen mit räumlicher Auflösung im Nanometerbereich visualisiert, indem die bimolekulare Fluoreszenzkomplemmentierung (BiFC) mit der photoaktivierten Lokalisationsmikroskopie (PALM) kombiniert wird. Beschrieben wird hier die Verwendung von BiFC-PALM zur Abbildung von Ras-Raf-Wechselwirkungen in U2OS-Zellen zur Visualisierung des nanoskaligen Clusterings und der Diffusion einzelner Ras-Raf-Komplexe.

Photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie mit Bimolekulare Fluoreszenzkomplementation (BIFC-PALM)

Um gesunde Zellen in ganzen Tieren erkennen , die geringe Mengen an Caspase - Aktivität enthalten, die hochempfindliche Biosensor bezeichnet CaspaseTracker wurde für Drosophila erzeugt. Caspase-abhängigen Biosensor-Aktivität wird in langlebigen gesunden Zellen in den inneren Organen der erwachsenen Tiere aufgezogen unter optimierten Bedingungen in Abwesenheit von Tod Stimuli detektiert.

In - vivo - Biosensor - Spuren Non-apoptotischen Caspase - Aktivität in Drosophila

Anastasis ist technisch anspruchsvoll, um in Vivo zu erkennen, da die Zellen, die der Zelle Todesprozess umgekehrt haben morphologisch nicht zu unterscheiden von normalen gesunden Zellen sein können. Hier beschreiben wir Protokolle für die Erkennung und Verfolgung von Zellen, die Anastasis mit lebenden Tieren zu unterziehen, durch den Einsatz unserer neu entwickelten in Vivo -CaspaseTracker-Biosensor-System.

Erkennung von Anastasis In Vivo durch CaspaseTracker Biosensor

Biolumineszenz-Licht, das von einem Luciferase-Enzym emittiert wird, das ein niedermolekulares Substrat, ein Luciferin, oxidiert, kann genutzt werden, um photosensorische Proteine zu aktivieren, wodurch der Lichtstimulation eine weitere Dimension hinzugefügt und die Manipulation einer Vielzahl von lichtvermittelten Funktionen in Zellen über zeitliche und räumliche Skalen hinweg ermöglicht wird.

Biolumineszente Optogenetik 2.0: Nutzung der Biolumineszenz zur Aktivierung photosensorischer Proteine in vitro und in vivo

Dieses Protokoll beschreibt den Arbeitsablauf zur Gewinnung von Monozyten-abgeleiteten Makrophagen (MDM) aus menschlichen Blutproben, eine einfache Methode zur effizienten Einführung von BiFC-Reportern (Bimolecular Fluorescence Complementation) in das menschliche MDM, ohne die Lebensfähigkeit und das Verhalten der Zellen zu beeinträchtigen, und einen bildgebenden Ansatz zur Messung der entzündlichen Caspase-Aktivierung in lebenden Zellen.

Visualisierung von entzündlichen Kaspasen induzierter Nähe in humanen Monozyten-abgeleiteten Makrophagen

Dieses Protokoll beschreibt eine umfassende Methode zur Beurteilung der Caspase-Aktivierung (Caspase-1, Caspase-3, Caspase-7, Caspase-8, Caspase-9 und Caspase-11) als Reaktion auf In-vitro - und In-vivo-Modelle (in Mäusen) von Infektionen, sterilen Beleidigungen und Krebs, um die Initiierung von Zelltodwegen wie Pyroptose, Apoptose, Nekroptose und PANoptose zu bestimmen.

Evaluierung der Caspase-Aktivierung zur Beurteilung des angeborenen Immunzelltods

Das vorliegende Protokoll beschreibt zwei Methoden zur Messung der Caspase-Aktivität durch ein fluorogenes Substrat unter Verwendung von Durchflusszytometrie oder einem Spektrofluorometer.

Messung der Caspase-Aktivität mit einem fluorometrischen Assay oder einer Durchflusszytometrie

Lernen Sie die bimolekulare Fluoreszenzkomplementation (BiFC) zur Visualisierung der Caspase-Aktivierung in lebenden Zellen. Diese Methode ermöglicht die Echtzeitbeobachtung von Caspase-Dimerisierung während der Apoptose.

Die Wege zur Aktivierung der Caspase bimolekulare Fluoreszenz Ergänzung mit Beleuchtung

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