Die Wege zur Aktivierung der Caspase bimolekulare Fluoreszenz Ergänzung mit Beleuchtung

Das übergeordnete Ziel dieser Methodik ist es, einen der ersten Schritte bei der Aktivierung eines Initiators Caspasen zu visualisieren. Dieser Schritt wird als induzierte Nähe bezeichnet und tritt auf, wenn Caspase-Moleküle während des apoptotischen Zelltods zusammenkommen, um aktive Dimere zu bilden. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Caspase-Feld zu beantworten, z. B. wann, wo und wie effizient bestimmte Initiator-Caspasen aktiviert werden können.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass man den Aufbau von Caspase-Aktivierungskomplexen in lebenden Zellen in Echtzeit visualisieren kann. Bei dieser biomolekularen Fluoreszenz-Komplementationsmethode werden Fragmente des Thyroxinproteins Venus verwendet, die in eine Caspase infundiert wurden. Die Fragmente sind nicht von sich aus fluoreszierend, aber wenn die Caspase eine induzierte Nähe erfährt, bringt dies die beiden Venushälften zusammen und sie leuchten auf.

Um die Zellen zu transfizieren, geben Sie zunächst 12 Mikroliter des Transfektionsreagenzes zu 750 Mikrolitern reduziertem Serummedium in einem sterilen Röhrchen. Inkubieren Sie die Mischung fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Geben Sie dann 10 Nanogramm eines Reporterplasmids in ein 1,5-Milliliter-Steylröhrchen für jede zu transfizierende Vertiefung.

Geben Sie 20 Nanogramm jedes Caspase-BiFC-Plasma in jedes Röhrchen. Bringen Sie jedes Röhrchen auf ein Gesamtvolumen von 100 Mikrolitern, indem Sie reduziertes Serummedium hinzufügen. Geben Sie mit einer P200-Pipette tropfenweise 100 Mikroliter Transfektionsreagenzlösung in die Plasmidmischung.

Nach 20-minütiger Inkubation des Plasmidtransfektionsreagenzmixes bei Raumtemperatur wird das Medium mit einer Pipette oder durch Absaugen aus den Zellen aspiriert. Pipettieren Sie dann mit einer P1000-Pipette 800 Mikroliter serumfreies Medium vorsichtig an der Seite der Vertiefung hinunter. Geben Sie mit einer P200-Pipette 200 Mikroliter des DNA-Lipidkomplexes tropfenweise in jede Vertiefung

Inkubieren Sie die Zellen in einem Gewebekultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius für drei Stunden. Nach der Inkubation ist das serumfreie Medium, das die DNA-Lipidkomplexe enthält, durch Aspiration durch Saugen oder mit der Pipette zu entfernen, wobei darauf zu achten ist, dass die Monoschicht nicht beschädigt wird. Pipettieren Sie zwei Milliliter vorgewärmtes vollständiges Wachstumsmedium vorsichtig an der Seite jeder Vertiefung entlang, bevor Sie die Zellen inkubieren, wie im Textprotokoll beschrieben.

Führen Sie vor der Datenerfassung die Induktion der Caspase-Aktivierung durch, wie im Textprotokoll beschrieben. Schalten Sie das Mikroskop gemäß den Anweisungen des Herstellers ein und starten Sie die Erfassungssoftware. Wählen Sie das 60x oder 63x Ölobjektiv und geben Sie einen Tropfen Öl auf das Objektiv.

Stellen Sie dann die Kulturschale mit dem richtigen Plattenhalter auf den Mikroskoptisch. Schalten Sie die Heizung ein und stellen Sie die Temperatur auf 37 Grad Celsius ein. Fokussieren Sie sich auf die Reporterfluoreszenz mit dem RFP-Laser oder -Filter.

Geben Sie die prozentuale Laserleistung bei 50 % und die Belichtungszeit bei 100 Millisekunden für Venus und RFP als Ausgangspunkt ein, um die optimalen Einstellungen für das Experiment zu bestimmen. Schalten Sie die Live-Aufnahme ein und überprüfen Sie das resultierende Bild und die angezeigten Histogramme für beide Kanäle. Wenn das Signal schwach ist und das Bild schwer zu erkennen ist, erhöhen Sie die prozentuale Laserleistung und/oder die Belichtungszeit in Schritten, bis das Signal und das Bild gut aussehen.

Wählen Sie als Nächstes das Z-Stapel-Modul in der Mikroskopsoftware aus oder öffnen Sie es. Passen Sie den Fokus in eine Richtung an, bis die Zelle nicht mehr sichtbar ist. Wählen Sie diese Position als oberste Position aus.

Stellen Sie den Fokus in die entgegengesetzte Richtung ein, bis die Zelle wieder nicht mehr sichtbar ist, und wählen Sie diese Position als untere Position. Wählen Sie die optimale Schrittweite und starten Sie die Erfassung. Passen Sie bei Bedarf das Anzeigehistogramm an, um die visuelle Darstellung des Fluoreszenzsignals zu verbessern.

Verwenden Sie schließlich eine dreidimensionale Rendering-Software, um das 3D-Bild zu rekonstruieren. Wenn eine Kohlendioxidquelle verfügbar ist, platzieren Sie die Kohlendioxidabgabevorrichtung auf dem Tellerhalter. Stellen Sie den Kohlendioxidgehalt auf 5 % ein und schalten Sie den Kohlendioxidregler in der Software ein.

Navigieren Sie zu einem Feld mit transfizierten Zellen. Visualisieren Sie das Live-Bild der Zellen, wie es von der Kamera aufgenommen und von der Erfassungssoftware auf dem Computerbildschirm mit dem RFP-Laser angezeigt wird. Geben Sie als Nächstes die Einstellungen für die prozentuale Laserleistung und die Belichtungszeit für den RFP-Laser ein.

Geben Sie dann die Einstellung für die prozentuale Laserleistung und die Belichtungszeit für das YFP-Laserlicht ein. Wählen Sie für jede Vertiefung der Platte eine Reihe verschiedener Positionen aus, die eine oder mehrere Zellen enthalten, die den Reporter exprimieren. Geben Sie das Zeitintervall zwischen den einzelnen Frames der Zeitraffer und der Gesamtzahl der zu nehmenden Frames ein.

Überprüfen Sie jede Position und korrigieren und aktualisieren Sie den Fokus nach Bedarf. Starten Sie den Zeitraffer und speichern Sie die Daten. Analysieren Sie abschließend die Daten mit der verfügbaren Bildgebungssoftware, wie im Textprotokoll beschrieben.

Hier sehen Sie ein Beispiel für Caspase-2-BiFC nach DNA-Schäden. Die Zellen wurden mit einem Topoisomerase-Eins-Inhibitor behandelt: Camptothecin. Das rot fluoreszierende Protein mCherry wurde als Reporter verwendet, um zu zeigen, dass die Zellen die BiFC-Sonde exprimieren und die Gesamtzahl der Zellen sichtbar machen.

Die Venusfluoreszenz ist grün dargestellt und die großen Punktzahlen repräsentieren die Caspase-2-induzierte Nähe. Um eine hochauflösende Visualisierung der subzellulären Lokalisation des Caspase-Aktivierungskomplexes zu ermöglichen, können einzelne Zellen dreidimensional abgebildet werden. Die Caspase-2-Aktivierung ist hier grün und der Zellkern rot dargestellt.

Die orthoganale Schnittansicht der Zelle wird angezeigt, in der die xy-Ebene, die yz-Ebene und die xz-Ebene nebeneinander visualisiert werden können. Das dreidimensionale Bild kann auch in einem Film dargestellt werden, in dem die Zelle um die y-Achse gedreht wird. Zur Bereitstellung kinetischer Daten der Caspase kann BiFC-Zeitraffer-Imaging verwendet werden.

Dieser Film zeigt die Caspase-2-Aktivierung in Grün nach der Behandlung mit dem Proteasom-Inhibitor Bortezomib. Die Mitochondrien sind rot dargestellt. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Caspase BiFC verwenden können, um den Aufbau der Caspase-Aktivierungskomplexe in Echtzeit zu verfolgen und die Größe, Form und Lokalisation der produzierten Komplexe eindeutig zu bestimmen.

Dieses Protokoll beschreibt einige mikroskopische Ansätze zum Sammeln der Ergebnisse für das Caspase-BiFC-Experiment; Es sollte jedoch beachtet werden, dass eine Reihe von Variationen und Kombinationen dieser Ansätze verwendet werden können, um Caspase-Aktivierungswege kreativ zu hinterfragen. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, Kontrollen von mikroskopieinduzierten Artefakten wie Phototoxizität und Photobleichen einzubeziehen. Das begleitende Textprotokoll enthält Tipps, um dies zu erreichen.

Die Entscheidung, welche Erfassungs- und Analysemethode verwendet werden soll, hängt von den zu untersuchenden Perimetern und der Verfügbarkeit von Instrumenten und Bildgebungssoftware ab. Im Anschluss an dieses Verfahren können bildgebende Analyseansätze zur Interpretation der Daten verwendet werden. Sie können Änderungen der Fluoreszenzintensität im Laufe der Zeit oder des Prozentsatzes der fluoreszierenden Zellen messen.

Auch die Anzahl der Brennpunkte oder die Objektgröße können berechnet werden.