Charakterisierung von Immunzellen im menschlichen Fettgewebe mittels Durchflusszytometrie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, mit Hilfe der Durchflusszytometrie die stromale Gefäßfraktion aus menschlichem Fettgewebe zu isolieren, um die verschiedenen Immunzellpopulationen im Fettgewebe zu phänotypisieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen der Stoffwechselforschung zu beantworten, etwa welche Immunzellen sich in welchem Ausmaß im Fettgewebe adipöser Personen anreichern. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die gleichzeitige Messung mehrerer Marker auf Immunzellen und die Identifizierung und Quantifizierung dieser Immunzellen im Fettgewebe ermöglicht.

Obwohl diese Technik entscheidende Einblicke in die Entzündung des Fettgewebes liefern kann, kann sie auch auf andere Organe und Gewebe angewendet werden. Im Allgemeinen haben Personen, die mit dieser Technik noch nicht vertraut sind, während des Färbeverfahrens hauptsächlich mit einer Kontamination der stromalen Gefäßzellen und dem Verlust von Zellen zu kämpfen. Zwei meiner Doktoranden, Suzan Wetzels und Mitchell Bijnen, werden das Protokoll ausführen.

Beginnen Sie damit, mit einem Skalpell ein Gramm Fettgewebebiopsie in etwa zwei Millimeter große Stücke zu zerkleinern. Übertragen Sie die Stücke in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und geben Sie 10 Milliliter Kollagenaselösung zu den Proben. Inkubieren Sie die Gewebefragmente 60 Minuten lang in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad mit 60 Zyklen pro Minute.

Gefolgt von der Filtration durch ein 200-Mikrometer-Sieb in ein neues konisches 50-Milliliter-Rohr. Spülen Sie den Filter vor der Zentrifugation mit sieben Millilitern PBS. Verwenden Sie dann eine Pipette, um den Überstand zu entfernen, ohne die gesamte Pipettenspitze in die Lösung zu tauchen.

Das Pellet sollte gut sichtbar sein und fast alle Überstände entfernen, um eine Kontamination der stromalen Gefäßfraktion mit Fettzellen zu vermeiden. Wir suspendieren das stromale Gefäßzellpellet mit fünf Millilitern frischem PBS und filtrieren die stromale Gefäßfraktion durch ein 70-Mikrometer-Sieb in ein neues Röhrchen. Nach der Zentrifugation suspendieren wir das gewaschene Pellet der stromalen Gefäßfraktion fünf Minuten lang in drei Millilitern Erythrozyten-Lysepuffer auf Eis.

Dann stoppen Sie die Lyse mit sieben Millilitern PBS und pelletieren die Zellen durch Zentrifugation. Um die stromale Gefäßfraktion für die durchflusszytometrische Analyse zu färben, resuspendieren Sie das Pellet in 90 Mikrolitern mit einer fluoreszenzaktivierten Zellsortierung (FACS-Puffer) von vier Grad Celsius und blockieren Sie die unspezifische Färbung mit zehn Mikrolitern humanem IgG. Teilen Sie die Zellsuspension auf zwei Vertiefungen einer 96-Well-Platte mit V-Boden auf und legen Sie die Zellen 15 Minuten lang auf Eis.

Waschen Sie am Ende der Inkubation jede Probe mit 100 Mikrolitern FACS-Puffer und drehen Sie die Platte in einer sanften Bewegung auf den Kopf, ohne zu klopfen, um die Überstände am Ende der Zentrifugation zu entsorgen. Stellen Sie sicher, dass Sie das Pellet am Boden der Platte deutlich sehen können, bevor Sie es auf den Kopf stellen, um einen Verlust Ihrer Zellen während des Eingriffs zu verhindern. Resuspendieren Sie das erste Pellet in 29,5 Mikrolitern Antikörpercocktail für das erste FACS-Panel und das zweite Pellet in 23 Mikrolitern Antikörpercocktail für das zweite FACS-Panel.

Nach 30 Minuten auf Eis im Dunkeln waschen Sie die Zellen mit 150 Mikrolitern FACS-Puffer pro Vertiefung und fixieren die Zellpellets in 150 Mikrolitern einprozentiger Formaldehydlösung. Übertragen Sie die Zellsuspensionen aus jeder Vertiefung in die entsprechenden FACS-Röhrchen und legen Sie die Proben auf Eis. Laden Sie vor der Analyse eine ungefärbte Negativkontrolle auf das Durchflusszytometer, um die Parameter für die Vorwärtsstreuung und die Seitenstreuung einzustellen.

Passen Sie dann die Spannungen des Durchflusszytometers gemäß den Anweisungen des Herstellers an, bis alle interessierenden Populationen in den Vorwärts- und Seitenstreudiagrammen sichtbar sind und zwischen den Trümmern und den lebenden Zellen unterschieden werden kann. Wenn alle Parameter eingestellt sind, wird die erste experimentelle Probe bei 800 U/min vortext, um die Zellen gründlich zu resuspendieren und die Probe auf das Zytometer zu laden. Lesen Sie mindestens 50.000 Ereignisse im Live-Gate, dann einen Vortex und laden Sie die zweite Probe zur Analyse, wie gerade gezeigt.

Um die Analyse der Fettgewebe-Makrophagenpopulationen in diesem repräsentativen Experiment zu ermöglichen, wurden andere Immunzellen wie T-Zellen, B-Zellen, Neutrophile und natürliche Killerzellen ausgeschlossen, um das Vorhandensein von CD11b+CD11c+Makrophagen, CD11B+CD11C-Makrophagen und CD11Blow-CD11C+dendritischen Zellen zu zeigen. Die Quantifizierung der Hauptfluoreszenzintensität dieser Zellen ergab die Expression von plasmazytoiden dendritischen Zellen und generischen dendritischen Zellmarkern auf den CD11B+CD11C+- und CD11Blow-CD11C+-Zellen, wobei eine höhere Expression beider Marker auf den CD11Blow-CD11C+-Zellen beobachtet wurde, was bestätigt, dass es sich bei den CD11Blow-CD11C+-Zellen tatsächlich um dendritische Zellen handelte. Das Gating der CD45-positiven Zellen ergab CD19-positive B- und CD3-positive T-Zellpopulationen, von denen letztere weiter unterteilt werden konnten in CD3+CD4+T-Helfer- und CD3+CD8+zytotoxische T-Zell-Untergruppen sowie CD3-CD56+natürliche Killerzellen.

Der Prozentsatz lebensfähiger Immunzellen wurde dann für jeden Probanden berechnet, was einen signifikanten Anstieg des Prozentsatzes an proinflammatorischen CD11B+CD11C+Makrophagen im viszeralen Fettgewebe adipöser erwachsener männlicher Probanden zeigte. Einmal gemeistert, kann diese Technik innerhalb von vier Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, die Puffer und Zellfraktionen auf Eis zu halten, und bei der Markierung der Zellen mit Antikörpern ist es sehr wichtig, sie im Dunkeln zu halten.

Nach ihrer Entwicklung ermöglichte diese Technik Forschern auf dem Gebiet der Stoffwechselforschung, die Veränderungen der Immunzellen im Fettgewebe des Menschen zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Immunzellen des Fettgewebes isoliert und wie man eine Durchflusszytometrie an diesen Zellen durchführt. Denken Sie daran, dass Sie mit potenziell infektiösem menschlichem Material und Substanzen wie Formaldehyd arbeiten, die gefährlich sein können.

Tragen Sie immer vorsichtig Handschuhe und eine Schutzbrille.