Charakterisierung von Immunzellen im menschlichen Fettgewebe mittels Durchflusszytometrie
6. März 2018
Dieser Artikel beschreibt eine Methode, um Immunzelle Inhalt des Fettgewebes durch Isolierung der Immunzellen aus Fettgewebe und anschließende Analyse mit Durchflusszytometrie zu analysieren.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, mit Hilfe der Durchflusszytometrie die stromale Gefäßfraktion aus menschlichem Fettgewebe zu isolieren, um die verschiedenen Immunzellpopulationen im Fettgewebe zu phänotypisieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen der Stoffwechselforschung zu beantworten, etwa welche Immunzellen sich in welchem Ausmaß im Fettgewebe adipöser Personen anreichern. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die gleichzeitige Messung mehrerer Marker auf Immunzellen und die Identifizierung und Quantifizierung dieser Immunzellen im Fettgewebe ermöglicht.
Obwohl diese Technik entscheidende Einblicke in die Entzündung des Fettgewebes liefern kann, kann sie auch auf andere Organe und Gewebe angewendet werden. Im Allgemeinen haben Personen, die mit dieser Technik noch nicht vertraut sind, während des Färbeverfahrens hauptsächlich mit einer Kontamination der stromalen Gefäßzellen und dem Verlust von Zellen zu kämpfen. Zwei meiner Doktoranden, Suzan Wetzels und Mitchell Bijnen, werden das Protokoll ausführen.
Beginnen Sie damit, mit einem Skalpell ein Gramm Fettgewebebiopsie in etwa zwei Millimeter große Stücke zu zerkleinern. Übertragen Sie die Stücke in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und geben Sie 10 Milliliter Kollagenaselösung zu den Proben. Inkubieren Sie die Gewebefragmente 60 Minuten lang in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad mit 60 Zyklen pro Minute.
Gefolgt von der Filtration durch ein 200-Mikrometer-Sieb in ein neues konisches 50-Milliliter-Rohr. Spülen Sie den Filter vor der Zentrifugation mit sieben Millilitern PBS. Verwenden Sie dann eine Pipette, um den Überstand zu entfernen, ohne die gesamte Pipettenspitze in die Lösung zu tauchen.
Das Pellet sollte gut sichtbar sein und fast alle Überstände entfernen, um eine Kontamination der stromalen Gefäßfraktion mit Fettzellen zu vermeiden. Wir suspendieren das stromale Gefäßzellpellet mit fünf Millilitern frischem PBS und filtrieren die stromale Gefäßfraktion durch ein 70-Mikrometer-Sieb in ein neues Röhrchen. Nach der Zentrifugation suspendieren wir das gewaschene Pellet der stromalen Gefäßfraktion fünf Minuten lang in drei Millilitern Erythrozyten-Lysepuffer auf Eis.
Dann stoppen Sie die Lyse mit sieben Millilitern PBS und pelletieren die Zellen durch Zentrifugation. Um die stromale Gefäßfraktion für die durchflusszytometrische Analyse zu färben, resuspendieren Sie das Pellet in 90 Mikrolitern mit einer fluoreszenzaktivierten Zellsortierung (FACS-Puffer) von vier Grad Celsius und blockieren Sie die unspezifische Färbung mit zehn Mikrolitern humanem IgG. Teilen Sie die Zellsuspension auf zwei Vertiefungen einer 96-Well-Platte mit V-Boden auf und legen Sie die Zellen 15 Minuten lang auf Eis.
Waschen Sie am Ende der Inkubation jede Probe mit 100 Mikrolitern FACS-Puffer und drehen Sie die Platte in einer sanften Bewegung auf den Kopf, ohne zu klopfen, um die Überstände am Ende der Zentrifugation zu entsorgen. Stellen Sie sicher, dass Sie das Pellet am Boden der Platte deutlich sehen können, bevor Sie es auf den Kopf stellen, um einen Verlust Ihrer Zellen während des Eingriffs zu verhindern. Resuspendieren Sie das erste Pellet in 29,5 Mikrolitern Antikörpercocktail für das erste FACS-Panel und das zweite Pellet in 23 Mikrolitern Antikörpercocktail für das zweite FACS-Panel.
Nach 30 Minuten auf Eis im Dunkeln waschen Sie die Zellen mit 150 Mikrolitern FACS-Puffer pro Vertiefung und fixieren die Zellpellets in 150 Mikrolitern einprozentiger Formaldehydlösung. Übertragen Sie die Zellsuspensionen aus jeder Vertiefung in die entsprechenden FACS-Röhrchen und legen Sie die Proben auf Eis. Laden Sie vor der Analyse eine ungefärbte Negativkontrolle auf das Durchflusszytometer, um die Parameter für die Vorwärtsstreuung und die Seitenstreuung einzustellen.
Passen Sie dann die Spannungen des Durchflusszytometers gemäß den Anweisungen des Herstellers an, bis alle interessierenden Populationen in den Vorwärts- und Seitenstreudiagrammen sichtbar sind und zwischen den Trümmern und den lebenden Zellen unterschieden werden kann. Wenn alle Parameter eingestellt sind, wird die erste experimentelle Probe bei 800 U/min vortext, um die Zellen gründlich zu resuspendieren und die Probe auf das Zytometer zu laden. Lesen Sie mindestens 50.000 Ereignisse im Live-Gate, dann einen Vortex und laden Sie die zweite Probe zur Analyse, wie gerade gezeigt.
Um die Analyse der Fettgewebe-Makrophagenpopulationen in diesem repräsentativen Experiment zu ermöglichen, wurden andere Immunzellen wie T-Zellen, B-Zellen, Neutrophile und natürliche Killerzellen ausgeschlossen, um das Vorhandensein von CD11b+CD11c+Makrophagen, CD11B+CD11C-Makrophagen und CD11Blow-CD11C+dendritischen Zellen zu zeigen. Die Quantifizierung der Hauptfluoreszenzintensität dieser Zellen ergab die Expression von plasmazytoiden dendritischen Zellen und generischen dendritischen Zellmarkern auf den CD11B+CD11C+- und CD11Blow-CD11C+-Zellen, wobei eine höhere Expression beider Marker auf den CD11Blow-CD11C+-Zellen beobachtet wurde, was bestätigt, dass es sich bei den CD11Blow-CD11C+-Zellen tatsächlich um dendritische Zellen handelte. Das Gating der CD45-positiven Zellen ergab CD19-positive B- und CD3-positive T-Zellpopulationen, von denen letztere weiter unterteilt werden konnten in CD3+CD4+T-Helfer- und CD3+CD8+zytotoxische T-Zell-Untergruppen sowie CD3-CD56+natürliche Killerzellen.
Der Prozentsatz lebensfähiger Immunzellen wurde dann für jeden Probanden berechnet, was einen signifikanten Anstieg des Prozentsatzes an proinflammatorischen CD11B+CD11C+Makrophagen im viszeralen Fettgewebe adipöser erwachsener männlicher Probanden zeigte. Einmal gemeistert, kann diese Technik innerhalb von vier Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, die Puffer und Zellfraktionen auf Eis zu halten, und bei der Markierung der Zellen mit Antikörpern ist es sehr wichtig, sie im Dunkeln zu halten.
Nach ihrer Entwicklung ermöglichte diese Technik Forschern auf dem Gebiet der Stoffwechselforschung, die Veränderungen der Immunzellen im Fettgewebe des Menschen zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Immunzellen des Fettgewebes isoliert und wie man eine Durchflusszytometrie an diesen Zellen durchführt. Denken Sie daran, dass Sie mit potenziell infektiösem menschlichem Material und Substanzen wie Formaldehyd arbeiten, die gefährlich sein können.
Tragen Sie immer vorsichtig Handschuhe und eine Schutzbrille.
Übersicht
In diesem Artikel wird ein ausführliches Durchflusszytometrie-Protokoll zur Isolierung und Phänotypisierung von Immunzellpopulationen aus menschlichem Fettgewebe (AT) vorgestellt. Durch die Analyse der stromalen vaskulären Fraktion (SVF) aus subkutanem und viszeralem AT können Forscher Immunzellsubpopulationen quantitativ und qualitativ bewerten und dadurch Einblicke in die Entzündung des Fettgewebes sowie deren Rolle bei komplikationsassoziierten Erkrankungen im Zusammenhang mit Adipositas erhalten.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Immunologie
- Stoffwechselforschung
- Zellbiologie
Hintergrund
- Die Infiltration von Immunzellen im Fettgewebe trägt zu einer chronischen, niedriggradigen Entzündung bei, die mit Adipositas und Typ-2-Diabetes assoziiert ist.
- Das Verständnis der Zusammensetzung der Immunzellen im Fettgewebe ist entscheidend für die Erforschung von Stoffwechselerkrankungen.
- Mittels Durchflusszytometrie können mehrere Marker von Immunzellen gleichzeitig erfasst werden.
- Bewährte Methoden stoßen bei der Zellverarbeitung häufig auf Probleme mit Kontaminationen und Zellverlust.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines robusten Durchflusszytometrie-Protokolls zur Isolierung und Charakterisierung von Immunzellen aus menschlichem Fettgewebe.
- Möglichmachung der quantitativen und qualitativen Analyse von Immunzellsubpopulationen in subkutanem und viszeralem Fettgewebe (AT).
- Unterstützung der Forschung zu den immunologischen Mechanismen, die der obesitybedingten Entzündung zugrunde liegen.
Verwendete Methoden
- Gewebeproben des zerkleinerten Fettgewebes werden mit Kollagenase verdaut.
- Die Filtration und Zentrifugation trennen die stromal-vaskuläre Fraktion (SVF) von Adipozyten ab.
- Es erfolgt eine Lyse der roten Blutkörperchen sowie mehrfache Waschschritte mit PBS.
- Die SVF-Zellen werden mit fluoreszierenden Antikörpanelen, die gegen membranständige Marker gerichtet sind, gefärbt.
- Mittels Durchflusszytometrie werden die Immunzellpopulationen analysiert und quantifiziert.
Hauptergebnisse
- Identifizierung und Quantifizierung pro- und antiinflammatorischer Makrophagensubpopulationen, dendritischer Zellen, B-Zellen, CD4+- und CD8+-T-Zellen sowie NK-Zellen im menschlichen Fettgewebe (AT).
- Nachweis einer erhöhten Anzahl proinflammatorischer CD11B+CD11C+-Makrophagen im viszeralen Fettgewebe (AT) von adipösen Probanden.
- Klare Unterscheidung zwischen Makrophagen- und dendritischen Zellpopulationen anhand der Expression spezifischer Marker.
- Zuverlässige Gating-Strategien zur Identifizierung von B-, T- und NK-Zellsubpopulationen innerhalb der stromal-vaskulären Fraktion (SVF).
Schlussfolgerungen
- Dieses Durchflusszytometrie-Protokoll ermöglicht ein detailliertes Immunprofil von menschlichem Fettgewebe.
- Die Methode ist an zusätzliche Marker anpassbar und kann auf andere Gewebe angewendet werden.
- Sie stellt ein wertvolles Werkzeug für die metabolische und immunologische Forschung zur obesitybedingten Entzündung dar.
Häufig gestellte Fragen
Praktische Bedeutung für die Industrie
Die quantitative Immunzell-Profilierung im menschlichen Fettgewebe ist entscheidend, um Stoffwechselerkrankungs-Ziele sicherer zu gestalten und entzündliche Mechanismen bei fettleibigkeitsassoziierten Erkrankungen aufzuklären. Die durchflusszytometrische Charakterisierung der stromavaskulären Fraktion ermöglicht eine inhaltsreiche, reproduzierbare Analyse von Immunzellsubpopulationen und stützt die Vorhersagekraft in der frühen Forschung und translationsmedizinischen Untersuchung. Diese Fähigkeit stärkt Portfolio-Entscheidungen, indem sie robuste, quantitative Daten zu Immunzeldynamiken in krankheitsrelevanten Geweben liefert.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die Untersuchung der Akkumulation und des Phänotyps von Immunzellen im Fettgewebe im Hinblick auf Hypothesen zu Stoffwechselerkrankungen.
- Unterstützt die biologische Entlastung durch Unterscheidung pro- und antiinflammatorischer Makrophagensubpopulationen sowie anderer Immunzellpopulationen.
- Bietet eine quantitative Immunprofilerstellung, um Entscheidungen zur Zielvalidierung und -priorisierung zu begründen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Ermöglicht die validierte Identifizierung von Immunzellsubpopulationen für die Entwicklung und Durchführung nachgeschalteter Assays und Screening-Workflows.
- Unterstützt die Reproduzierbarkeit und Standardisierung von Assays mittels multiparametrischer Durchflusszytometrie-Panels.
- Ermöglicht skalierbare, quantitative Auswertungen der Zusammensetzung von Immunzellen in Gewebeproben.
Translationale und präklinische Forschung
- Ermöglicht die Abstimmung des Immunzellprofils mit krankheitsrelevantem menschlichen Gewebe und unterstützt damit translationsorientierte Biomarker-Strategien.
- Gewährleistet Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung, indem eine Immunüberwachung in menschlichen Proben ermöglicht wird.
- Verringert das Risiko falscher mechanistischer Annahmen bezüglich der Entzündung in Modellen metabolischer Erkrankungen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Dieses Durchflusszytometrie-Protokoll integriert sich in den Übergang von der Entdeckung zur präklinischen Phase, indem es eine robuste Analyse von Immunzellen in menschlichen Fettgewebeproben ermöglicht.
- Entdeckungsbioanalytik: Unterstützt die Hypothesenprüfung zur Immunzellinfiltration und -phänotyp bei Stoffwechselerkrankungen.
- Screening: Bietet standardisierte, quantitative Daten zu Immunzellsubpopulationen für die Bereitschaft von Assays.
- Analytik: Liefert multiparametrische Messungen und Gating-Strategien für vergleichende Immunprofilerstellung.
- Translationale Forschung: Verbindet die Dynamik von Immunzellen im menschlichen Gewebe mit präklinischen Studien und Biomarker-Analysen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Anpassbares Protokoll für verschiedene Gewebe und Markerpanele, das eine breite Nutzung in Forschung und Entwicklung unterstützt.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Unklarheiten bei immunvermittelten Krankheitsmodellen.
- Operativer Wert: Standardisiert die Immunphänotypisierung mit reproduzierbaren, skalierbaren Arbeitsabläufen.
- Strategischer Wert: Unterstützt Go/No-Go-Entscheidungen und verbessert die Kapitalnutzung, indem immunologische Mechanismen geklärt werden.
- Portfolio-Implikation: Ermöglicht die risikoadjustierte Priorisierung von Programmen zu Stoffwechsel- und Entzündungskrankheiten.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der Durchflusszytometrie und der Auswahl von Immunzellmarkern.
- Benötigt Zugang zu hochparametrischen Durchflusszytometern und validierten Antikörpersets.
- Erfordert eine strenge, standardisierte Vorgehensweise zwischen Teams bei der Probenvorbereitung und den Gating-Strategien.
- Kann auf andere Gewebe übertragen werden, erfordert jedoch möglicherweise eine Optimierung des Protokolls für unterschiedliche Probenarten.
- Die Beachtung von Zellverlust und Kontamination ist entscheidend für die Reproduzierbarkeit und Datenqualität.
