Name: Charakterisierung von Immunzellen im menschlichen Fettgewebe mittels Durchflusszytometrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Erfahren Sie die Durchflusszytometrie zur Isolierung und Charakterisierung von Immunzellen aus dem Stromal-Vaskulär-Fraktion menschlichen Fettgewebes. Diese Methode ermöglicht die quantitative Analyse immunologischer Zellpopulationen.

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Wir möchten danken J. van de Steuervermeidung und M. Vroomen (Universität Maastricht, Niederlande), für die technische Unterstützung. Darüber hinaus möchten wir K. Verboven, D. Hansen, J. Jocken, danken und E. Blaak für die Bereitstellung von Blut und Gewebe-Biopsien zum Einrichten dieses Protokolls und der nachfolgenden Experimente verwendet.

Themen, die in die Studie genehmigt von der medizinischen Ethik Komitee Jessa Krankenhaus, Hasselt und Universität Hasselt, Belgien in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki aufgenommen wurden viszeralen und subkutanen Proben entnommen.
1. Vorbereitung der Reagenzien
<ol><li>Kollagenase-Lösung<ol>
<li>Lösen Sie 1 g der Kollagenbildung zwischengespeichert ich in 10 mL von Phosphat Kochsalzlösung (PBS, ohne Calcium und Magnesium) um eine 100 mg/mL Stammlösung zu machen. 200 µL-Aliquots Vorbereitung und Lagerung bei-20 ° C.</li>
		<li>Lösen Sie 1 g von Kollagenase XI in 10 mL PBS eine 100 mg/mL Stammlösung zu machen. 200 µL-Aliquots Vorbereitung und Lagerung bei-20 ° C.</li>
		<li>Auflösen von 10 mg der DNase I 10 mL PBS eine 10 mg/mL Stammlösung zu machen. Bereiten Sie 180 µL-Aliquots und Lagerung bei-20 ° C.</li>
		<li>Hinzufügen von 100 µL Collagenase I (100 mg/mL), 100 µL Collagenase XI (100 mg/mL) und 90 µL DNase I (10 mg/mL) bis 10 mL DMEM Schinken F12. Machen Sie Kollagenase-Lösung für jede Isolierung frisch.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Erythrozyten-Lyse-Puffer<ol>
<li>0,84 g NH4Cl in 100 mL hochreines Wasser auflösen.</li>
		<li>Den pH auf 7,4 vor Gebrauch festgelegt. In einem Glaskolben bei 4 ° c lagern</li>
		<li>Ort der Erythrozyten Lyse Puffer auf dem Eis vor Gebrauch.</li>
	</ol>
</li>
	<li>FACS-Puffer<ol>
<li>Auflösen von 0,5 g Rinderserumalbumin (BSA) in 100 mL PBS, 0,5 % BSA PBS zu erhalten.</li>
		<li>Auflösen von 65 mg NaN3 in 100 mL 0,5 % BSA PBS 10 mM NaN3 0,5 % BSA PBS zu erhalten. Store-Lösung in einem Glaskolben bei 4 ° C.</li>
		<li>Ort FACS-Puffer auf dem Eis vor Gebrauch. Achtung: NaN3 ist hochgiftig. Arbeiten in einer Dampfhaube und Schutzbrille und Handschuhe zum Schutz beim Umgang mit NaN3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Menschliche IgG-block<ol>
<li>Lösen Sie 10 mg von menschlichen IgG in 10 mL PBS, 1 mg/mL zu erhalten. 100 µL-Aliquots Vorbereitung und Lagerung bei-20 ° C.</li>
		<li>Platzieren Sie den menschliche IgG-Block auf dem Eis vor Gebrauch.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Isolierung des SVF von AT
<ol><li>Kleinschneiden Sie 1 g bei Biopsie (± 2 mm2) mit einem Skalpell und Transfer in ein 50 mL Zentrifugenröhrchen (z.B. Falcon-Röhrchen). 10 mL Kollagenase Lösung zu jedem Beispiel zugeben. Hinweis: Schließen Sie den Deckel des Rohres vollständig und drehen Sie den Deckel ¼ Umdrehung zurück.</li>
	<li>Inkubation für 60 min bei 37 ° C in einem Wasserbad unter sanft schütteln (60 Zyklen/Min.).</li>
	<li>Filtern Sie die entstandene Suspension mit einem 200 µM-Filter und sammeln Sie die Probe in eine neue 50 mL Zentrifugenröhrchen. Fügen Sie 7 mL PBS auf den Filter zu spülen den Filter alle Zellen hinzu.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Probe bei 280 X g für 5 min bei 4 ° C.</li>
	<li>Entfernen Sie die schwimmenden Adipocyte Bruchteil durch pipettieren. Die Zelle-Kugel ist der SVF. Hinweis: Entfernen Sie den Adipocyte Bruchteil um SVF zu erhalten. Vermeiden Sie die gesamte Spitze der Stichprobe untertauchen, weil dadurch nur der PBS und nicht die schwimmenden Fettzellen entfernt werden.</li>
	<li>Aufschwemmen der SVF in 5 mL PBS Kollagenase zu entfernen, die Aufhängung mit einem 70 µM-Filter filtern, spülen den Filter mit 5 mL PBS und Zentrifugieren der Probe bei 280 X g für 5 min bei 4 ° C.</li>
	<li>Entfernen des Überstands und das Pellet in 3 mL Erythrozyten Lyse Puffer Aufschwemmen.</li>
	<li>Inkubieren Sie für 5 min auf Eis. 7 mL PBS nach Inkubation hinzugeben.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Probe bei 280 X g für 5 min bei 4 ° C.</li>
</ol>3. Färbung des SVF für Flow Cytometry Analysis
<ol><li>Auflösen der Zelle Pellet in 90 µL 4 ° C FACS Puffer und 10 µL 1 mg/mL menschliche IgG-Block hinzufügen. Teilen Sie die Zellsuspension in 2 Brunnen eine V-Form 96-well-Platte. Die Platte auf dem Eis und lassen Sie die menschliche IgG-Block für 15 min inkubieren.</li>
	<li>Jede Probe zu waschen und die Platte für 5 min bei 280 X g bei 4 ° c zentrifugiert fügen Sie 100 µL FACS Puffer hinzu Den Überstand durch Kippen der Plattenrandes auf dem Kopf stehend in einer fließenden Bewegung ohne Tippen auf die Platte zu entfernen. Hinweis: Stellen Sie sicher, jede restliche Flüssigkeit von der Oberseite der Platte mit einem Taschentuch zu entfernen, während die Platte auf dem Kopf stehend zu halten.</li>
	<li>Bereiten Sie Antikörper Cocktails für Makrophagen und DC Teilmengen (FACS-Panel 1) und T - und B-Zell-Subsets (FACS-Panel 2) wie in Tabelle 1 und Tabelle 2beschrieben. Die Bände, die in Tabelle 1 und Tabelle 2 beschrieben werden ausgewählt nach der Optimierung der Antikörper-Konzentrationen und sind ausreichend für eine Mehrwertsteuer oder sAT Probe. Hinweis: Im Bedienfeld "FACS" 1, verwenden die Marker CD303 und CD141 um zu bestätigen, dass CD11C+ CD11Bniedrigen Zellen sind DCs. Es wird jedoch empfohlen, diese Marker aus dem Panel auf einen lebenden/Toten Färbung auszuschließen. Beide FACS-Panel 1 und 2 sind kombinierbar mit der LIVE/DEAD fixierbar Red Dead Cell Fleck Kit Lebensfähigkeit Färbung wenn ausgenommen CD303 in Panel 1 als PE-Kanal unbenutzt sein wird. Durchführen Sie Lebensfähigkeit Färbung nach den Anweisungen des Herstellers.</li>
	<li>Das Pellet in 29,5 µL Antikörper cocktail für FACS Panel 1 und 23 µL Antikörper cocktail für FACS-Panel 2 aufzuwirbeln. Inkubieren Sie für 30 Minuten im Dunkeln auf dem Eis.</li>
	<li>Jedes gut 150 µL FACS Puffer hinzu und Aufschwemmen der Zelle Pellet um einen zweiten Waschschritt durchzuführen. Zentrifugieren Sie die Platte für 5 min bei 280 x g und 4 ° C. Den Überstand durch Kippen der Plattenrandes auf den Kopf zu entfernen.</li>
	<li>Geben Sie 150 µL 1 % Formaldehyd-Lösung in jeder der Zellen zu beheben. Übertragen Sie die Zellsuspension aus jedem Brunnen mit dem entsprechenden FACS-Rohr durch Pipettieren mit einer Pipette P200. FACS-Rohre bei 4 ° C in den dunklen bis zu 7 Tage aufbewahren. Hinweis: Direkte Messung ist auch möglich. Fügen Sie 150 µL FACS Puffer in jede Vertiefung statt 1 % Formaldehyd hinzu, übertragen Sie die Zellen durch Pipettieren mit einer P200-Pipette auf die entsprechenden FACS-Rohre und analysieren Sie die Zellen zu. Achtung: Formaldehyd ist sehr giftig. Bereiten Sie Formaldehyd-Lösungen während der Arbeit in einer Dampfhaube nicht einatmen und tragen Sie Handschuhe und Schutzbrille zum Schutz vor.</li>
</ol>(4) Flow Cytometry Analysis
<ol><li>Vor der ersten Messung mithilfe eines ungefärbten Negativkontrolle forward Scatter (FSC) und Side Scatter (SSC) festlegen. Passen Sie die Spannungen der Durchflusszytometer gemäß den Anweisungen des Herstellers, sodass alle Populationen von Interesse im FSC und SSC Diagramm sichtbar sind und eine zwischen Schutt und lebenden Zellen Unterscheidung.</li>
	<li>Durchführen Sie Multi-Color Compensation Analyse mit Antikörper erfassen Perlen nach Protokoll des Herstellers.</li>
	<li>Bereiten Sie Fluoreszenz minus 1 (FMO) Kontrollen durch Herstellung der Antikörper-Mischung aber schließen Sie einen Antikörper aus dem Mix aus. Dies gilt für jeden Antikörper, Schaffung von 8 Antikörper-Mischungen für FACS Panel 1 und 6 Antikörper-Mischungen für FACS-Panel 2. Diese FMO Antikörper Mischungen dienen, SVF, wie zuvor beschrieben in diesem Protokoll zu beflecken.</li>
	<li>Messen Sie alle FMO Steuerelemente und der gating-Strategie basierend auf FMO-Steuerelemente. Verwenden Sie die FMO-Steuerelemente möglich Auto-Fluoreszenz der Zellen zu erkennen. Hinweis: Entfernen Sie einen Antikörper aus dem Mix, Fluoreszenz-Ebene erkannt in diesem Kanal ist ein Hintergrund/Autofluorescent Signal. Daher, durch den Vergleich der verschiedenen FMO Kontrollergebnisse FACS, Tore auf bestimmte Bevölkerungsgruppen, um sicherzustellen, dass die Gatings auf positive Zellen basieren und nicht auf Auto-Fluoreszenz basiert gezogen werden können.</li>
	<li>Wirbel der FACS-Rohre bei 800 u/min vor der Einlagerung in das Durchflusszytometer und die Messung starten. Hinweis: Mindestens 50.000 Veranstaltungen im live Tor wird empfohlen, um sicherzustellen, dass genügend Zellen von jeder Subpopulation gemessen werden.</li>
</ol>

<ol><li>McNelis, J. C., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages%2C+immunity%2C+and+metabolic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Macrophages, immunity, and metabolic disease.</a> Immunity. 41 (1), 36-48 (2014).</li>
<li>Makki, K., Froguel, P., Wolowczuk, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+in+obesity-related+inflammation+and+insulin+resistance%3A+cells%2C+cytokines%2C+and+chemokines%5BTitle%5D)+AND+%22ISRN+Inflamm%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue in obesity-related inflammation and insulin resistance: cells, cytokines, and chemokines.</a> ISRN Inflamm. 2013, 139239(2013).</li>
<li>DeFuria, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cells+promote+inflammation+in+obesity+and+type+2+diabetes+through+regulation+of+T-cell+function+and+an+inflammatory+cytokine+profile%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">B cells promote inflammation in obesity and type 2 diabetes through regulation of T-cell function and an inflammatory cytokine profile.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (13), 5133-5138 (2013).</li>
<li>Elgazar-Carmon, V., Rudich, A., Hadad, N., Levy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+transiently+infiltrate+intra-abdominal+fat+early+in+the+course+of+high-fat+feeding%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Neutrophils transiently infiltrate intra-abdominal fat early in the course of high-fat feeding.</a> J Lipid Res. 49 (9), 1894-1903 (2008).</li>
<li>Han, J. M., Levings, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+regulation+in+obesity-associated+adipose+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immune regulation in obesity-associated adipose inflammation.</a> J Immunol. 191 (2), 527-532 (2013).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+deficiency+and+pharmacological+stabilization+of+mast+cells+reduce+diet-induced+obesity+and+diabetes+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Genetic deficiency and pharmacological stabilization of mast cells reduce diet-induced obesity and diabetes in mice.</a> Nat Med. 15 (8), 940-945 (2009).</li>
<li>Nishimura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8%2B+effector+T+cells+contribute+to+macrophage+recruitment+and+adipose+tissue+inflammation+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">CD8+ effector T cells contribute to macrophage recruitment and adipose tissue inflammation in obesity.</a> Nat Med. 15 (8), 914-920 (2009).</li>
<li>Koh, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+vascular+fraction+from+adipose+tissue+forms+profound+vascular+network+through+the+dynamic+reassembly+of+blood+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Stromal vascular fraction from adipose tissue forms profound vascular network through the dynamic reassembly of blood endothelial cells.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (5), 1141-1150 (2011).</li>
<li>Peinado, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stromal-vascular+fraction+of+adipose+tissue+contributes+to+major+differences+between+subcutaneous+and+visceral+fat+depots%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">The stromal-vascular fraction of adipose tissue contributes to major differences between subcutaneous and visceral fat depots.</a> Proteomics. 10 (18), 3356-3366 (2010).</li>
<li>Leggate, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+inflammatory+and+prominent+proteomic+changes+in+plasma+and+adipose+tissue+after+high-intensity+intermittent+training+in+overweight+and+obese+males%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Determination of inflammatory and prominent proteomic changes in plasma and adipose tissue after high-intensity intermittent training in overweight and obese males.</a> Journal of Applied Physiology. 112 (8), 1353-1360 (2012).</li>
<li>Divoux, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+cells+in+human+adipose+tissue%3A+link+with+morbid+obesity%2C+inflammatory+status%2C+and+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Mast cells in human adipose tissue: link with morbid obesity, inflammatory status, and diabetes.</a> J Clin Endocrinol Metab. 97 (9), E1677-E1685 (2012).</li>
<li>Harford, K. A., Reynolds, C. M., McGillicuddy, F. C., Roche, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fats%2C+inflammation+and+insulin+resistance%3A+insights+to+the+role+of+macrophage+and+T-cell+accumulation+in+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nutr+Soc%22%5BJournal%5D)">Fats, inflammation and insulin resistance: insights to the role of macrophage and T-cell accumulation in adipose tissue.</a> Proc Nutr Soc. 70 (4), 408-417 (2011).</li>
<li>Lumeng, C. N., Bodzin, J. L., Saltiel, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity+induces+a+phenotypic+switch+in+adipose+tissue+macrophage+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Obesity induces a phenotypic switch in adipose tissue macrophage polarization.</a> J Clin Invest. 117 (1), 175-184 (2007).</li>
<li>Morris, D. L., Singer, K., Lumeng, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+macrophages%3A+phenotypic+plasticity+and+diversity+in+lean+and+obese+states%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Clin+Nutr+Metab+Care%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue macrophages: phenotypic plasticity and diversity in lean and obese states.</a> Curr Opin Clin Nutr Metab Care. 14 (4), 341-346 (2011).</li>
<li>Wentworth, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pro-inflammatory+CD11c%2BCD206%2B+adipose+tissue+macrophages+are+associated+with+insulin+resistance+in+human+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Pro-inflammatory CD11c+CD206+ adipose tissue macrophages are associated with insulin resistance in human obesity.</a> Diabetes. 59 (7), 1648-1656 (2010).</li>
<li>Wouters, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+classical+monocytes+are+associated+with+CD11c%2B+macrophages+in+human+visceral+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Circulating classical monocytes are associated with CD11c+ macrophages in human visceral adipose tissue.</a> Sci Rep. 7, 42665(2017).</li>
<li>Duan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+macrophage+subpopulations+characterize+acute+infection+and+chronic+inflammatory+lung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Distinct macrophage subpopulations characterize acute infection and chronic inflammatory lung disease.</a> J Immunol. 189 (2), 946-955 (2012).</li>
<li>Li, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autofluorescence+contributes+to+false-positive+intracellular+Foxp3+staining+in+macrophages%3A+a+lesson+learned+from+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Autofluorescence contributes to false-positive intracellular Foxp3 staining in macrophages: a lesson learned from flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 386 (1-2), 101-107 (2012).</li>
</ol>

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Diese Methoden beschreiben, wie die SVF von der Mehrwertsteuer zu isolieren und saß und die relativen Mengen von Immunzellen in diesen Geweben zu quantifizieren. Darüber hinaus geben die Methoden wie die Expression von Markern auf bestimmte Zelltypen zu bestimmen.
Durchflusszytometrie von Immunzellen Gewebe ist eine leistungsfähige Technik für Phänotyp der immunologischen Zustand der Gewebe. Die Quantifizierung der Gewebe Immunzellen kann viele Anwendungen haben. Wie in den Ergebnissen beschrieben, ist es möglich, das Vorhandensein von bestimmten Immunzellen zwischen Gruppen von Patienten (z.B.mageres vs. fettleibig) zu vergleichen. Darüber hinaus können indem auch die Durchflusszytometrie auf Blut von den gleichen Patienten, Assoziationen zwischen zirkulierenden Zellen und Gewebe untersucht werden. Mit dieser Anwendung konnten wir feststellen, dass eine bestimmte Teilmenge der zirkulierenden Monozyten mit Pro-inflammatorischen CD11C verbunden ist+ Fettgewebe Makrophagen16.
Anpassungen des beschriebenen Protokolls werden ihre Anwendungen erweitern, wie zahlreiche verfügbare fluoreszierende Antikörper Durchflusszytometrie sehr vielseitig machen. Mit verschiedenen Antikörpern lassen sich fast alle Zelltypen unterscheiden und der Ausdruck der vielen Marker detektiert werden. Darüber hinaus ist es möglich, Marker intrazellulär zu beflecken, durch permeabilizing der Zellmembran intrazelluläre Bindung von fluoreszierenden Antikörpern zu ermöglichen. Diese Eigenschaften erlauben Unterscheidung der unterschiedlichsten Makrophagen Bevölkerungen über die übermäßig vereinfachten M1 und M2-Makrophagen-Subtypen. Neben der Messung der Oberfläche Marker Ausdruck können Proteine (z.B. Zytokine) intrazellulär mit Informationen über Makrophagen Funktionalität befleckt werden. Darüber hinaus werden Proliferationsmarker wie Ki67 zur Verbreitung Preise zu quantifizieren. Wie beschrieben, basierte Unterscheidung zwischen Makrophagen und DCs auf MFI Ebenen der DC-Marker. Ein allgemeine Makrophagen Marker, wie CD68 kann die Makrophagen-Panel (FACS-Panel 1) integriert werden. CD68 muss jedoch intrazellulär erfordern Permeabilisierung der Zellmembran befleckt werden, das ist nicht besser und das Protokoll erweitern würde. Weitere Makrophagen-Marker sind Teilmenge Markierungen wie CD163 und CD206 oder CD11c, letztere in der hier vorgestellten Makrophagen-Panel integriert.
In unseren FACS-Panels, ein Marker, lebende und tote Zellen zu unterscheiden wurde nicht aufgenommen, was wäre vorzuziehen, weil es einen genauere Ausschluss von abgestorbenen Zellen als die Verwendung von FSC und SSC ermöglicht. Häufig sind die DNA Färbung, Lebensfähigkeit Farbstoffe Propidium Jodid (PI) oder 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) sowie freie Amin reagiert Farbstoffe wie die LIVE/DEAD fixierbar tote Zelle färben Kit, die in verschiedenen Dye Farben erhältlich. Jedoch kann nicht PI und DAPI verwendet werden, wenn die Zellen zu fixieren. Wie im Protokoll beschrieben, die LIVE/DEAD fixierbar Red Dead Cell Lebensfähigkeit Färbung in beide Platten integrierbar ohne Auswirkungen auf die gesamte FACS Anspritzung Strategie.
Darüber hinaus werden die Daten ausgedrückt als Prozentsatz der lebenden Zellen, was bedeutet, dass alle Daten sind relativ. Nur durch Eingabe einer genauen, wäre bekannt, Anzahl der Zellen in das Durchflusszytometer es möglich die genauen Zahlen der einzelnen Zelle bestimmen. Eine ungefähre Anzahl von Zellen konnte nach dem zählen der Zellen in der SVF-Fraktion mithilfe einer Zählkammer berechnet werden. Diese Zahl müsste für die Höhe der Biopsie Gewebe verwendet, um die SVF isolieren angepasst werden, aber dies hat Einschränkungen beim lehnen zu fettleibig zu vergleichen. Eine ähnliche Masse von adipösen AT besteht aus weniger Fettzellen, wie sie mit Lipiden gefüllt sind und stark erweitert haben. Dies führe zu einer Unterschätzung der Immunzelle Zahl wenn als Anzahl der Immunzellen pro Gramm bei oder Adipocyte dargestellt.
In Humanstudien erfolgt Einbeziehung von Patienten in der Regel über einen längeren Zeitraum hinweg machen Standardisierung von experimentellen Verfahren von großer Bedeutung. Für den Vergleich von Flow Cytometry Daten zwischen Patienten gibt es mehrere Möglichkeiten. Wie in diesem Protokoll beschrieben, können Zellen vor der Messung erlaubt die Analyse von mehreren Proben am gleichen Tag behoben werden. Dies kann auch erreicht werden, durch das Einfrieren der SVF, bevor sie beflecken, wodurch das Färbeverfahren zwischen allen Proben gleich sein, aber die Lebensfähigkeit der Zellen beeinträchtigt werden könnte. Zu guter Letzt auch in dieser Studie beschäftigt, fluoreszierende Perlen Vergütungsstufen zu installieren sind und Cytometer Tracking Perlen wurden zweimal wöchentlich verwendet, um tägliche Messungen der Cytometer standardisieren. Diese letzte Option ist die effizienteste beim Ausmessen von Proben aus einer Studie, die über einen langen Zeitraum hinweg.
Ein limitierender Faktor für Durchflusszytometrie ist im Allgemeinen die Verwendung der Fluoreszenz. Die Anzahl der Fluoreszenzmarkierungen, die gleichzeitig erkannt werden können ist begrenzt durch Überlappung in Emissionsspektren. Jedoch kann mit smart FACS-Panel-Entwicklung und den Einsatz von mehrere Antikörper Cocktails pro MwSt oder sAT Probe, dieses Problem überwinden, wie in diesem Protokoll beschrieben. Ein wichtiger Aspekt der FACS-Panel-Entwicklung ist FMO Kontrollen. Mithilfe des Fensters mit einer Ausnahme alle Antikörper können potenzielle Autofluoreszenz Ebenen beim Vergleich der FMO mit Vollelement geschätzt werden. Dies ermöglicht genaue Anspritzung von Populationen und diese Verfahren durchgeführt werden, wenn Sie ein neues FACS-Panel einrichten. Darüber hinaus können neue Generationen von FACS-Geräte bis zu 50 Parameter ermöglicht simultane Detektion von vielen Merkmalen pro Zelle erkennen. Ein weiteres Problem im Zusammenhang mit der Fluoreszenz-Aspekt ist die Autofluoreszenz der Zellen, insbesondere Makrophagen. Nach Anregung der Zellen mit dem FACS-Laser (vor allem mit 488 nm Wellenlänge Anregung), diese Zellen emittieren ein Fluoreszenzsignal (hauptsächlich < 640 nm), dass können Überschneidungen mit den Emissions-Spektren des Antikörpers Etiketten17,18. Um dies zu berücksichtigen, sollte ungefärbte Zellen gemessen werden, um festzustellen, die Autofluoreszenz in jedem Kanal. Mit diesem wissen sollten Fluorochromes ausgewählt werden, in denen eine Signalstärke angezeigt, die das Autofluorescent Signal. Diese Autofluorescent Hintergrundsignal sollte bei der Festlegung die gating-Strategie der Bevölkerung berücksichtigt werden. Durch Anwendung dieses Protokolls und intelligente FACS-Panel-Design ist es deshalb möglich, in Tiefe Phänotyp Makrophagen Subtypen. Neue eindeutige AT Makrophagen und deren Funktion charakterisiert werden können.

Adipositas ist gekennzeichnet mit Low-Grade AT Entzündung1 und Infiltration von Pro-inflammatorischen Immunzellen im viszeralen und subkutanen an (MwSt., saß). Ansammlung von Pro-inflammatorischen Immunzellen in den Bottich führt zu einer Insulinresistenz ist ein primärer Risikofaktor für die Entwicklung von Typ-2-Diabetes-2. Immunzellen der angeborenen und der adaptiven Immunsystems befinden sich in der übergewichtige, wie Makrophagen, Mastzellen, Neutrophile, CD4+ und CD8+ T-Zellen und B-Zellen3,4,5,6 ,7. Diese Immunzellen zusammen mit Endothelzellen, stromale Zellen Adipocyte Stammväter, Fibroblasten und Perizyten, bilden die SVF-8 und sind die wichtigste Quelle von Pro-inflammatorischen Substanzen im AT9.
Der Entzündungsstatus AT wird häufig durch Techniken einschließlich Western-Blot10, qPCR11und Immunohistochemistry11untersucht. Jedoch ist bei der Verwendung dieser Techniken, die gesamte AT, Adipozyten und SVF verwendet. Dies macht es schwierig zu bestimmen, die Menge und Teilmengen von Immunzellen in der AT vorhanden. Immunzellen haben verschiedene Zelle Marker zu definieren und zu kategorisieren, wie z. B. Makrophagen. Makrophagen zeigen erhebliche Heterogenität in Funktion und Zelle Oberfläche Marker Ausdruck12. Daher sind sie oft in zwei Populationen von Makrophagen kategorisiert: M1 und M2. M2-Makrophagen nennt man in der Regel Alternativ aktivierten Makrophagen12,13 und befinden sich in der schlanken, metabolisch normale Menschen14. Tritt jedoch bei Übergewicht, ein phänotypische Schalter von M2-Makrophagen, M1 Makrophagen. Diese aktiviert klassisch M1 Makrophagen express CD11C12 und reichern sich um tote Adipozyten, Krone-artige Strukturen13zu bilden. Es hat sich gezeigt, dass CD11C+ Makrophagen in der Insulinwirkung beeinträchtigen und Insulinresistenz bei adipösen Menschen15zugeordnet sind. Immunohistochemistry ist zur Erkennung von M1 und M2-Makrophagen im AT eine Option. Diese Technik bietet Informationen über den Standort von den Makrophagen im Gewebe. Allerdings schränkt es die Anzahl der Markierungen, die in einer Färbung verwendet werden können. Darüber hinaus ist es auch schwierig zu quantifizieren. Um die verschiedenen Immunzellen Teilmengen in der Mehrwertsteuer und sAT Einlagen zu untersuchen, haben wir daher einen Flow Cytometry Ansatz entwickelt. Dieser Ansatz ermöglicht es uns, mehrere Markierungen pro Zelle mit einem Flow-Zytometrie-Analyse zu Zelle Teilmengen zu definieren und zählen die Anzahl der einzelnen Untergruppen in den AT-Ablagerungen vorhanden.

<table><tbody><tr><td>Zentrifuge</td><td>Hettich Rotanta 460R</td><td>5660</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modifizierter Adler" s Medium (DMEM)-Schinken" s F12</td><td>Gibco ThermoFisher</td><td>31330-095</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase XI aus Clostridium histolyticum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7657-1g</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase I aus Clostridium histolyticum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0130-1g</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I aus der bovinen Bauchspeicheldrüse</td><td>Sigma Aldrich</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Merck</td><td>1.01145.0500</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserum Albumin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4503-100</td><td></td></tr><tr><td>NaN3</td><td>Merck</td><td>1.06688.0100</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro; M Spritze Filcons</td><td>BD Biosciences</td><td>340613</td><td></td></tr><tr><td>70 &micro; M Filter</td><td>Greiner Bio-one</td><td>542070</td><td></td></tr><tr><td>Fc Block / human IgG</td><td>Sigma Aldrich</td><td>14506</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>Merck</td><td>1.04003.2500</td><td></td></tr><tr><td>CD11b-BV421</td><td>Biolegend</td><td>301324</td><td></td></tr><tr><td>CD19-Fitc</td><td>BD Biosciences</td><td>555412</td><td></td></tr><tr><td>CD3-Fitc</td><td>BD Biosciences</td><td>561807</td><td></td></tr><tr><td>CD66b-Fitc</td><td>BD Biosciences</td><td>555724</td><td></td></tr><tr><td>CD56-Fitc</td><td>BD Biosciences</td><td>562794</td><td></td></tr><tr><td>CD11c-APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>337218</td><td></td></tr><tr><td>CD45-PE-Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td>557748</td><td></td></tr><tr><td>CD19-BV421</td><td>Biolegend</td><td>302234</td><td></td></tr><tr><td>CD3-V500</td><td>BD Biosciences</td><td>561416</td><td></td></tr><tr><td>CD56-APC</td><td>Biolegend</td><td>318310</td><td></td></tr><tr><td>CD4-PerCP-Cy5.5</td><td>Biolegend</td><td>300528</td><td></td></tr><tr><td>CD8-APC-H7</td><td>BD Biosciences</td><td>641400</td><td></td></tr><tr><td>CD303-PE</td><td>Biolegend</td><td>354204</td><td></td></tr><tr><td>CD141-APC</td><td>Biolegend</td><td>344106</td><td></td></tr><tr><td>FACS-Canto II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 V-förmige Well-Platte</td><td>Greiner Bio-one</td><td></td><td></td>651101</tr><tr><td>PBS PH 7.4</td><td>Gibco ThermoFisher 10010023</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACS-Röhrchen 5 mL Polystyrol-Röhrchen mit rundem Boden</td><td>Corning</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>IgG aus Humanserum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I4506</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ratte Ig, &kappa;/Negative Control Compensation Particles Set</td><td>BD Biosciences</td><td>552844</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus Ig, &nbsp;/Negative Control Kompensation Partikel Set</td><td>BD Biosciences</td><td>552843</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Fixierbares rotes Dead Cell Stain Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>L23102</td><td></td></tr><tr><td>IKA&nbsp;MS 3 Basic</td><td>Shaker Sigma Aldrich</td><td>Z645028-1EA</td><td></td></tr></tbody></table>

charakterisierung von immunzellen im menschlichen fettgewebe mittels durchflusszytometrie

Characterization of Immune Cells in Human Adipose Tissue by Using Flow Cytometry

Infiltration von Immunzellen in das subkutane und viszeralen Fettgewebe (AT) Ablagerungen führt zu einer minderwertigen Entzündung einen Beitrag zur Entwicklung der Adipositas-assoziierten Komplikationen wie Typ-2-Diabetes. Um quantitativ und qualitativ die Immunzelle Teilmengen in menschlichen auf Einlagen zu untersuchen, haben wir einen Flow Cytometry Ansatz entwickelt. Die stromale vaskuläre Fraktion (SVF), mit der Immunzellen ist von subkutanem und viszeralem bei Biopsien von Kollagenase Verdauung isoliert. Fettzellen werden nach der Zentrifugierung entfernt. Die SVF-Zellen sind für mehrere Membrane-springen-Marker zur Unterscheidung zwischen Immunzellen Teilmengen ausgewählt und mittels Durchflusszytometrie analysiert gefärbt. Als Ergebnis dieses Ansatzes pro- und antiinflammatorische Makrophagen Teilmengen, dendritische Zellen (DCs), B-Zellen, CD4+ und CD8+ T-Zellen und NK-Zellen erkannt und quantifiziert werden können. Diese Methode gibt detaillierte Informationen über Immunzellen im AT und die Höhe der jeweils spezifischen Teilmenge. Da gibt es zahlreiche fluoreszierende Antikörper zur Verfügung, kann unser Flow Cytometry Ansatz zur Messung der verschiedenen anderen zellulären und intrazellulären Marker von Interesse eingestellt werden.

Die SVF isoliert von der Mehrwertsteuer und saß wurde mittels Durchflusszytometrie gemessen. Flow Cytometry Messungen erzeugen Grundstücke zeigen unterschiedliche Zellpopulationen basierend auf zellulärer Marker (Abbildung 1A und 1 b). Zunächst durch Auftragen der Stürmer streuen Breite (FSC-W) und forward Scatter Bereich (FSC-A), Zelle, die Aggregate von weiteren Analyse ausgeschlossen werden können, durch Anspritzung Einzelzellen als niedrige FSC-W. Nächste, live Zellen ausgewählt sind, und Zelltrümmer ist ausgeschlossen durch Anspritzung der Zellen die richtige Größe und Komplexität mit FSC-A und der Seite streuen Bereich (SSC-A), beziehungsweise. Abgestorbenen Zellen sind klein und daher als eine verschiedene Bevölkerung sichtbar mit einem kleinen FSC-A. Nächste, immune Zellen wurden durch Verwendung von Pan-Leukozyten-Marker CD45 (Panel 1 und 2, Abb. 1A) ausgewählt. Um Makrophagen zu analysieren, andere Immunzellen wie die T-Zellen (CD3), B-Zellen (CD19), Neutrophile (CD66b+ CD11b+), und NK-Zellen (CD56) wurden von der weiteren Analyse ausgeschlossen, über verschiedene Antikörper, die gezielt diese Zellen, sondern mit der gleichen Fluorochrom. Weitere Unterteilung der verbleibenden Zellen basierte auf CD11b, CD11c Ausdruck. Dies führte in den folgenden Populationen: CD11b+ CD11c+ Makrophagen, CD11b+ CD11c– Makrophagen und CD11bniedrig /- CD11c+ DCs (FACS Panel 1, Abbildung 1 b). Messung der mittleren Fluoreszenzintensität (MFI) erlaubt die Quantifizierung des Ausdrucks von CD303 (plasmazytoide DC Markierung) und CD141 (DC-Marker), auf CD11b+ CD11c+ Makrophagen und CD11bniedrig /- CD11c+ DCs. Ausdruck dieser beiden Marker waren höher bei CD11bniedrig /- CD11c+ Zellen bestätigt, dass CD11bniedrig /- CD11c+ Zellen wurden DCs (Abbildung 1).
Das CD45+ Zellen (Abbildung 1A) wurden in T-Zellen und B-Zellen unterteilt mit CD3 und CD19, beziehungsweise. T-Zellen wurden unterteilt in T-Helferzellen (CD4+) und zytotoxischen T-Zellen (CD8+). Zu guter Letzt CD3–CD19–-Zellen, NK-Zellen mit dem Marker CD56 zu quantifizieren gezeichnet wurden (FACS-Panel 2, Abbildung 1). Die Anzahl der Zellen in jedem Tor wird quantifiziert und kann zur Berechnung des Anteils dieser Zellentyp aller lebenden Zellen (Tabelle 3).
Der Anteil der lebenden Zellen kann berechnet werden, für jedes Fach ermöglicht die Berechnung der durchschnittlich alle Themen in einer Gruppe von zum Beispiel mageres oder übergewichtige Männer zeigt die Fülle an eine bestimmte Immunzellen, d. h., der Pro-inflammatorischen CD11b+ CD11c+ Makrophagen in viszeralen AT (Abbildung 2).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57319/57319fig1.jpg"> Abbildung 1: FACS Anspritzung Strategie des viszeralen Fettgewebes. (A) FACS Handlung aller Ereignisse (schwarz) mit forward Scatter breite Intensität (FSC-W) und forward Scatter Bereich Intensität (FSC-A) mit einem Tor wählen Sie nur einzelne Zellen (rot), gefolgt von einem FACS-Grundstück basierend auf FSC-A und seitliche Streuung Bereich Intensität (SSC-A) enthält eine Auswahl von lebenden Zellen (hellgrün) Tor. Als nächstes Grundstück mit SSC-A und CD45 Fluoreszenzintensität enthält eine Auswahl aller CD45 Tor+ (immun-) Zellen (blau). (B) FACS Grundstück CD19, CD3, CD66b und CD56 Fluoreszenzintensität versus CD11b Fluoreszenzintensität und ein Tor auswählen alle Zellen, die CD19, CD3, CD66b und CD56 negativ sind (braun) für weitere Unterteilung in Populationen. Weitere Unterteilung in die nächste Handlung basierend auf CD11b und CD11c Fluoreszenz-Intensität. Tore werden angezeigt, enthält CD11b+ CD11c+ Makrophagen (dunkelgrün), CD11b+ CD11c– Makrophagen (lila) und CD11bniedrig /- CD11c+ dendritische Zellen (blau). (C) Menge von CD11b+, CD11c+, oder CD11bniedrig /- CD11c+ Zellen (Y-Achse) ihre Ebenen der Fluoreszenzintensität (X-Achse) für CD303 und CD141 und die entsprechenden Quantifizierung des Mittelwerts anzeigen Fluoreszenzintensität (MFI). (D) FACS Plot zeigt die bisherigen CD45+ Bevölkerung (blau) basierend auf CD3 und CD19 Fluoreszenzintensität mit Toren, die Auswahl von T-Zellen (Magenta), B-Zellen (dunkelgrün) und nicht-Autofluorescent Zellen (grün) negativ für beide CD3 und CD19. Die folgende Handlung basiert auf CD4 und CD8 Fluoreszenz mit Toren Auswahl CD4+ (hellgrün) und CD8+ (Magenta) T-Zellen. Eine identische gating Strategie dient zur subkutanen Fettgewebe. Eine identische gating Strategie dient zur subkutanen Fettgewebe. Diese Zahl wurde von Wouters Et Al. modifiziert 16 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57319/57319fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57319/57319fig2.jpg"> Abbildung 2: Fettleibige MwSt enthält mehr Pro-inflammatorischen Makrophagen. Die Höhe der CD11b+ CD11c+ Makrophagen als Prozentsatz aller lebenden Zellen in Bottich von mageren und fettleibigen Menschen präsentiert. Alle Daten sind Mittel ± SEM; n = 20 für Lean und n = 31 für übergewichtige. p ≤ 0,01 vs. Lean. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57319/57319fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Ziel</td>
			<td>Definition Ziel</td>
			<td>Präsentieren auf</td>
			<td>Fluorochrom</td>
			<td>Menge</td>
			<td>Klon</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD11B</td>
			<td>myeloische Integrin-marker</td>
			<td>Granulozyten, Monozyten/Makrophagen, dendritische Zellengering und natürliche Killerzellen</td>
			<td>BV421</td>
			<td>2.5 ΜL</td>
			<td>ICRF44</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD19</td>
			<td>gemeinsame B-Zell-antigen</td>
			<td>B-Zell-Entwicklung von Pro-B-Zell bis Blastoid B-Zellen und B Plasmazelle</td>
			<td>FITC</td>
			<td>3 ΜL</td>
			<td>HIB19</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD3</td>
			<td>gemeinsamen T-Zell-antigen</td>
			<td>Thymozyten, T-Lymphozyten und natürlichen Killer T-Zellen</td>
			<td>FITC</td>
			<td>3 ΜL</td>
			<td>UCHT1</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD66B</td>
			<td>Mitglied der carcinoembryonales Antigen (CEA)-wie Glykoprotein-Familie</td>
			<td>Granulozyten</td>
			<td>FITC</td>
			<td>5 ΜL</td>
			<td>G10F5</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD56</td>
			<td>stark glykosylierten Adhäsion protein</td>
			<td>natürliche Killerzellen und natürlichen Killer T-Zellen</td>
			<td>FITC</td>
			<td>5 ΜL</td>
			<td>B159</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD303</td>
			<td>Typ II transmembranen glycoprotein</td>
			<td>plasmazytoide dendritische Zellen</td>
			<td>PE</td>
			<td>1 ΜL</td>
			<td>201A</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD141</td>
			<td>thrombomodulin</td>
			<td>Monozyten/Makrophagenniedrig, Subpopulation von dendritischen Zellen</td>
			<td>APC</td>
			<td>1 ΜL</td>
			<td>M80</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD11C</td>
			<td>Typ I transmembranen Glycoprotein; Integrin αx</td>
			<td>Monozyten/Makrophagen, dendritischen Zellen, Granulozyten, natürliche Killerzellen, Teilmenge von B und T-Zellen</td>
			<td>APC-Cy7</td>
			<td>0,5 ΜL</td>
			<td>Bu15</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD45</td>
			<td>gemeinsamen Leukozyten-antigen</td>
			<td>alle menschlichen Leukozyten, Lymphozyten, Monozyten, Granulozyten, Eosinophilen und Thymozyten einschließlich</td>
			<td>PE-Cy7</td>
			<td>1 ΜL</td>
			<td>HI30</td>
		</tr>
<tr>
<td>FACS-Puffer</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>7.5 µl</td>
			<td>-</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1. Antikörper für cocktail FACS pAnel 1, Teilmengen von Makrophagen und dendritischen Zellen Populationen zu identifizieren. Menge des Antikörpers beschrieben ist für die Analyse einer Probe.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Ziel</td>
			<td>Definition Ziel</td>
			<td>Präsentieren auf</td>
			<td>Fluorochrom</td>
			<td>Menge</td>
			<td>Klon</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD19</td>
			<td>gemeinsame B-Zell-antigen</td>
			<td>B-Zell-Entwicklung von Pro-B-Zell bis Blastoid B-Zellen und B Plasmazelle</td>
			<td>BV421</td>
			<td>1 ΜL</td>
			<td>HIB19</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD3</td>
			<td>gemeinsamen T-Zell-antigen</td>
			<td>Thymozyten, T-Lymphozyten und natürlichen Killer T-Zellen</td>
			<td>V500</td>
			<td>3 ΜL</td>
			<td>UCHT1</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD56</td>
			<td>stark glykosylierten Adhäsion protein</td>
			<td>natürliche Killerzellen und natürlichen Killer T-Zellen</td>
			<td>APC</td>
			<td>5 ΜL</td>
			<td>HCD56</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD4</td>
			<td>IG-Superfamilie, Typ I transmembranen Glycoprotein</td>
			<td>T-Helfer-Zell, Thymozyten, Monozyten/Makrophagen, Typ II natürlichen Killer T-Zellen</td>
			<td>PerCP-Cy5.5</td>
			<td>1 ΜL</td>
			<td>RPA-T4</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD8</td>
			<td>Α-Untereinheit eines Disulfid-linked bimolekulare komplexes</td>
			<td>zytotoxischen T-Zellen, Thymozyten, Teilmenge der natürlichen Killerzellen</td>
			<td>APC-H7</td>
			<td>2 ΜL</td>
			<td>SK1</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD45</td>
			<td>gemeinsamen Leukozyten-antigen</td>
			<td>alle menschlichen Leukozyten, Lymphozyten, Monozyten, Granulozyten, Eosinophilen und Thymozyten einschließlich</td>
			<td>PE-Cy7</td>
			<td>1 ΜL</td>
			<td>HI30</td>
		</tr>
<tr>
<td>FACS-Puffer</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>10 µl</td>
			<td>-</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 2: Antikörper für cocktail FACS Panel 2, T und B-Zell-Populationen zu identifizieren. Menge des Antikörpers beschrieben ist für die Analyse einer Probe.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Makrophagen-panel</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Angussbezeichnung</td>
			<td># Zellen</td>
			<td>% der live</td>
		</tr>
<tr>
<td>Einzelne Zellen</td>
			<td>183054</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Leben</td>
			<td>10477</td>
			<td>100</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD45</td>
			<td>4100</td>
			<td>39.13</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dump–
</td>
			<td>771</td>
			<td>7.36</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD11C– CD11B+
</td>
			<td>430</td>
			<td>4.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD11C+ CD11B+
</td>
			<td>104</td>
			<td>0.99</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD11C+ CD11Bniedrig /-
</td>
			<td>15</td>
			<td>0,14</td>
		</tr>
<tr>
<td>T-Zellen, B-Zellen, NK-Zell-panel</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Angussbezeichnung</td>
			<td>#Cells</td>
			<td>% der live</td>
		</tr>
<tr>
<td>Einzelne Zellen</td>
			<td>34616</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Leben</td>
			<td>3728</td>
			<td>100</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD45+
</td>
			<td>1589</td>
			<td>42.62</td>
		</tr>
<tr>
<td>NK-Zellen</td>
			<td>29</td>
			<td>0.78</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD3+
</td>
			<td>953</td>
			<td>25,56</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD4+
</td>
			<td>601</td>
			<td>16.12</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD8+
</td>
			<td>328</td>
			<td>8.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD19+
</td>
			<td>20</td>
			<td>0,54</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 3. Immunzelle Fülle verschiedener Zelltypen der Mehrwertsteuer. Anzahl der Zellen in jedem Tor und der Prozentsatz der verschiedenen Zelltypen bezogen auf die Gesamtmenge von lebenden Zellen.

Dieser Artikel beschreibt eine Methode, um Immunzelle Inhalt des Fettgewebes durch Isolierung der Immunzellen aus Fettgewebe und anschließende Analyse mit Durchflusszytometrie zu analysieren.

Charakterisierung von Immunzellen im menschlichen Fettgewebe mittels Durchflusszytometrie

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, mit Hilfe der Durchflusszytometrie die stromale Gefäßfraktion aus menschlichem Fettgewebe zu isolieren, um die verschiedenen Immunzellpopulationen im Fettgewebe zu phänotypisieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen der Stoffwechselforschung zu beantworten, etwa welche Immunzellen sich in welchem Ausmaß im Fettgewebe adipöser Personen anreichern. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die gleichzeitige Messung mehrerer Marker auf Immunzellen und die Identifizierung und Quantifizierung dieser Immunzellen im Fettgewebe ermöglicht.Obwohl diese Technik entscheidende Einblicke in die Entzündung des Fettgewebes liefern kann, kann sie auch auf andere Organe und Gewebe angewendet werden. Im Allgemeinen haben Personen, die mit dieser Technik noch nicht vertraut sind, während des Färbeverfahrens hauptsächlich mit einer Kontamination der stromalen Gefäßzellen und dem Verlust von Zellen zu kämpfen. Zwei meiner Doktoranden, Suzan Wetzels und Mitchell Bijnen, werden das Protokoll ausführen.Beginnen Sie damit, mit einem Skalpell ein Gramm Fettgewebebiopsie in etwa zwei Millimeter große Stücke zu zerkleinern. Übertragen Sie die Stücke in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und geben Sie 10 Milliliter Kollagenaselösung zu den Proben. Inkubieren Sie die Gewebefragmente 60 Minuten lang in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad mit 60 Zyklen pro Minute.Gefolgt von der Filtration durch ein 200-Mikrometer-Sieb in ein neues konisches 50-Milliliter-Rohr. Spülen Sie den Filter vor der Zentrifugation mit sieben Millilitern PBS. Verwenden Sie dann eine Pipette, um den Überstand zu entfernen, ohne die gesamte Pipettenspitze in die Lösung zu tauchen.Das Pellet sollte gut sichtbar sein und fast alle Überstände entfernen, um eine Kontamination der stromalen Gefäßfraktion mit Fettzellen zu vermeiden. Wir suspendieren das stromale Gefäßzellpellet mit fünf Millilitern frischem PBS und filtrieren die stromale Gefäßfraktion durch ein 70-Mikrometer-Sieb in ein neues Röhrchen. Nach der Zentrifugation suspendieren wir das gewaschene Pellet der stromalen Gefäßfraktion fünf Minuten lang in drei Millilitern Erythrozyten-Lysepuffer auf Eis.Dann stoppen Sie die Lyse mit sieben Millilitern PBS und pelletieren die Zellen durch Zentrifugation. Um die stromale Gefäßfraktion für die durchflusszytometrische Analyse zu färben, resuspendieren Sie das Pellet in 90 Mikrolitern mit einer fluoreszenzaktivierten Zellsortierung (FACS-Puffer) von vier Grad Celsius und blockieren Sie die unspezifische Färbung mit zehn Mikrolitern humanem IgG. Teilen Sie die Zellsuspension auf zwei Vertiefungen einer 96-Well-Platte mit V-Boden auf und legen Sie die Zellen 15 Minuten lang auf Eis.Waschen Sie am Ende der Inkubation jede Probe mit 100 Mikrolitern FACS-Puffer und drehen Sie die Platte in einer sanften Bewegung auf den Kopf, ohne zu klopfen, um die Überstände am Ende der Zentrifugation zu entsorgen. Stellen Sie sicher, dass Sie das Pellet am Boden der Platte deutlich sehen können, bevor Sie es auf den Kopf stellen, um einen Verlust Ihrer Zellen während des Eingriffs zu verhindern. Resuspendieren Sie das erste Pellet in 29,5 Mikrolitern Antikörpercocktail für das erste FACS-Panel und das zweite Pellet in 23 Mikrolitern Antikörpercocktail für das zweite FACS-Panel.Nach 30 Minuten auf Eis im Dunkeln waschen Sie die Zellen mit 150 Mikrolitern FACS-Puffer pro Vertiefung und fixieren die Zellpellets in 150 Mikrolitern einprozentiger Formaldehydlösung. Übertragen Sie die Zellsuspensionen aus jeder Vertiefung in die entsprechenden FACS-Röhrchen und legen Sie die Proben auf Eis. Laden Sie vor der Analyse eine ungefärbte Negativkontrolle auf das Durchflusszytometer, um die Parameter für die Vorwärtsstreuung und die Seitenstreuung einzustellen.Passen Sie dann die Spannungen des Durchflusszytometers gemäß den Anweisungen des Herstellers an, bis alle interessierenden Populationen in den Vorwärts- und Seitenstreudiagrammen sichtbar sind und zwischen den Trümmern und den lebenden Zellen unterschieden werden kann. Wenn alle Parameter eingestellt sind, wird die erste experimentelle Probe bei 800 U/min vortext, um die Zellen gründlich zu resuspendieren und die Probe auf das Zytometer zu laden. Lesen Sie mindestens 50.000 Ereignisse im Live-Gate, dann einen Vortex und laden Sie die zweite Probe zur Analyse, wie gerade gezeigt.Um die Analyse der Fettgewebe-Makrophagenpopulationen in diesem repräsentativen Experiment zu ermöglichen, wurden andere Immunzellen wie T-Zellen, B-Zellen, Neutrophile und natürliche Killerzellen ausgeschlossen, um das Vorhandensein von CD11b+CD11c+Makrophagen, CD11B+CD11C-Makrophagen und CD11Blow-CD11C+dendritischen Zellen zu zeigen. Die Quantifizierung der Hauptfluoreszenzintensität dieser Zellen ergab die Expression von plasmazytoiden dendritischen Zellen und generischen dendritischen Zellmarkern auf den CD11B+CD11C+- und CD11Blow-CD11C+-Zellen, wobei eine höhere Expression beider Marker auf den CD11Blow-CD11C+-Zellen beobachtet wurde, was bestätigt, dass es sich bei den CD11Blow-CD11C+-Zellen tatsächlich um dendritische Zellen handelte. Das Gating der CD45-positiven Zellen ergab CD19-positive B- und CD3-positive T-Zellpopulationen, von denen letztere weiter unterteilt werden konnten in CD3+CD4+T-Helfer- und CD3+CD8+zytotoxische T-Zell-Untergruppen sowie CD3-CD56+natürliche Killerzellen.Der Prozentsatz lebensfähiger Immunzellen wurde dann für jeden Probanden berechnet, was einen signifikanten Anstieg des Prozentsatzes an proinflammatorischen CD11B+CD11C+Makrophagen im viszeralen Fettgewebe adipöser erwachsener männlicher Probanden zeigte. Einmal gemeistert, kann diese Technik innerhalb von vier Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, die Puffer und Zellfraktionen auf Eis zu halten, und bei der Markierung der Zellen mit Antikörpern ist es sehr wichtig, sie im Dunkeln zu halten.Nach ihrer Entwicklung ermöglichte diese Technik Forschern auf dem Gebiet der Stoffwechselforschung, die Veränderungen der Immunzellen im Fettgewebe des Menschen zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Immunzellen des Fettgewebes isoliert und wie man eine Durchflusszytometrie an diesen Zellen durchführt. Denken Sie daran, dass Sie mit potenziell infektiösem menschlichem Material und Substanzen wie Formaldehyd arbeiten, die gefährlich sein können.Tragen Sie immer vorsichtig Handschuhe und eine Schutzbrille.

characterization-immune-cells-human-adipose-tissue-using-flow

Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Fettgewebe (AT) ist ein Ort der intensiven Immunzellaktivierung und Interaktion. Fast alle Zellen des Immunsystems sind in AT und ihre Verhältnisse werden durch Fettleibigkeit verändert. Proper Isolierung, Quantifizierung und Charakterisierung von AT Immunzellpopulationen sind entscheidend für das Verständnis ihrer Rolle in immunometabolic Krankheit.

Isolation von Fettgewebe Immune Cells

Diese Studie vergleicht zwei verschiedene Methoden der Isolierung humaner Monozyten zur Gewinnung von in vitro dendritischen Zellen (DCs). Monozyten werden durch Adhärenz selektiert oder durch magnetische Trennung negativ angereichert. Die Monozytenausbeute und -viabilität sowie die Viabilität, Proliferation und Expression von CD11c/CD14-Oberflächenmarkern werden zwischen beiden Methoden verglichen.

Charakterisierung von humanen Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen durch Imaging Durchflusszytometrie: Ein Vergleich zwischen zwei Monozyt Isolation Protokolle

Die Unterscheidung von weiß und Beige Adipozyten aus Fettgewebe vaskulären Stammeltern trägt metabolische Verbesserungspotenzial bei Adipositas. Protokolle beschrieben für eine CD34 + CD31 + Endothelzellen losgelöst von menschlichen Fett und für eine spätere in-vitro- Erweiterung und Differenzierung in weiß und Beige Adipozyten. Mehrere downstream-Anwendungen werden diskutiert.

Isolation, Expansion und Adipogenen Induktion von CD34 + CD31 + Endothelial Zellen aus menschlichen Omentalis und subkutanem Fettgewebe

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Charakterisierung von Monocyte Teilmengen von Vollblut Durchflusszytometrie. Dazu gehören wie Tor die Teilmengen und bewerten ihren Ausdruck der oberflächenmarker skizziert und geben ein Beispiel für die Beurteilung des Ausdrucks (entzündlich) M1 und M2-Marker (entzündungshemmend).

Charakterisierung der menschliche Monocyte Teilmengen von Vollblut Flow Cytometry Analysis

Es wird ein einfaches und zuverlässiges, diächterinduziertes Zäuntiermodell für alkoholfreie Steatohepatitis (NASH) beschrieben, das durch das nicht-SPF-Gehäuse der Tiere und die Verabreichung einer bestimmten fettreichen Ernährung erreicht wird. Wir beschreiben die Identifizierung von Leber-und Fettzell-Subsets, um die menschlichen Immunbedingungen zu rekapitulieren, indem Mäuse Umweltkeimen aussetzen.

Ein fortgeschrittenes Murine-Modell für alkoholfreie Steatohepatitis in Verbindung mit Typ-2-Diabetes

Hier präsentieren wir menschliche Fettgewebe enzymfreie Mikrofragmentierung mit einem geschlossenen Systemgerät. Diese neue Methode ermöglicht die Gewinnung von Submillimeter-Clustern von Fettgewebe, die für In-vivo-Transplantationen, In-vitro-Kulturen und weitere Zellisolation und -charakterisierung geeignet sind.

Human Adipose Tissue Mikrofragmentierung für Zell-Phänotypisierung und Secretome-Charakterisierung

Dieses Protokoll beschreibt den technischen Ansatz zur Isolierung von adipogenen und fibro-inflammatorischen Stromazell-Subpopulationen aus murinen intraabdominalen Depots aus weißem Fettgewebe (WAT) durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung oder immunomagnetische Kügelchentrennung.

Isolierung von adipogenen und fibro-inflammatorischen Stromazell-Subpopulationen aus murinen intraabdominalen Fettdepots

Die Isolierung von Zellen aus präparierten Implantaten und deren Charakterisierung mittels Durchflusszytometrie kann wesentlich zum Verständnis des Musters der Immunantwort gegen Implantate beitragen. In dieser Arbeit wird eine präzise Methode zur Isolierung von Zellen aus präparierten Implantaten und deren Färbung für die durchflusszytometrische Analyse beschrieben.

Hochdimensionale Durchflusszytometrie zur Immunfunktionsanalyse von präpariertem Implantatgewebe

Dieses Protokoll bietet eine effiziente Kollagenase-Verdauungsmethode für die Isolierung lebensfähiger Adipozyten und stromaler vaskulärer Fraktions-SVF-Zellen aus menschlichem viszeralem Fett in einem einzigen Prozess, einschließlich einer Methodik zur Gewinnung hochwertiger RNA aus Adipozyten und einer Phänotypisierung von SVF-Makrophagen durch Färbung mehrerer membrangebundener Marker für die Analyse durch Durchflusszytometrie.

Isolierung lebensfähiger Adipozyten und stromaler vaskulärer Fraktion aus menschlichem viszeralem Fettgewebe, geeignet für RNA-Analyse und Makrophagen-Phänotypisierung

In dieser Studie stellen wir ein effektives und reproduzierbares Protokoll zur Isolierung der Immunpopulationen der murinen Atemwege vor. Wir bieten auch eine Methode zur Identifizierung aller angeborenen und adaptiven Immunzellen, die sich in den Lungen gesunder Mäuse befinden, unter Verwendung eines 9-farbbasierten Durchflusszytometrie-Panels.

Durchflusszytometrische Analyse zur Identifizierung der angeborenen und adaptiven Immunzellen der murinen Lunge

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Isolierung, Kultivierung und Phänotypisierung von mikrovaskulären Endothelzellen aus humanem subkutanem Fettgewebe (hSATMVECs). Zusätzlich beschreiben wir ein experimentelles Modell des hSATMVEC-Adipozyten-Cross-Talks.

Untersuchung der Wechselwirkung zwischen Fettendothelzellen und Adipozyten im menschlichen subkutanen Fettgewebe

Erfahren Sie die Durchflusszytometrie zur Isolierung und Charakterisierung von Immunzellen aus dem Stromal-Vaskulär-Fraktion menschlichen Fettgewebes. Diese Methode ermöglicht die quantitative Analyse immunologischer Zellpopulationen.

Charakterisierung von Immunzellen im menschlichen Fettgewebe mittels Durchflusszytometrie

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