Name: Ein murinen Pancreatic Islet Cell-basierte Screening für diabetogene Umweltchemikalien (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: Erfahren Sie die Isolation muriner Pankreas-Inselzellen zur Screening-Methode für ROS-induzierende diabetogene Xenobiotika. Dieses Protokoll ermöglicht die in-vitro-Analyse chemischer Effekte auf die physiologische Funktion des Pankreas.

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Diese Arbeit wurde durch ein Pilotprojekt Stipendium CREH Zentrum gesponsert durch NIEHS und National Natural Science Foundation of China (Nr. 31572626) unterstützt.

Alle Tierversuche wurden hingerichtet, unter Beachtung aller relevanten Richtlinien, Verordnungen und Aufsichtsbehörden. Das Protokoll wird gezeigt wurde unter der Leitung und Genehmigung der institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) von der Texas A & M Institut für Genomic Medizin durchgeführt.
1. Vorbereitung der Lösung
<ol><li>10 X Hank ausgeglichene Salzlösung, 1 X mit doppelt destilliertem H2O verdünnen und Lagerung bei 4 ° C.</li>
	<li>Bereiten Sie die Isolierungslösung indem HEPES (10 mM), MgCl2 (1 mM) und Glukose (5 mM). Einstellen Sie den pH-Wert 7,4 und halten Sie auf dem Eis.</li>
	<li>Bereiten Sie die Kollagenase-Lösung von Kollagenase Typ 4. Hinweis: Insbesondere enthält Kollagenase Typ 4 160 U pro mg Trockengewicht. 1 g Kollagenase Typ 4 wird in 5 mL doppelt destilliertem H2O mit einer Konzentration von 200 mg/mL verdünnt. 2 mL der verdünnten Kollagenase ist 30 mL Eis kalt isoliert Projektmappe hinzugefügt, und 6 mL Kollagenase-Lösung wird in ein 50 mL-Tube für jede Maus übertragen.</li>
	<li>Bereiten Sie die Waschlösung durch Zugabe von 1 mM CaCl2 zur Isolierungslösung.</li>
	<li>Bereiten Sie die Reinigung Lösung mit kalten Polysucrose/Natrium-Diatrizoate-Lösung (1,1119 g/mL, 5 mL).</li>
	<li>Bereiten Sie 500 mL Kulturmedium Inselchen durch Zugabe von L-Glutamin (20 mM), Penicillin (100 U/mL), Streptomycin (100 µg/mL) und fetalen bovine Serum (FBS) (10 %) in RPMI Medium vor.</li>
	<li>Vorbereiten der RLKV-DA-Stammlösung durch Auflösen des Pulvers in destilliertem Wasser bei 200 µM und Store bei-20 ° C. Hinweis: Die Färbelösung ROS wird durch Verdünnung RLKV-DA-Stammlösung auf die Endkonzentration von 5 µM in RPMI frisch zubereitet. Dieses Reagenz sollten vor Licht geschützt werden.</li>
</ol>2. chirurgische Vorbereitung
<ol><li>Intraperitoneale Injektion (i.p.) eine Maus mit avertin (2,5 % avertin, 0,4 mL/20 g). Nach die Maus völlig betäubt ist und nicht mehr reagiert zum hinteren Fuß drückt, einschläfern die Maus und die biologische Motorhaube.</li>
	<li>Platzieren Sie die euthanasierten Maus mit dem Bauch nach oben und sprühen Sie die Haut mit 70 % igem Ethanol für die Sterilisation.</li>
	<li>Öffnen der Bauchhöhle mit einem 1 cm U-Schnitt auf den Oberbauch aus- und Einfahren der Haut in Richtung rostral über der Brust, die Bauchhöhle verfügbar zu machen.</li>
</ol>3. die Bauchspeicheldrüse Perfusion und Entfernung
<ol><li>Wie in Abbildung 1dargestellt, finden Sie den Standort der Ampulle. Verwenden Sie ein paar gebogene Pinzetten, Klemmen Sie den Zwölffingerdarm nahe der Position des Sphincter Oddi. Verwenden Sie ein weiteres Paar gebogene Pinzetten, Klemmen Sie die Zwölffingerdarm Wand um den Weg der Galle in den Zwölffingerdarm zu blockieren. Hinweis: Der Ampulle wurde nicht in diesem Schritt eingefügt. Dieser Schritt soll die Galle Weg in den Zwölffingerdarm blockieren.</li>
	<li>Positionieren Sie die Maus mit dem Kopf proximalen und distalen in Bezug auf die Forscher die Füße.</li>
	<li>Finden Sie den hauptgallengang und injizieren Sie langsam 3 mL Kollagenase-Lösung mit einer 30 G Nadel und 5 mL Spritze. Sicherstellen Sie, dass der Gallengang und Bauchspeicheldrüse nach der Injektion aufgeblasen werden.</li>
	<li>Entfernen Sie die aufgeblähten Bauchspeicheldrüse mit den gebogenen Pinzette und feine Schere, um es von den absteigenden Dickdarm, Darm, Magen und Milz zu trennen. Die Bauchspeicheldrüse in einen 50-mL-Röhrchen mit 3 mL Kollagenase-Lösung und lassen Sie ihn auf Eis.</li>
</ol>4. Bauchspeicheldrüse Verdauung
<ol><li>Legen Sie je 50-mL-Tube in einem 37 ° C-Wasserbad. 15-20 min inkubieren (Zeit variiert je nach Sorte und Alter der Mäuse).</li>
	<li>Schwingen Sie das Rohr mit einem Wirbel.</li>
	<li>Pool 4-5 verdaute Bauchspeicheldrüse in ein großes sterile Waschbecken Sieb und eine Kugel verwenden, um die Bauchspeicheldrüse gründlich auseinander zu fallen. Verwenden Sie eine 23 G Nadel und 10 mL Spritze mit Waschlösung, um mit Nachdruck die verdauten Zellen außerhalb des Bildschirms pipette. Sammeln Sie die Waschlösung in einen 50-mL-Tube.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Rohre mit 97 X g bei 4 ° C für 1 min und Dekantieren Sie des Überstandes.</li>
	<li>Rohre fügen Sie 25 mL Waschlösung hinzu und erneut aussetzen Sie des Gewebes durch sanfte aufschütteln. Spin-down der Gewebe bei 97 X g bei 4 ° C für 1 min und den überstand abgießen. Für 3 Mal wiederholen. Achten Sie darauf, dass Sie nicht das gebeizte Gewebe verdrängen.</li>
</ol>5. Reinigung der kleinen Inseln
<ol><li>Das gewaschene Gewebe Pellet 10 mL Reinigung Lösung hinzu und Aufschwemmen Sie sanft des Inhalts.</li>
	<li>Überlagern Sie sanft 5 mL Lösung zur Isolierung auf die Reinigung Lösung. Achten Sie darauf, um eine scharfe flüssigen Schnittstelle zwischen den beiden Lösungen zu halten.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie das Rohr auf 560 x g bei 4 ° C für 15 min mit der langsamen Beschleunigung und keine Bremse. Legen Sie die Pipette in die Schnittstelle und sammeln Sie die Inselchen Schicht in neuen 50 mL Röhrchen.</li>
	<li>Waschen Sie die kleinen Inseln, wie unter Punkt 3.5 beschrieben.</li>
</ol>(6) Beschichtung und Behandlung von Inselzellen
<ol><li>Die kleinen Inseln in 10 mL Inselchen Kulturlösung Aufschwemmen, sanft gut mischen und 100 µL/Well mit einer Mehrkanal-Pipette auf eine 96-Well-Platte zu platzieren. Platzieren Sie ca. 5 Inseln pro 96 gut.</li>
	<li>Legen Sie die Platte in der Gewebekultur-Inkubator für 12 h.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie (112 X g) 96-Well-Platte und entfernen Sie das Kulturmedium zu.</li>
	<li>Verdünnen Sie die Umweltchemikalien in das Kulturmedium Inselchen. 100 µL der einzelnen chemischen Verdünnungsmitteln in separaten Vertiefungen der Platte hinzufügen. Aufschwemmen der Inseln in jede Vertiefung und inkubieren Sie für 12 h bei 37 ° C (die Konzentration variiert für verschiedenen Umweltchemikalien).</li>
</ol>(7) ROS Färbung und Messung
<ol><li>Nachbehandlung der Inselchen mit 1 X PBS waschen (200 µL für jede 96-Well). Hinweis: Die Konzentration der Chemikalien ist wie folgt: AFB1: 3 µM, Atrazin: 100 µM, BaP: 10 µM, BPA: 100 µM, β-Östrogen, PCB126: 10 µM, Nonylphenol und BPA: 100 µM.</li>
	<li>Verwenden Sie N-Acetyl-Cystein (NAC) als Antioxidans ROS zu stillen. Die ROS-induzierten chemischen Verdünnungsmittel 5 mM der NAK hinzu und 12 h bei 37 ° c inkubieren</li>
	<li>Die 96-Well-Platte bei 112 X g zentrifugieren und mit 5 µM-Lösung von fluoreszierenden Sonde (H2-RLKV-DA aufgelöst in RPMI Medien) bei 37 ° C für 60 min inkubieren.</li>
	<li>Die behandelten Inselzellen 3 Mal mit PBS waschen und Messung die Fluoreszenz mit Dozent Mikrotestplatte an 488 nm. Hinweis: Die Anhäufung von DCF in Zellen kann gemessen werden, durch eine Erhöhung der Fluoreszenz bei 530 nm, wenn die Probe bei 488 angeregt wird nm.</li>
	<li>Führen Sie die Glukose stimuliert Insulin-Sekretion (GSIS) Assay9 auf ROS-induzierende Harnblase behandelt Inselchen und unbehandelten Inselchen, die insbesondere Auswirkungen auf die physiologische Funktion der Bauchspeicheldrüsen Inselchen zu messen.</li>
</ol>

<ol><li>Maruthur, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+growing+prevalence+of+type+2+diabetes%3A+increased+incidence+or+improved+survival%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Current+diabetes+reports%22%5BJournal%5D)">The growing prevalence of type 2 diabetes: increased incidence or improved survival?</a> Current diabetes reports. 13 (6), 786-794 (2013).</li>
<li>Houstis, N., Rosen, E. D., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+have+a+causal+role+in+multiple+forms+of+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species have a causal role in multiple forms of insulin resistance.</a> Nature. 440 (7086), 944-948 (2006).</li>
<li>Ma, Z. A., Zhao, Z., Turk, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+and+beta-cell+failure+in+type+2+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Diabetes+Res%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction and beta-cell failure in type 2 diabetes mellitus.</a> Exp Diabetes Res. , 703538(2012).</li>
<li>Valavanidis, A., Vlahogianni, T., Dassenakis, M., Scoullos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+biomarkers+of+oxidative+stress+in+aquatic+organisms+in+relation+to+toxic+environmental+pollutants%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotoxicology+and+environmental+safety%22%5BJournal%5D)">Molecular biomarkers of oxidative stress in aquatic organisms in relation to toxic environmental pollutants.</a> Ecotoxicology and environmental safety. 64 (2), 178-189 (2006).</li>
<li>Robertson, R. P., Harmon, J., Tran, P. O., Tanaka, Y., Takahashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+toxicity+in+%CE%B2-cells%3A+type+2+diabetes%2C+good+radicals+gone+bad%2C+and+the+glutathione+connection%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Glucose toxicity in β-cells: type 2 diabetes, good radicals gone bad, and the glutathione connection.</a> Diabetes. 52 (3), 581-587 (2003).</li>
<li>Kaneto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+induces+p21+expression+in+pancreatic+islet+cells%3A+possible+implication+in+beta-cell+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress induces p21 expression in pancreatic islet cells: possible implication in beta-cell dysfunction.</a> Diabetologia. 42 (9), 1093-1097 (1999).</li>
<li>Maechler, P., Jornot, L., Wollheim, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+peroxide+alters+mitochondrial+activation+and+insulin+secretion+in+pancreatic+beta+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Hydrogen peroxide alters mitochondrial activation and insulin secretion in pancreatic beta cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (39), 27905-27913 (1999).</li>
<li>Gao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+palmitate+on+hepatic+insulin+resistance+are+mediated+by+NADPH+Oxidase+3-derived+reactive+oxygen+species+through+JNK+and+p38MAPK+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The effects of palmitate on hepatic insulin resistance are mediated by NADPH Oxidase 3-derived reactive oxygen species through JNK and p38MAPK pathways.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (39), 29965-29973 (2010).</li>
<li>Efendić, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreastatin+and+islet+hormone+release%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Pancreastatin and islet hormone release.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 84 (20), 7257-7260 (1987).</li>
<li>Tian, Y., Ke, S., Denison, M. S., Rabson, A. B., Gallo, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ah+receptor+and+NF-%CE%BAB+interactions%2C+a+potential+mechanism+for+dioxin+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Ah receptor and NF-κB interactions, a potential mechanism for dioxin toxicity.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (1), 510-515 (1999).</li>
<li>Cui, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pregnane+X+receptor+regulates+the+AhR%2FCyp1A1+pathway+and+protects+liver+cells+from+benzo-%5B%CE%B1%5D-pyrene-induced+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+Letters%22%5BJournal%5D)">Pregnane X receptor regulates the AhR/Cyp1A1 pathway and protects liver cells from benzo-[α]-pyrene-induced DNA damage.</a> Toxicology Letters. 275, 67-76 (2017).</li>
<li>Li, L. A., Wang, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCB126+induces+differential+changes+in+androgen%2C+cortisol%2C+and+aldosterone+biosynthesis+in+human+adrenocortical+H295R+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">PCB126 induces differential changes in androgen, cortisol, and aldosterone biosynthesis in human adrenocortical H295R cells.</a> Toxicological Sciences. 85 (1), 530-540 (2005).</li>
<li>Asahi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bisphenol+A+induces+endoplasmic+reticulum+stress-associated+apoptosis+in+mouse+non-parenchymal+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Life+sciences%22%5BJournal%5D)">Bisphenol A induces endoplasmic reticulum stress-associated apoptosis in mouse non-parenchymal hepatocytes.</a> Life sciences. 87 (13), 431-438 (2010).</li>
<li>Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2565847/">Murine pancreatic islet isolation.</a> JoVE (Journal of Visualized Experiments). (7), e255(2007).</li>
<li>Kirstetter, P., Lagneau, F., Lucas, O., Krupa, Y., Marty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+endothelium+in+the+modulation+of+isoflurane-induced+vasodilatation+in+rat+thoracic+aorta%5BTitle%5D)+AND+%22British+journal+of+anaesthesia%22%5BJournal%5D)">Role of endothelium in the modulation of isoflurane-induced vasodilatation in rat thoracic aorta.</a> British journal of anaesthesia. 79 (1), 84-87 (1997).</li>
<li>Brown, E., Umino, Y., Loi, T., Solessio, E., Barlow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anesthesia+can+cause+sustained+hyperglycemia+in+C57%2FBL6J+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Visual+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Anesthesia can cause sustained hyperglycemia in C57/BL6J mice.</a> Visual neuroscience. 22 (5), 615-618 (2005).</li>
<li>Vaupel, D., McCoun, D., Cone, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phencyclidine+analogs+and+precursors%3A+rotarod+and+lethal+dose+studies+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacology+and+Experimental+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Phencyclidine analogs and precursors: rotarod and lethal dose studies in the mouse.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 230 (1), 20-27 (1984).</li>
<li>Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+mouse+pancreatic+islet+isolation+and+intracellular+cAMP+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (88), (2014).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Sammeln Beweise deutet darauf hin, dass die Exposition zu Umweltchemikalien spielt eine wichtige Rolle bei der Entwicklung des T2DM. XENOBIOTIKA-induzierte ROS wurde als ein möglicher ätiologischer Faktor zur Entwicklung des T2DM anerkannt. Menschen ein breites Spektrum von XENOBIOTIKA Chemikalien ausgesetzt sind, und es gibt ein großer Bedarf an neuartigen Forschungstechniken, effektiv die Bauchspeicheldrüse Giftstoffe zu identifizieren und zu untersuchen, den Mechanismus der Toxizität für die Zellen der Bauchspeicheldr...

Anstieg der Prävalenz von T2DM geworden in den letzten Jahren stellt eine ernsthafte Bedrohung für öffentliche Gesundheit1einer weltweiten Gesundheitskrise. Viele Faktoren gefunden worden zur Entwicklung des T2DM, darunter kausal verknüpft werden wiederkehrende Ergebnisse deuten darauf hin, dass eine konvergente Gemeinsamkeit dieser Faktoren ist die Induktion von oxidativem Stress führt zu der Generation von übermäßigen ROS2 , 3.
Ein breites Spektrum von Umweltchemikalien wie PCB, Dioxine und BaP hat sich herausgestellt, induzieren oxidativen Stress beeinträchtigen die Funktion der Bauchspeicheldrüse β-Zellen und zu Insulin-Resistenz und T2DM4führen kann. Obwohl der physiologische Ebene von ROS in zellulären Funktionen eine wichtige Rolle spielt, ROS, die die Kapazität des antioxidativen Systems übersteigt führt zu Schäden an Zellen/Gewebe und führt zu Krankheiten5. Pankreatische β-Zellen express ein niedriges Niveau der antioxidativen Enzym, und somit ist eine sensible Zielgruppe für den oxidativen Stress-vermittelten Schäden6,7. Chronische Exposition gegenüber hohen Konzentrationen von ROS wurde gezeigt, dass Stress-induzierte Pankreas Zelle Dysfunktion5 verursachen sowie Insulinresistenz in der Leber und Fettgewebe8.
Das übergeordnete Ziel dieses Projektes ist es, eine zellbasierte Assays Bildschirm Chemikalien für ihre diabetogene Potenziale basierend auf ihre Induktion von ROS in Zellen der Bauchspeicheldrüse entwickeln. Die Bauchspeicheldrüse fehlt metabolische Entgiftung und ist ein sensibler Ziel für Fremdstoff-induzierten Schäden6,7. Daher soll dieser Assay durch direkte Messung der ROS erzeugt in den Zellen der Bauchspeicheldrüsen, eine direkte Annäherung an die chemisch induzierte Schädigung der Bauchspeicheldrüse. Um diese Methode zu entwickeln, wir Maus Pankreas Inseln isoliert, kultiviert die isolierte Insel unter Zelle Kultur Bedingung mit Chemikalien und genutzt, die chemisch induzierte ROS-Generation als das Auslesen. Dieses Verfahren ist einfach und effektiv bei der Identifizierung von ROS-induzierende Chemikalien in der isolierten Insel; Es kann für die Untersuchung der Mechanismen der Toxizität weiterentwickelt werden, die speziell für die Bauchspeicheldrüse in Vitro.

<table><tbody><tr><td>10 mal; Hank' s ausgewogene Salzlösung&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase Typ 4</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>CLS-4</td><td></td></tr><tr><td>Polysaccharose/Natriumdiatrizoat-Lösung&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>2',7'-Dichlorfluorescein (DCFH-DA)</td><td>Sigma</td><td>D6883-50MG</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenz-Mikroplatten-Reader</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Sigma</td><td>G8540-25G</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycin</td><td>GIBCO</td><td>15140148</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>GIBCO</td><td>11875-085</td><td></td></tr><tr><td>Avertin</td><td>Sigma</td><td>T48402-25G</td><td></td></tr><tr><td>Ratte/Maus Insulin ELISA Kit</td><td>Millipore</td><td>EZRMI-13K</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Sorval</td><td>Sorval RT7</td><td>für 96-Well-Plattenzentrifuge</td></tr><tr><td>Mikrotiterplatten-Reader</td><td>Biotek</td><td>Epoch 2</td><td>für die Fluoreszenzmessung</td></tr></tbody></table>

ein murinen pancreatic islet cell-basierte screening für diabetogene umweltchemikalien

A Murine Pancreatic Islet Cell-based Screening for Diabetogenic Environmental Chemicals

Exposition gegenüber bestimmten Umweltchemikalien in Mensch und Tier wurde gefunden, um zelluläre Schäden der Bauchspeicheldrüse β-Zellen verursachen, die zu die Entwicklung von Diabetes Mellitus Typ 2 (T2DM) führt. Obwohl die Mechanismen für die chemisch induzierte β Zellschädigung unklar und wahrscheinlich zu komplex waren, ist eine immer wiederkehrende Erkenntnis, dass diese Chemikalien verursachen oxidativen Stress führt zu der Generation von übermäßigen reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) die Schäden zu verursachen die β-Zelle. Ermittlung potenzieller diabetogene Umweltchemikalien, isoliert wir pankreatische Inselzellen von C57BL/6 Mäusen und kultivierten Inselzellen in 96-Well Zellplatten Kultur; dann wurden die Inselzellen mit Chemikalien dosiert und die ROS-Generation wurde von 2', 7'-dichlorofluoresceins (RLKV-DA) Fluoreszenzfarbstoff erkannt. Mit dieser Methode wir gefunden, dass Bisphenol A (BPA), Benzo [a] pyren (BaP) und polychlorierten Biphenylen (PCB), können hohe Konzentrationen von ROS, was darauf hindeutet, dass sie potenziell Schaden in Inselzellen induzieren können induzieren. Diese Methode sollte für das screening von diabetogene XENOBIOTIKA nützlich sein. Darüber hinaus können die kultivierten Inselzellen auch für in-vitro- Analyse der chemisch induzierten Toxizität in Zellen der Bauchspeicheldrüse angepasst werden.

Ein Schliffbild der gesunden isolierten Insel ist in Abbildung 2gezeigt, in dem kleinen Inseln eine Runde oder ovale Form mit relativ einheitliche Größe haben (obwohl Größe Einheitlichkeit von Stamm zu Stamm unterschiedlich sein kann). Wir als Nächstes untersucht pancreatic Islet-Funktionen in einer in-vitro- Assay durch das Inselchen zu isolieren und Stimulierung der Insulinsekretion in den Kultur-Inseln. Abbildung 3 ze...

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Maus pankreatische Inselzellen für das screening von ROS Induktionen durch die XENOBIOTIKA Ermittlung der potenziellen diabetogene XENOBIOTIKA Chemikalien zu isolieren.

Ein murinen Pancreatic Islet Cell-basierte Screening für diabetogene Umweltchemikalien

Exposure to certain environmental chemicals in human and animals has been found to cause cellular damage of the pancreatic &#946; cells which will lead to ...

Pankreaszellen sind ein empfindliches Ziel für ROS-induzierte Schäden, die mit der Entwicklung von Typ-2-Diabetes verbunden sind. Ein auf Pankreaszellen basierender Assay wird helfen, ROS-induzierende Chemikalien zu identifizieren. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, isolierte Pankreas-Inselzellen für eine einfache und effektive Identifizierung der ROS-induzierenden Chemikalien zu verwenden, die das zusätzliche diabetogene Potenzial haben können.Diese Methode kann auch für eine in vitro Analyse der Auswirkungen von Chemikalien auf eine physiologische Funktion der Bauchspeicheldrüse, wie z.B. eine glukosestimulierte Insulinsekretion, verwendet werden. Verwenden Sie eine gebogene Pinzette, um den Zwölffingerdarm nahe der Position des Schließmuskels von Oddi zu klemmen. Klemmen Sie mit einer weiteren gebogenen Pinzette die Zwölffingerdarmwand fest, um den Gallenweg zu blockieren.Suchen Sie den gemeinsamen Gallengang und injizieren Sie mit einer 30-Gauge-Nadel und einer Fünf-Milliliter-Spritze langsam drei Milliliter Kollagenaselösung. Positionieren Sie dann die Maus neu, wobei der Kopf proximal und die Füße distal sind. Stellen Sie sicher, dass der gemeinsame Gallengang und die Bauchspeicheldrüse nach der Injektion aufgebläht sind.Entfernen Sie mit der gebogenen Pinzette und einer feinen Schere die aufgeblähte Bauchspeicheldrüse, um sie vom absteigenden Dickdarm, dem Darm, dem Magen und der Milz zu trennen. Legen Sie dann das Organ in ein 50-Milliliter-Röhrchen mit drei Millilitern Kollagenaselösung und halten Sie es auf Eis. Legen Sie jedes 50-Milliliter-Röhrchen in ein 37 Grad Celsius heißes Wasserbad und inkubieren Sie sie 15 bis 20 Minuten lang.Wirbeln Sie die Röhren vor, sammeln Sie dann vier bis fünf verdaute Organe in einem großen sterilen Waschbecken und verwenden Sie eine Schaufel, um die Bauchspeicheldrüse gründlich auseinander zu brechen. Mit einer 23-Gauge-Nadel und einer Zehn-Milliliter-Spritze mit Waschlösung pipettieren Sie die verdauten Zellen kräftig vom Sieb. Sammeln Sie dann die Waschlösung in einer 50-Milliliter-Tube.Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 97 g und vier Grad Celsius für eine Minute und dekantieren Sie den Überstand. Geben Sie 25 Milliliter Waschlösung in die Röhrchen und resuspendieren Sie das Gewebe durch sanftes Vortexen. Schleudern Sie dann das Gewebe herunter und dekantieren Sie den Überstand.Wiederholen Sie die Wäsche dreimal und achten Sie darauf, dass sich das pelletierte Tuch nicht löst. Um die Inseln zu reinigen, fügen Sie dem gewaschenen Gewebepellet zehn Milliliter Reinigungslösung hinzu und resuspendieren Sie den Inhalt vorsichtig. Fünf Milliliter Isolierlösung vorsichtig auf die Reinigungslösung aufschlagen.Stellen Sie sicher, dass eine scharfe Flüssigkeitsgrenzfläche zwischen den beiden Lösungen aufrechterhalten wird. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 560 g bei vier Grad Celsius für 15 Minuten, mit langsamer Beschleunigung und ohne Pause. Führen Sie dann die Pipette in die Schnittstelle ein und sammeln Sie die Inselschicht.Füllen Sie die Lösung in neue 50-Milliliter-Röhrchen um, bevor Sie das Inselchen wie gerade gezeigt waschen. Nach dem Entfernen der letzten Wäsche zehn Milliliter Inselkulturlösung hinzufügen und vorsichtig und gründlich mischen, um die Inselzellen wieder zu suspendieren. Übertragen Sie dann mit einer Mehrkanalpipette 100 Mikroliter pro Vertiefung in die Vertiefungen einer 96-Well-Platte.Inkubieren Sie die Platte 12 Stunden lang in einem Gewebekultur-Inkubator. Zentrifugieren Sie dann die Platte bei 112 g und entfernen Sie das Nährmedium. Verdünnen Sie die Umweltchemikalien im Inselkulturmedium.Geben Sie 100 Mikroliter jedes der chemischen Verdünnungsmittel in separate Vertiefungen der Platte. Suspendieren Sie die Inselzellen in jeder Vertiefung und inkubieren Sie die Platte 12 Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Nach der chemischen Behandlung der Inselzellen wird 1x PBS verwendet, um die Proben zu waschen.Geben Sie dann fünf millimolare N-Acetylcystein oder NAC als Antioxidans in die Vertiefungen, um ROS zu löschen, und inkubieren Sie die Platten 12 Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Zentrifugieren Sie die 96-Well-Platte bei 112 g, fügen Sie dann fünf mikromolare Lösungen der Fluoreszenzsonde hinzu und inkubieren Sie die Platte 60 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Waschen Sie die behandelten Inselzellen mit PBS dreimal und verwenden Sie einen Mikroplatten-Reader bei 480 Nanometern, um die Fluoreszenz zu messen.Führen Sie schließlich den glukosestimulierten Insulinsekretions- oder GSIS-Assay an den ROS-induzierenden xenobiotisch behandelten und unbehandelten Inselzellen durch, um die xenobiotischen Auswirkungen auf die physiologische Funktion der Pankreasinseln zu messen. Hier sind gesunde Pankreasinseln zu sehen, die aus C57 Black/6-Mäusen isoliert wurden, die rund oder oval geformt und relativ einheitlich groß sind. In diesem GSIS-Assay wurde bei Verwendung von isolierten Inseln, die mit Glukose zur Sekretion von Insulin stimuliert wurden, eine dosisabhängige Reaktion beobachtet.Bei der Behandlung isolierter Inselzellen mit den hier aufgeführten Xenobiotika bewirkten mehrere Chemikalien, darunter Atrazin, BaP, BPA und PCB, eine signifikante Induktion von reaktiven Sauerstoffspezies. Die Zugabe von NAC war jedoch in der Lage, die Produktion von ROS durch die chemischen Behandlungen zu unterdrücken. Darüber hinaus zeigten Pankreasinseln, die mit PCB126 und BPA vorbehandelt wurden, eine signifikante Abnahme der Insulinsekretion im Vergleich zur Kontrollgruppe, was die wichtige Rolle von ROS bei der Schädigung der physiologischen Funktion von Betazellen der Bauchspeicheldrüse, die zu T2DM führt, bestätigt.Einmal gemeistert, kann die Isolierung der Pankreasinseln in zwei Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, die Gradientenzentrifugation zu verwenden, um die Inselzellen von den anderen Pankreasablagerungen zu reinigen. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie die glukosestimulierte Insulinsekretion durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. die Auswirkungen der Chemikalien auf die physiologischen Funktionen der Pankreasinseln.Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Toxikologie, um das diabetogene Potenzial der Umweltchemikalien in isolierten Pankreas-Inselzellen der Maus zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Pankreasinseln der Maus isolieren und diese Inselzellen zur Identifizierung verwenden können.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Murine Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Isolation

Die Untersuchung in vitro β-Zell-Funktion mit isolierten Maus-Langerhans-Inseln ist ein wichtiger Bestandteil in der Studie der Diabetes Pathophysiologie und Therapie. Während viele Downstream-Anwendungen zur Verfügung stehen, dieses Protokoll beschreibt speziell die Messung der intrazellulären zyklischen Adenosinmonophosphat (cAMP) als wesentlicher Parameter, der β-Zellfunktion.

Eine Methode zur Maus-Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Isolation und intrazellulären cAMP-Bestimmung

Wir präsentieren hier ein Protokoll für die Isolierung von Inselzellen aus dem Mausmodell für Typ-2-Diabetes, Leprdb und Details eines Lebendzell-Assays zur Messung der Insulinsekretion von intakten Inseln, der 2-Photonenmikroskopie verwendet.

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Mausmodell des Typ-2-Diabetes: Pancreatic Islet Isolation und Live-cell 2-Photonen-Imaging von intakten Inseln

In vitro - Kolonie - Assays Selbsterneuerung und Differenzierung von Vorläuferzellen , isoliert aus adulten murinen Bauchspeicheldrüse sind entwickelt zu detektieren. In diesen Assays geben Bauchspeicheldrüsen Progenitoren Anlass zu Zellkolonien in 3-dimensionalen Raum in Methylcellulose-enthaltende halbfeste Medium. Protokolle für die sind einzelne Zellen und Charakterisierung von einzelnen Kolonien Handhabung beschrieben.

In - vitro - Assays für Colony Tri-potente Progenitorzellen Charakterisieren von den Adult Murine Pancreas Isoliert

Kritische Herausforderungen für die Diabetesforschung Bereich sind die molekularen Mechanismen zu verstehen, die Insel β-Zellreplikation regulieren und β-Zellregeneration zur Stimulierung der Methoden zu entwickeln. Hierin ist ein High-Content-Screening-Verfahren zur Identifizierung und der β-Zellreplikation fördernden Aktivität von kleinen Molekülen bewerten dargestellt.

Ein hoher Gehalt<em&gt; In Vitro</em&gt; Pancreatic Islet β-Zell-Replikation-Discovery-Plattform

Wir beschreiben eine Methode zur Isolierung von endokrinen Zellen aus embryonalen, Neugeborenen- und postnatale Bauchspeicheldrüsen gefolgt von einzelligen RNA Sequenzierung. Diese Methode ermöglicht Analysen der pankreatischen endokrinen Linie Entwicklung, Zell-Heterogenität und transkriptomischen Dynamik.

Einzellige Transkriptomischen Analysen der Maus endokrinen Zellen der Bauchspeicheldrüse

Diese Studie entwickelte eine vereinfachte Methode, um funktionelle primäre Inselchen und Acinarzellen effizient aus der Bauchspeicheldrüse der Maus zu extrahieren, was ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung der interzellulären Kommunikation in der Pathogenese des akuten Pankreatitis-induzierten Diabetes bietet.

Eine einfache und schnelle Methode zur gleichzeitigen Isolierung von primären Inselchen und primären Pankreas-Acinarzellen von Mäusen

Wir bieten ein minimalinvasives Protokoll für die intramuskuläre Transplantation von von humanen Stammzellen abgeleiteten Pankreas-Stammzellinseln in immundefiziente Mäuse für die In-vivo-Implantation und nachgelagerte Analyse.

Intramuskuläre Transplantation von humanen pluripotenten Stammzellen-abgeleiteten endokrinen Zellen der Pankreasbildung bei Mäusen

Dieses Protokoll beschreibt eine standardisierte Methode zur chirurgischen Entnahme, enzymatischen Verdauung und Dichtegradientenreinigung von Lewis-Rattenpankreasinseln, die ertragreiche, hochreine Präparate für den direkten Einsatz bei Transplantationen oder in vitro-Studien ermöglicht.

Isolierung und Reinigung von Pankreasinseln bei Lewis-Ratten mittels enzymatischer Verdauung und Dichtegradiententrennung

Eine neuartige Methode der gerichteten Evolution spezifischen Bereich der Thermostabilität Engineering entwickelt wurde und folglich validiert bakteriolytischen Enzymen. Nach nur einem Runde der Zufallsmutagenese, ein weiterentwickelter bakteriolytischen Enzym, PlyC 29C3, erscheint größer als zweimal die Restaktivität bei dem Wildtyp-Protein nach erhöhter Temperatur Inkubation verglichen.

Ein neues Screening-Verfahren für die gelenkte Evolution von thermostabilen Bakteriolytische Enzyme

Erfahren Sie die Isolation muriner Pankreas-Inselzellen zur Screening-Methode für ROS-induzierende diabetogene Xenobiotika. Dieses Protokoll ermöglicht die in-vitro-Analyse chemischer Effekte auf die physiologische Funktion des Pankreas.

Ein murinen Pancreatic Islet Cell-basierte Screening für diabetogene Umweltchemikalien

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