Name: Dual Effekte von Melanom Zelle abgeleitet Faktoren auf Knochenmark Adipozyten Differenzierung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: Erfahren Sie, wie ein zweidimensionales Kokultursystem zur Untersuchung der Interaktion zwischen Melanomzellen und Knochenmarkadipozyten etabliert wird. Diese Methode liefert Einblicke in Mechanismen der Knochenmetastasierung.

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Wir danken Dov Zipori (Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel) freundlicherweise für das Bereitstellen der murinen Knochenmark Stromazellen Zelle Linie 14F1.1. Diese Studie wurde unterstützt durch Zuschüsse von der chinesischen National Natural Science Foundation (Nr. 81771729) und der Tropical Hospital von Chongqing Medical University (Nos. YJQN201330; YJZQN201527).

Hinweis: Alle Zellen, die in diesem Protokoll verwendeten sollte für mindestens drei Generationen nach dem Auftauen von gefrorenem Lager Zellen angebaut werden.
1. Ernte Melanom Zelle abgeleitet Faktoren
<ol><li>
Vorbereitungen
	<ol>
<li>Erhalten Sie B16F10 Zellen und eine Maus-Melanom-Zell-Linie. Hinweis: Für dieses Protokoll war eine Maus Melanom-Zelllinie Stammzellenbank der chinesischen Akademie der Wissenschaften entnommen.</li>
		<li>Machen Sie einen kompletten Medium für die B16F10-Zellkultur (100 mL). Verwenden Sie Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS), 50 U/mL Penicillin und 50 µg/mL Streptomycin ergänzt.</li>
		<li>Machen Sie einem serumfreien Medium für den Hungertod von B16F10 Zellen (50 mL). Verwenden Sie DMEM Medium ohne FBS, 50 U/mL Penicillin und 50 µg/mL Streptomycin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bereiten Sie Melanom konditioniertes Medium (CM)
	<ol>
<li>2.0 x 105 B16F10 Samenzellen in einem 100 mm Schale FBS DMEM mit 10 mL 10 %. Inkubieren Sie dann die Zellen in einem Inkubator 37 ° C in einer Atmosphäre von 5 % CO2 für 24 h.</li>
		<li>Wenn die Zellen etwa 80 % der Zusammenfluss erreichen, entnehmen Sie das Kulturmedium waschen Sie die Zellen zweimal mit 5 mL der Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) (1 X, pH 7,4) und ersetzen Sie das Medium mit einer 10 mL serumfreien Medium für den Hungertod.</li>
		<li>Die Zellen in den Inkubator für 18 – 24 h zurück.</li>
		<li>Nach dem Hunger der konditionierte Medium (CM) mit einer Pipette zu sammeln und überträgt es auf eine frische 50 mL Zentrifugenröhrchen. Hinweis: Die konditionierte Medium ist der Überstand des B16F10-Zellkulturen. Stellen Sie sicher, dass die B16F10 Zellen in einem guten Zustand sind, vor der Erhebung der CM.</li>
		<li>Zentrifugieren der CM für 5 min bei 1000 X g bei 4 ° C.</li>
		<li>Pipette überstand und überträgt es auf ein frisches steriles Röhrchen oder eine Flasche. Hinweis: Vermeiden Sie aus das Pellet am Boden des Röhrchens pipettieren.</li>
		<li>Um die Zelle Ablagerungen zu entfernen, Filtern Sie die CM nach Durchlaufen eines Spritze verbunden 0,45 µm-Filters auf eine sterile Flasche oder Tube. Hinweis: 0,22 µm Filter sind optimal für die Filterung der CM.</li>
		<li>Speichern Sie die gefilterten Überstand bei-20 ° C bis zur Verwendung. Hinweis: Es empfiehlt sich nicht, den Überstand bei-20 ° C für mehr als einen Monat zu speichern. Alternativ speichern Sie die CM bei-80 ° C für mehr längere Zeit für die Differenzierung von Adipocyte.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(2) Induktion von Knochenmark Adipozyten durch Melanom Zelle abgeleitet Faktoren
<ol><li>
Vorbereitungen
	<ol>
<li>100 mL adipogenen Induktion mittlere28zu machen. Verwenden Sie eine komplette DMEM mit 5 µg/mL Insulin, 0,5 mM 3-Isobutyl-1-methylxanthin und 1 µM Dexamethason ergänzt. Bis zu zwei Wochen bei 4 ° c speichern</li>
		<li>100 mL adipogenen Wartung Medium vorzubereiten. Verwenden Sie eine komplette DMEM oder gemischt mit 50 % Melanom CM ergänzt mit 5 µg/mL Insulin.</li>
		<li>Machen Sie ein Öl Rot O-Stammlösung. Lösen Sie 30 mg Öl Rot O Pulver in 10 mL Isopropanol (≥ 99.5 % auf) und mischen sie gut durch Wirbel. Hinweis: Bewahren Sie es bis zu 1 Jahr bei 4 ° C.</li>
		<li>Machen Sie eine Öl Rot O funktionierende Lösung. In der Dunstabzugshaube verdünnt das Öl Rot O-Stammlösung (aus Schritt 2.1.3) mit entionisiertem Wasser in einem Verhältnis von 3:2. Inkubieren Sie die Mischung für 15 min bei Raumtemperatur und Filtern Sie es durch einen 0,22 µm-Filter vor der Verwendung. Hinweis: Verwenden Sie nur frische Arbeitslösung innerhalb von 2 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Adipocyte Unterscheidung
	<ol>
<li>Kultur eine Stromale Zelle Linie 14F1.1 aus Maus Knochenmark29 in einer 60 mm Schale mit einer kompletten DMEM bei 80 % Konfluenz in einem Inkubator 37 ° C in einer Atmosphäre von 5 % CO2. Hinweis: Alternativ ersetzen Sie 14F1.1 mit primären Knochenmark gewonnenen mesenchymalen Zellen30.</li>
		<li>Die Zellen mit 1,5 mL einer 0,25 %-Trypsin-Lösung in einem Inkubator für 1 – 2 min. trypsinize.</li>
		<li>Die Zellen 5 mL 10 % FBS Medium hinzu und zählen Sie die Anzahl der Zellen mit einem Glas Hemocytometer; passen Sie dann die Zelldichte auf etwa 1 – 2 x 105/mL.</li>
		<li>Samen 5 x 104 14F1.1 Zellen pro Bohrloch in einer 24-Well-Platte mit 0,5 mL adipogenen Induktion Medium. Nach zwei Tagen Inkubation erreichen die Zellen etwa 90 % der Zusammenfluss. Hinweis: Dieser Schritt ist sehr wichtig. Knochenmark-Stromazellen Zellen können nicht zu Adipozyten ohne ein adipogenen Induktion Medium induziert werden.</li>
		<li>Die Induktion-Medium entfernen und Waschen der Zellen zweimal mit 1 mL PBS jedes Mal.</li>
		<li>Ändern Sie in 1 mL adipogenen Wartung Medium und weiterhin die Zellen bis Adipocyte Reifung Kultur. Hinweis: Unter dem Mikroskop Adipozyten sehen aus wie kleine oder große Seifenblasen und sind sehr leicht zu erkennen. In der Regel sind Reifen Adipozyten auf 6th oder 8th Tag vorhanden.</li>
		<li>Flecken auf die Reifen Adipozyten mit Öl Rot O oder sammeln die Adipozyten für eine quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR)-Analyse.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Adipocyte Färbung
	<ol>
<li>Waschen der differenzierten 14F1.1 Zellen 2 X mit PBS und in 3,7 % Formaldehyd für 1 h zu beheben.</li>
		<li>Spülen Sie die Zellen in 60 % Isopropanol und vollständig trocknen lassen.</li>
		<li>Die Brunnen 0,2 mL Öl Rot O funktionierende Lösung hinzu und bei 0,5 bis 2 h bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
		<li>Waschen Sie die Zellen mit Wasser um die ungebundene Farbstoffe entfernen.</li>
		<li>Foto der gefärbten Adipozyten unter einem Lichtmikroskop.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Coculture des Knochenmarks Adipozyten mit Melanomzellen
<ol><li>
Vorbereitungen
	<ol>
<li>Bereiten Sie Reifen Knochen Knochenmark Adipozyten: induzieren der 14F1.1 Zellen in Reife BM Adipozyten in 24-Well-Platten mit dem adipogenen Induktion Medium für 2 Tage, und dann behaupten sie mittelfristig adipogenen Wartung für weitere 6 – 8 Tage.</li>
		<li>Vorbereiten der B16F10 Zellen: die B16F10 in 60 mm Schalen mit 5 mL DMEM Medium Kulturzellen.</li>
		<li>Befeuchten Sie die Membran einfügen (z.B. Transwell): 0,4 µm Porengröße Membran Einsätze 150 µL des FBS-freie DMEM Medium hinzu und Tauchen sie auf den Brunnen 24-Well-Platten mit 500 µL FBS-freie DMEM Medium gefüllt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Coculture Einstellung
	<ol>
<li>Langsam Pipette aus dem Medium jeder Einsatz. Hinweis: Zerstören Sie die Membran nicht, wenn das Medium zu entfernen.</li>
		<li>Samen der B16F10 Zellen (0/103105106) in die Pore 0,4 µm fügt aus Schritt 3.2.1.</li>
		<li>Ersetzen Sie die adipogenen Wartung Medium in den Vertiefungen mit Reifen Knochenmark Adipozyten aus Schritt 3.1.1. mit 600 µL kompletten DMEM Medium.</li>
		<li>Übertragen Sie die Einsätze, gefüllt mit den B16F10 Zellen (aus Schritt 3.2.2) auf den Brunnen mit der Reife des Knochenmarks Adipozyten (aus Schritt 3.2.3) für die Coculture Experimente.</li>
		<li>2 Tage inkubieren Sie Kokulturen bei 37 ° C und 5 % CO2 .</li>
		<li>Nach 48 h Inkubation, entfernen Sie die Einsätze der Coculture und dann waschen Sie die Fettzellen 2 X mit 500 µL 1 X PBS. Hinweis: Optional, kassieren Sie die B16F10 Zellen in den Einschüben für die Analyse benötigt.</li>
		<li>Färben Sie die Adipozyten mit Öl Rot O funktionierende Lösung oder sammeln Sie die Adipozyten für qPCR-Analyse. Hinweis: Siehe Färbeverfahren in Schritt 2.3.</li>
		<li>Foto der gefärbten Adipozyten unter einem Lichtmikroskop.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. qPCR Analyse des Adipocyte-spezifischen Gene Signature
<ol><li>Hinzufügen von 0,5 mL der Ready-to-Use RNA Isolierung Reagenz pro Bohrloch in einer 24-Well-Platte in die Reife Adipocyte bereit zu erkennen ist.</li>
	<li>Folgen Sie ein Standardprotokoll für die RNA-Gewinnung und die cDNA Synthese31.</li>
	<li>Verwenden Sie die Grundierung für 18 und GAPDH als Kontrolle und CEBPα/β, PPARγ, FABP4, Leptin, Pref-1 oder Adiponectin für die Adipocyte-spezifischen gen-Signatur (Tabelle 1).</li>
	<li>Führen Sie die folgende Reaktion in einem Thermocycler: 95 ° C für 20 s, gefolgt von 40 Zyklen von 95 ° C für 1 s und 60 ° C für 20 s.</li>
	<li>Verwenden Sie die 2–ΔΔCt Methode zur Berechnung die Falte32ändert.</li>
</ol>

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<li>Gazi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+evidence+of+lipid+translocation+between+adipocytes+and+prostate+cancer+cells+with+imaging+FTIR+microspectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Direct evidence of lipid translocation between adipocytes and prostate cancer cells with imaging FTIR microspectroscopy.</a> The Journal of Lipid Research. 48 (8), 1846-1856 (2007).</li>
<li>Brown, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+omega-6+PUFA+arachidonic+acid+and+bone+marrow+adipocytes+on+metastatic+spread+from+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Influence of omega-6 PUFA arachidonic acid and bone marrow adipocytes on metastatic spread from prostate cancer.</a> British Journal of Cancer. 102 (2), 403-413 (2010).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts zu verzollen.

Kokulturen mit Einsätzen wurden weithin zur Zell-Zell-Interaktionen zu untersuchen. Das 2D Coculture System ist eine effektive Möglichkeit zu beobachten, wie die beiden Teile durch die zeigten wir hier zwei verschiedene Krebs Zelle-angetrieben Auswirkungen auf Knochenmark Adipozyten, Übersprechen in Vitro. Viele Labore haben diese Methode, um das Übersprechen zwischen Adipozyten und Krebs Zellen6,12,27,<sup c...

Knochenmetastasen sind weit verbreitet bei fortgeschrittenem Krebs-Patienten, aber eine kurative Behandlung ist noch nicht verfügbar. Darüber hinaus spezialisiert auf Energie als Fett zu speichern, unterstützen Adipozyten Tumorwachstum und Metastasierung im Knochenmark und anderen Organen1,2,3,4,5,6. Darüber hinaus spielen Adipozyten eine wesentliche Rolle bei der Regulierung der Krebs Zelle Biologie7,8,9,10 und Stoffwechsel4,11,12 ,13,14,15,16, so gut wie in Knochen Metastasen1,4,12. In der Nische des Knochenmarks können Adipozyten auch Auswirkungen auf das biologische Verhalten von Krebs Zellen4,6,17. Das Zusammenspiel von Knochenmark Adipozyten und Krebszellen mit Osteotropism ist bedeutsam für das Verständnis von Knochenmetastasen. Jedoch ist wenig bekannt.
Basierend auf aktuellen Studien, werden verschiedene Methoden auf Adipozyten, einschließlich zwei- oder dreidimensionale (2/3D) und ex-Vivo Kulturen17,18,19,20,21angewendet. Vor kurzem, Herroon Et Al. entwickelt ein neues 3D-Kultur-Konzept für Interaktionen von Knochenmark Adipozyten mit Krebs Zellen22zu untersuchen. Obwohl die 3D Coculture ist optimal für die Nachahmung physiologischen Wechselwirkungen zwischen Adipozyten und Krebs-Zellen in Vivo, es leidet unter schlechten Reproduzierbarkeit22,23. Im Vergleich zu einem 2D Coculture System kann ein 3D Coculture System verschiedene zelluläre Phänotypen, wie Zelle Morphologie21,22,24,25,26vorsehen. Darüber hinaus kann die ex-Vivo -Kultur der isolierten Spongiosa gewebefragmente zu einer robusten Auswuchs der Adipozyten aus kultivierten Knochenmark Zellen17führen.
Im Gegensatz zu diesen früheren Modellen bleibt jedoch das 2D zellenmodell Kultur eine klassisch, zuverlässige und einfache Technik für schnell scannen Kandidat Moleküle und die Phänotypen verändert in Adipozyten oder Krebs in Vitro1Zellen, 4,6,12,15,27. Um das Übersprechen zwischen dem Knochenmark Adipozyten und Melanomzellen besser verstehen zu können, bieten wir ein detailliertes Protokoll für ein 2D Coculture Knochenmark Adipozyten mit Melanomzellen.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen Inc.</td><td></td><td></td>11965092</tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Invitrogen Inc.</td><td>16000&ndash; 044</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Invitrogen Inc.</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>91077C</td><td></td></tr><tr><td>3-Isobutyl-1-methyl-xanthin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>Dexamethason</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>Öl Rot o</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O0625</td><td></td></tr><tr><td>24-Well-Platte</td><td>Corning</td><td>CLS3527</td><td></td></tr><tr><td>Transwell-Einsatz</td><td>Millipore</td><td>MCHT24H48</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>0,25 % Trypsin</td><td>Thermo Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Hämozytometer</td><td>Bio-Rad</td><td>1450016</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator Thermo</td><td>Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL falcon</td><td>Corning</td><td>CLS430828</td><td></td></tr><tr><td>Clean Bench</td><td>Thermo Scientific-Mikroskopie</td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Olympus-200</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>&mu; L Pipettenspitzen</td><td>BeyoGold</td><td>FTIP620</td><td></td></tr><tr><td>1.000 mL Pipettenspitzen</td><td>BeyoGold</td><td>FTIP628</td><td></td></tr></tbody></table>

dual effekte von melanom zelle abgeleitet faktoren auf knochenmark adipozyten differenzierung

Dual Effects of Melanoma Cell-derived Factors on Bone Marrow Adipocytes Differentiation

Das Übersprechen zwischen dem Knochenmark Adipozyten und Tumorzellen kann eine entscheidende Rolle im Prozess der Knochenmetastasen. Eine Vielzahl von Methoden stehen zur Verfügung für das bedeutende Übersprechen zu studieren; ein zweidimensionales Transwell-System für die Coculture bleibt jedoch ein Klassiker, zuverlässig, und einfache Möglichkeit für diese Studie Übersprechen. Hier präsentieren wir Ihnen ein detailliertes Protokoll, das die Coculture von Knochenmark Adipozyten und Melanomzellen zeigt. Dennoch könnte ein solches Coculture System nicht nur einen Beitrag zur Erforschung der Zelle Signal Transductions von Krebszellen durch Knochenmark Adipozyten induziert, sondern auch in die Zukunft mechanistischen Studie von Knochenmetastasen die neue therapeutische Zielstrukturen für Knochen zeigen kann Metastasierung.

Im Knochenmark, Adipozyten können in den Tumor Mikroumgebung1,13,33,34,35 in einem frühen Stadium zur Unterstützung der Tumorprogression durch lösliche Faktoren erscheinen oder Osteoclastogenesis6,12,36, vor allem im Zusammenhang mit F...

Hier präsentieren wir Ihnen eine zuverlässige und einfache zweidimensionale (2D) Coculture-System für das Studium der Interaktion zwischen Tumorzellen und Knochenmark Adipozyten, die eine doppelte Wirkung von Melanom Zelle abgeleitet Faktoren auf das Knochenmark Adipozyten enthüllt Differenzierung und stellt auch eine klassische Methode für die mechanistischen Studie von Knochenmetastasen.

Dual Effekte von Melanom Zelle abgeleitet Faktoren auf Knochenmark Adipozyten Differenzierung

The crosstalk between bone marrow adipocytes and tumor cells may play a critical role in the process of bone metastasis. A variety of methods are ...

Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Knochenmetastasierungsforschung zu beantworten, z. B. welche Veränderungen im Wachstum der Knochenmark-Adipozyten induziert werden und wie sie sich in einer Krebsmikroumgebung entwickeln. Die großen Vorteile dieser Technik sind, dass sie einfach durchzuführen ist und dass die Kandidatenmoleküle schnell gewonnen werden können. Diese Methode kann Einblicke in die Wechselwirkung zwischen den Adipozyten des Knochenmarks und den melanomalen Zellen geben.Es kann auch auf andere Zelltypen, wie z. B. Osteoblasten, angewendet werden. Beginnen Sie mit der Aussaat von zweimal 10 bis fünf B16F10-Melanomzellen in einer 100-Millimeter-Schale mit 10 Millilitern DMEM, ergänzt mit 10 % FBS, für eine 24-stündige Inkubation bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2. Waschen Sie am nächsten Tag die etwa 80%ige konfluente Zellkultur zweimal mit fünf Millilitern PBS pro Waschgang und hungern Sie die Zellen mit 10 Millilitern serumfreiem Kulturmedium im Zellkultur-Inkubator für 18 bis 24 Stunden aus.Am nächsten Tag wird der konditionierte Überstand mit einer Pipette zur Zentrifugation in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen überführt und das Medium in eine Spritze gefüllt, die mit einem 0,45-Mikron-Porenfilter ausgestattet ist. Seihen Sie die Lösung dann in einen sterilen Behälter ab, um alle verbleibenden Zelltrümmer zu entfernen, und lagern Sie das konditionierte Medium bis zu einem Monat lang bei minus 20 Grad Celsius. Um Knochenmark-Adipozyten zu induzieren, kultivieren Maus F14 1.1 Knochenmark-Stromazellen in einer 60-Millimeter-Schale mit vollständigem DMEM auf eine Konfluenz von 80 %.Ernten Sie die Zellen in der geeigneten Kulturphase mit 1,5 Millilitern einer 0,25%igen Trypsinlösung für ein bis zwei Minuten bei 37 Grad Celsius. Wenn sich die Zellen abgelöst haben, stoppen Sie die enzymatische Reaktion mit fünf Millilitern Medium, das mit 10 % FBS versetzt ist, und stellen Sie die Zellen auf eine ein- bis zweimal 10 bis fünfte Zellen pro Milliliter Konzentration mit frischem Serum ein. Säen Sie fünfmal 10 Zellen in 0,5 Milliliter adipogenes Induktionsmedium pro Vertiefung in einer 24-Well-Platte aus und geben Sie die Zellen für weitere zwei Tage in den Zellkultur-Inkubator zurück, bis sie eine Konfluenz von etwa 90 % erreichen.Ersetzen Sie dann den Überstand durch einen Milliliter adipogenes Erhaltungsmedium pro Vertiefung und kultivieren Sie die Zellen bis zur Reifung der Adipozyten. Wenn die Zellen unter Lichtmikroskopie wie kleine bis große Seifenblasen aussehen, waschen Sie diese reifen Adipozyten zweimal mit PBS, gefolgt von einer einstündigen Fixierung in 0,2 Millilitern 3,7 % Formaldehyd. Spülen Sie die fixierten Zellen in 60%igem Isopropanol und lassen Sie die Vertiefungen vollständig trocknen.Geben Sie 0,2 Milliliter Oil Red O-Arbeitslösung für eine 30- bis 120-minütige Inkubation bei Raumtemperatur in die Zellen und waschen Sie die Zellen mit Wasser, um ungebundene Farbstoffe für die Abbildung der Adipozyten durch Lichtmikroskopie zu entfernen. Alternativ können Sie nach ihrer Reifung 0,5 Milliliter gebrauchsfertiges RNA-Isolationsreagenz in jede Adipozytenkulturvertiefung geben und die entsprechenden Primer verwenden, um die Adipozyten-spezifische Gensignatur der Zellen zu bestätigen. Führen Sie dann die Reaktion in einem Thermocycler mit den angegebenen Einstellungen durch.Um eine aus dem Knochenmark gewonnene Adipozyten-Melanomzell-Cokultur einzurichten, geben Sie zunächst 150 Mikroliter serumfreies DMEM in die inneren Kammern von Membraneinsätzen mit einer Porengröße von 0,4 Mikrometern und platzieren Sie jeden Einsatz in einer Vertiefung einer 24-Well-Platte, die 500 Mikroliter serumfreies Medium pro Vertiefung enthält. Verdünnen Sie B16F10-Melanomzellen aus einer 80%igen Zellkultur auf eine experimentell geeignete Konzentration in frischem serumfreiem Medium und ersetzen Sie das Medium in der Innenkammer jedes Einsatzes durch 150 Mikroliter Zellen. Ersetzen Sie als Nächstes den adipogenen Erhaltungsmediumüberstand in jeder Vertiefung einer 90%igen konfluenten reifen Knochenmark-Adipozytenkultur durch 600 Mikroliter vollständiges DMEM und übertragen Sie die Melanomzell-haltigen Inserts in jede Vertiefung der reifen Adipozytenkulturplatte.Wenn alle Einsätze übertragen wurden, legen Sie die Platte in den Zellkultur-Inkubator. Entfernen Sie nach zwei Tagen die Einlagen und waschen Sie den Boden jeder Vertiefung zweimal mit 500 Mikrolitern PBS pro Waschgang. Färben Sie dann die Adipozyten mit der Oil Red O-Arbeitslösung oder analysieren Sie die Adipozyten-Genexpression durch quantitative PCR, wie gezeigt.Reife Adipozyten, die in tumorkonditioniertem Medium differenziert wurden, enthalten Lipidtröpfchen, so dass die differenzierten Adipozyten durch Öl-Rot-O-Färbung leicht identifiziert werden können. Die Adipozyten-spezifische Gensignatur dieser Zellen kann auch durch quantitative PCR bestätigt werden. Eine Verringerung der Lipidspeicherung wird in Adipozyten beobachtet, die in Gegenwart einer hohen Anzahl von Melanomzellen kokultiviert wurden, sowie eine Dedifferenzierung des Adipozyten-Phänotyps, was sich in einer verminderten Adipozyten-spezifischen Genexpression in diesen ehemals reifen Zellen zeigt.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie ein 2D-Co-Kultursystem entwerfen und einrichten, um die Wechselwirkungen zwischen zwei verschiedenen Zelltypen zu untersuchen.

dual-effects-melanoma-cell-derived-factors-on-bone-marrow-adipocytes

Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Dieses Video zeigt die Differenzierung von Knochenmark-Stromazellen (BMSCs) in Adipozyten. Im zweistufigen Prozess differenzieren sich undifferenzierte BMSCs in Gegenwart von spezifischen Wachstumsfaktoren und Hormonen zunächst zu Präadipozyten. Der zweite Schritt, die Behandlung mit Glukose und Insulin, führt zur Bildung reifer Adipozyten mit mehreren Lipidtröpfchen.

In vitro Differenzierung von Stromazellen aus dem Knochenmark der Maus in Adipozyten

Fettgewebe (AT) kann die Homöostase des ganzen Körpers beeinflussen, daher ist es wichtig, die molekularen Mechanismen der Adipozytendifferenzierung und -funktion zu verstehen. Wir stellen ein Protokoll zur Verfügung, um neue Einblicke in diese Prozesse zu gewinnen, indem wir die Homöostase, die Differenzierung und die Hypoxie-Exposition der Adipozyten als Modell für die induzierte Apoptose der Adipozyten analysieren.

Mechanismus der Regulierung der Adipocyte Zahlen in adulten Organismen durch Differenzierung und Apoptosis Homöostase

In mehrzelligen Organismen lösen sekretierte lösliche Faktoren Reaktionen von verschiedenen Zelltypen als Ergebnis der parakrinen Signalübertragung aus. Insert-Co-Kultursysteme bieten eine einfache Möglichkeit, die Veränderungen zu beurteilen, die durch sekretierte lösliche Faktoren in Abwesenheit von Zell-Zell-Kontakt vermittelt werden.

Entwicklung eines Insert Co-Kultursystem von zwei Cellular Typen in der Abwesenheit von Zell-Zell-Kontakt

Hier berichten wir über eine Methode zur Isolierung von Adipozyten-Progenitor-Zellen (APC) -Populationen aus perivaskulärem Adipositus (PVAT) mittels magnetisch-aktivierter Zellsortierung (MCS). Diese Methode ermöglicht eine erhöhte Isolierung von APC pro Gramm Fettgewebe im Vergleich zu Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS).

Expansion und Adipogenese Induktion von Adipozyten-Progenitoren aus perivaskulärem Fettgewebe, isoliert durch magnetisch aktivierte Zellsortierung

Traditionelle Methoden zur Beurteilung der adipogenen Differenzierung sind billig und einfach zu bedienen, aber sind nicht spezifisch für Änderungen in der Genexpression. Wir haben einen Test zur Quantifizierung von mesenchymalen Zelldifferenzierung in Reifen Adipozyten mit einer Linie spezifische Marker entwickelt. Dieser Test hat vielfältige Anwendungen in Grundlagenforschung und klinischer Medizin.

Visualisierung und Quantifizierung von mesenchymalen Zellen adipogenen Differenzierung Potenzial mit einer Linie spezifische Marker

Die Unterscheidung von weiß und Beige Adipozyten aus Fettgewebe vaskulären Stammeltern trägt metabolische Verbesserungspotenzial bei Adipositas. Protokolle beschrieben für eine CD34 + CD31 + Endothelzellen losgelöst von menschlichen Fett und für eine spätere in-vitro- Erweiterung und Differenzierung in weiß und Beige Adipozyten. Mehrere downstream-Anwendungen werden diskutiert.

Isolation, Expansion und Adipogenen Induktion von CD34 + CD31 + Endothelial Zellen aus menschlichen Omentalis und subkutanem Fettgewebe

Das folgende Verfahren beschreibt eine Methode zur räumlichen und zeitlichen Kontrolle der melanozytischen Tumorinitiation in der Murin-Sdorsal-Haut mit Hilfe eines gentechnisch veränderten Mausmodells. Dieses Protokoll beschreibt sowohl die makroskopische als auch die mikroskopische kutane Melanom-Annenentzündung.

Räumliche und zeitweilige Kontrolle der Murine Melanom-Initiation aus Mutant Melanocyte Stammzellen

Das Protokoll ermöglicht die Erzeugung einer reinen Adipozytenpopulation aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs). Retinsäure wird verwendet, um iPS-Zellen in mesenchymale Stammzellen (MSCs) zu differenzieren, die für die Produktion von Adipozyten verwendet werden. Anschließend wird ein Sortieransatz auf Basis der Nilrotfärbung verwendet, um reine Adipozyten zu erhalten.

Robuste Differenzierung von humanen iPS-Zellen in eine reine Population von Adipozyten zur Untersuchung von Adipozyten-assoziierten Erkrankungen

Dieses Protokoll beschreibt die halbautomatische Isolierung der stromalen vaskulären Fraktion (SVF) aus murinem Fettgewebe, um Präadipozyten zu erhalten und eine Adipozytendifferenzierung in vitro zu erreichen. Die Verwendung eines Gewebedissoziators für den Kollagenaseverdau reduziert die experimentelle Variation und erhöht die Reproduzierbarkeit.

Halbautomatische Isolierung der stromalen vaskulären Fraktion aus murinem weißem Fettgewebe mit Hilfe eines Gewebedissoziators

In diesem Artikel wird ein Protokoll für die Vermehrung von zerebralen Tumorzellen (CSF-CTCs) beschrieben, die von Patienten mit Melanom-assoziierter leptomeningealer Erkrankung (M-LMD) gesammelt wurden, um präklinische Modelle zur Untersuchung von M-LMD zu entwickeln.

Ex vivo Kultur von zirkulierenden Tumorzellen in der Hirnmarksflüssigkeit von Melanompatienten zur Untersuchung der Melanom-assoziierten Leptomeningealerkrankung

Erfahren Sie, wie ein zweidimensionales Kokultursystem zur Untersuchung der Interaktion zwischen Melanomzellen und Knochenmarkadipozyten etabliert wird. Diese Methode liefert Einblicke in Mechanismen der Knochenmetastasierung.

Dual Effekte von Melanom Zelle abgeleitet Faktoren auf Knochenmark Adipozyten Differenzierung

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