Titration ELISA als eine Methode zur Bestimmung der Dissoziationskonstante Rezeptor Liganden Interaktion

Das übergeordnete Ziel dieses Titrations-ELISA besteht darin, die Affinitätskonstante zweier Bindungspartner auf reproduzierbare und effiziente Weise unter Verwendung eines neuartigen Algorithmus zu bestimmen. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen nicht nur im Bereich der Protein-Ligand-Interaktion und der Rezeptorforschung zu beantworten, sondern auch in angewandten Lebenswissenschaften wie der pharmazeutischen Forschung und der Pharmakologie. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Affinitätskonstante einer Rezeptor-Ligand-Interaktion einfach durch Titration eines Rezeptors mit einem Liganden auf einer ELISA-Platte und unter Verwendung eines neuartigen Auswertungsalgorithmus bestimmt werden kann.

Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie die Stammlösung von Integrin Alpha 2 A Domain auf eine Endkonzentration von fünf Mikrogramm pro Milliliter in TBS-Magnesiumchlorid-Puffer verdünnen. In dieser Demonstration werden sowohl eine Wildtyp- als auch eine Mutante von Integrin Alpha 2 A Domain verwendet. Füllen Sie jedes Loch einer Reihe auf einer halben Fläche einer Mikrotiterplatte mit 50 Mikrolitern der Integrin Alpha 2 A Domain-Beschichtungslösung.

Führen Sie jede Titrationsreihe mindestens in Duplikaten durch. In diesem Beispiel wird jede Titrationsreihe in Vierfachen durchgeführt. Versiegeln Sie die Platte mit Folie und lassen Sie die Platte über Nacht bei vier Grad Celsius stehen.

Am folgenden Tag entfernen Sie die Beschichtungslösung und füllen jedes Loch mit 15 Mikrolitern TBS-Magnesiumchlorid-Puffer. Entfernen Sie die Waschlösung und füllen Sie die Löcher mit neuer Waschlösung. Die Waschgänge entfernen lösliche Rezeptormoleküle, die nicht durch physische Absorption an der Kunststoffoberfläche immobilisiert wurden.

Der nächste Schritt besteht darin, nicht-spezifische Bindungsstellen zu blockieren, indem Sie 50 Mikroliter einer einprozentigen BSA-Lösung in TBS-Magnesiumchlorid-Puffer in jedes Loch geben. Versiegeln Sie die Platte wieder und inkubieren Sie sie für eine Stunde bei Raumtemperatur. Während die Löcher der Mikrotiterplatte mit BSA blockiert werden, bereiten Sie eine Serienverdünnung des Liganden Rhodocetin vor.

In diesem Fall wird eine Startkonzentration von 243 emailverätztem Rhodocetin und ein Verdünnungsfaktor von 2,3 verwendet. Bereiten Sie für die acht Titrationskurven in diesem Experiment 920 Mikroliter einer Rhodocetin-Lösung in der höchsten Konzentration in einem Prozent BSA in TBS-Magnesiumchlorid in Teströhrchen Nummer eins vor. Pipettieren Sie 520 Mikroliter einer einprozentigen BSA-Lösung in TBS-Magnesiumchlorid in jedes der anderen zehn Teströhrchen, die mit zwei bis elf gekennzeichnet sind.

Übertragen Sie 400 Mikroliter der Rhodocetin-Lösung von Teströhrchen zu Teströhrchen zwei. Mischen Sie beide Lösungen durch Schütteln und übertragen Sie dann 400 Mikroliter aus dieser Mischung in Teströhrchen drei. Fahren Sie mit dieser Serienverdünnung bis Teströhrchen elf fort.

Für den Erfolg dieses Verfahrens ist es wichtig, jedes Loch schnell mit Lösung zu füllen, um sicherzustellen, dass die Löcher nicht austrocknen. Nach Abschluss der einstündigen Inkubation entfernen Sie die Blockierungslösung aus den Mikrotiterplattenlöchern. Geben Sie sofort 50 Mikroliter der Rhodocetin-Lösung aus Teströhrchen eins in die Löcher der Spalte eins, die Lösung aus Teströhrchen zwei in die Löcher der Spalte zwei und fahren Sie durch Spalte elf fort.

Geben Sie 50 Mikroliter ein Prozent BSA und TBS-Magnesiumchlorid als ligandenfreien Kontrollwert in die Löcher der Spalte zwölf. Versiegeln Sie die Platte wieder und inkubieren Sie sie bei Raumtemperatur für eineinhalb Stunden. Um nicht gebundene Ligandmoleküle zu entfernen, entfernen Sie die Bindungslösung und füllen Sie jedes Loch mit 50 Mikrolitern HBS-Magnesiumchlorid-Puffer.

Entfernen Sie dann den HBS-Puffer und fügen Sie neuen HBS-Puffer hinzu. Um den Rezeptor und das gebundene Ligand chemisch zu fixieren, füllen Sie jedes Loch der Mikrotiterplatte mit 50 Mikrolitern einer 2,5 Prozent Glutaraldehydlösung in HBS-Magnesiumchlorid-Puffer. Inkubieren Sie die Mikrotiterplatte bei Raumtemperatur für zehn Minuten.

Entfernen und inaktivieren Sie überschüssiges Glutaraldehyd, indem Sie die Fixierlösung entfernen und jedes Loch mit 50 Mikrolitern TBS-Magnesiumchlorid-Puffer füllen. Entfernen Sie den Waschpuffer und fügen Sie neuen Waschpuffer in jedes Loch. Um diesen Test zu beginnen, entfernen Sie den Waschpuffer aus allen Löchern der Mikrotiterplatte und geben Sie in jedes Loch 50 Mikroliter der Primärantikörperlösung, verdünnt 1:2000 in ein Prozent BSA TBS-Magnesiumchlorid.

Versiegeln Sie die Platte wieder und inkubieren Sie sie bei Raumtemperatur. Entfernen Sie die Primärantikörperlösung aus allen Löchern und geben Sie in jedes Loch 50 Mikroliter TBS-Magnesiumchlorid-Puffer. Waschen Sie dreimal mit TBS-Magnesiumchlorid-Puffer.

Fügen Sie dann in jedes Loch 50 Mikroliter der Sekundärantikörperlösung hinzu, verdünnt 1:2000 in ein Prozent BSA in TBS-Magnesiumchlorid. Versiegeln Sie die Platte wieder und lassen Sie sie bei Raumtemperatur stehen. Entfernen Sie die Sekundärantikörperlösung aus den Löchern und geben Sie in jedes Loch 50 Mikroliter TBS-Magnesiumchlorid-Puffer.

Waschen Sie dreimal. Nach dem dritten Waschgang tippen Sie die Mikrotiterplatte auf ein Gewebetuch, um alle Flüssigkeitsspuren zu entfernen. Geben Sie mit einer Mehrkanalpipette umgehend 50 Mikroliter der alkalischen Phosphatase-Nachweislösung in jedes Loch der Mikrotiterplatte, um die enzymatische Umwandlung so gleichzeitig wie möglich zu starten.

Inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur, bis die Lösung in den Löchern mit der höchsten Ligandenkonzentration gelb wird. Je nach Signalintensität kann die Inkubationszeit zwischen fünf Minuten und einer Stunde variieren. Stoppen Sie die Umwandlung des Phosphatase-Substrats, indem Sie mit einer Mehrkanalpipette 50 Mikroliter einer 1,5 molaren Natriumhydroxidlösung in jedes Loch in der gleichen Reihenfolge geben, in der die alkalische Phosphatase-Nachweislösung hinzugefügt wurde.

Lassen Sie die Platte einige Minuten stehen, um eine streifenfreie Vermischung beider Lösungen zu gewährleisten. Messen Sie die optische Dichte bei 405 Nanometern jedes Lochs mit einem ELISA-Reader. Beginnen Sie die Datenanalyse, indem Sie die Tabelle mit den Rohdaten öffnen.

Kopieren Sie die Spalten aus der Excel-Datei, öffnen Sie Graph Pad Prism Five, öffnen Sie eine neue Projektdatei im Hauptmenü und wählen Sie unter neue Daten und Grafik das X Y-Format. Wählen Sie die Option Eingeben und Plotten eines einzelnen Punktes für jeden Wert für die Y-Achse und fügen Sie sie als X- und Y-Werte in das Datenblatt von Graph Pad Prism ein. Transponieren Sie die optische Dichte bei 405 Nanometer-Werten in ein Spaltenformat.

Im Datenblatt repräsentiert die erste Spalte die Konzentrationen als zugesetzten Liganden als X-Werte, während die Spalten rechts die Signalwerte der acht Titrationskurven als Y-Werte enthalten. Da ein halb-logarithmisches Diagramm gezeichnet wird, wird die letzte Zeile, die die Signale der ligandenfreien Kontrollen zählt, Konzentration null, gelöscht. Graph Pad Prism zeichnet das Diagramm, das im Grafikabschnitt zu sehen ist.

Für die X-Achse wird eine halb-logarithmische Skalierung gewählt. Die X-Achse zeigt die Signalwerte, die als OD-Werte bei 405 Nanometern gemessen wurden. Durch Doppelklick auf eines der Symbole können sie ausgewählt und durch einfache Form und Farbe markiert werden.

Die Titrationswerte für die Wildtyp-Form sind mit Kreisen in verschiedenen Rottönen hervorgehoben, während die Titrationssignale für die Mutantenform mit blauen Quadraten gekennzeichnet sind. Öffnen Sie das Analyse-Unterprogramm und wählen Sie unter X Y-Analyse die Option Nichtlineare Regression und drücken Sie die Schaltfläche Neu