Name: Implantation von Electrospun Vascular Grafts mit optimierter Struktur in einem Rattenmodell (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Erfahren Sie die Implantation von elektrogesponnenen Gefäßtransplantaten mit optimierter Struktur in einem Rattenmodell. Diese Methode ermöglicht die Evaluation der Langzeitperformance und Gewebeintegration.

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Diese Arbeit wurde von NSFC Projekte (81522023, 81530059, 91639113, 81772000, 81371699 und 81401534) finanziell unterstützt.

Die Verwendung von Versuchstieren wurde genehmigt durch das Tier Experimente ethischen Ausschuss der Nankai-Universität und durchgeführt in Übereinstimmung mit der Anleitung zur Pflege und Verwendung von Labortieren.
(1) die Herstellung von Electrospun PCL Grafts
Hinweis: Hier wurde eine Elektrospinnen-Technik eingesetzt, um vaskuläre Transplantate zu fabrizieren.
<ol><li>PCL-Lösungen von 25 Gew.-% bis 10 Gew.-%, durch Auflösen von PCL in einer Mischung aus Methanol und Chloroform, bzw. vorbereiten (1:5-Volumen-Verhältnis), bei Raumtemperatur (RT) für 12 h.</li>
	<li>Laden Sie die PCL-Lösung in ein 10 mL Glasspritze.</li>
	<li>Legen Sie die Spritze mit einer 21-G-Nadel.</li>
	<li>Die Sammlung Instrument den Edelstahl-Dorn (2 mm Durchmesser, 25 cm Länge) auflegen.</li>
	<li>Für dickere Fasern Transplantate zu verwenden, die PCL-Lösung von 25 Gew.-%, Arbeitsabstand von 17 cm von der Spitze der Nadel an Sammler, Durchfluss von 8 mL/h, und Spannung von 11 kV als die Elektrospinnen Parameter. Für dünnere Faser Transplantate, verwenden die PCL-Lösung von 10 Gew.-%, Arbeitsabstand von 20 cm von der Nadelspitze an Sammler, einer Durchflussmenge von 2 mL/h, und Spannung von 18 kV als die Elektrospinnen Parameter.</li>
	<li>Sicherstellen Sie, dass die gewonnenen Grafts im Vakuum über Nacht, das restliche Lösungsmittel entfernen platziert sind. Alle Instrumente vor dem Eingriff zu sterilisieren und aseptischen Technik im gesamten pflegen.</li>
	<li>Desinfizieren Sie vor der Implantation die Transplantate durch Eintauchen in 10 mL von 75 % Ethanol für 30 min und sie dann über Nacht mit UV-Licht aussetzen.</li>
	<li>Faser und Pore größenmessungen: Berechnung der durchschnittlichen Faserdurchmesser mit ImageJ-Software basierend auf Rasterelektronenmikroskopie (SEM) Bilder scannen.</li>
	<li>Mechanische Prüfung von Gerüsten:<ol>
<li>Geschnitten Sie die röhrenförmigen Gerüste in Abschnitte 3 mm in der Länge mit einer Rasierklinge. Messen Sie die Stärke von Gerüsten mit einem Mikrometer.</li>
		<li>Legen Sie die röhrenförmigen Gerüste auf einem Zugversuch Rechner mit einer Tragfähigkeit von 100 N.</li>
		<li>Klemmen Sie die Gerüste mit einer 1 mm zwischen Klemme Distanz und ziehen längs mit einer Rate von 10 mm/min bis zum Bruch. Messen Sie die Zugfestigkeit und Bruchdehnung ultimative. Berechnen des Elastizitätsmoduls aus der ersten linearen Region (bis zu 5 % Dehnung) der Spannungs-Dehnungs-Kurve.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(2) Bauchaorta Implantation Rattenmodell
Hinweis: Alle Materialien und Instrumente in der Chirurgie sind steril. Während der Operation stellen Sie sicher, dass der Betreiber trägt eine Gaze Maske und sterile Handschuhe um Infektionen zu vermeiden. Stellen Sie sicher, dass die Raumtemperatur bei 27-30 ° C, die tierischen Körper Temperatur gehalten wird. Richtlinien Sie lokale IACUC zur Analgesie.
<ol><li>Verwenden Sie männliche Sprague-Dawley Ratten mit einem Gewicht von 240-270 g als Empfänger der Gefäßprothese. Stellen Sie sicher, dass die Ratte 24 h vor der Operation gefastet hat. Die fastenden Ratten für 24 h soll leer der Kot im Darm-Trakt ausreichend, damit der Bediener Horizont erweitern.</li>
	<li>Die Ratte in den Nacken fassen und halten Sie ihren Kopf nach unten, Springe Nadel in die Bauchhöhle des Unterleibs. Induzieren Sie die Ratte für die Anästhesie mit Chloral Hydrate (330 mg/kg) durch eine intraperitoneale Injektion.</li>
	<li>Bestätigen Sie angemessene Anesthetization, indem sichergestellt wird, dass die Ratte Muskeln und stetige Atmung entspannt hat. Legen Sie die Ratte unter dem Operationsmikroskop in Rückenlage.</li>
	<li>Gelten Sie Vaseline Augenheilkunde Tierarzt Salbe auf die Augen, Trockenheit während der Narkose zu verhindern. Antikoagulation (100 UI/kg) Rute Vene Injektion vor der Operation mit heparinisierten physiologischer Kochsalzlösung (50 UI/mL) verwalten.</li>
	<li>Das Fell in der vorderen Bauchwand mit einer Rasierklinge rasieren Sie ab, und reinigen Sie die Haut mit Jod-Lösung und medizinischem Alkohollösung.</li>
	<li>Führen Sie einen Mittellinie Laparotomie Schnitt mit chirurgische Scheren und sorgen dafür, dass der Schnitt ca. 4-5 cm lang ist und dann setzen die Bauchhöhle.</li>
	<li>Einfahren Sie und wickeln Sie den Darm mit Gaze bevorzugt mit Salzlösung befeuchtet.</li>
	<li>Die Bauchaorta sorgfältig zu sezieren.</li>
	<li>Identifizieren Sie und verbinden Sie alle kleine Äste mit 9-0 Monofilament Nylon Nähte.</li>
	<li>Klemmen Sie den isolierten Abschnitt (bis zu 1 cm Länge) der Aorta mit zwei vaskulären Schellen. Die Aorta kann eingespannten für 20-30 Minuten bleiben.</li>
	<li>Transekt bauchschlagader zwischen zwei Klemmen mit Mikro-Schere, um die Anastomosen Websites zu erstellen.</li>
	<li>Spülen Sie die beiden Enden der Aorta mit heparinisierten Kochsalzlösung (50 UI/mL) um das restliche Blut zu entfernen.</li>
	<li>Die Adventitia mit Mikro-Schere abziehen.</li>
	<li>Anastomosieren Sie das Transplantat mit 2 mm Innendurchmesser und 1 cm in der Länge, die Ratte bauchschlagader mit einem 8er-Naht-Muster mit 9-0 Monofilament Nylon Nähte.</li>
	<li>Zuerst konstruieren Sie vier Anastomosen entsprechend der Reihenfolge der 9, 3, 12 und 06:00-Positionen an der proximalen Seite zu, dann anastomosieren Sie die Schnittkanten in 4 Maschen zwischen zwei Nähte. Nach Beendigung der proximalen Naht, Naht der distalen Seite nach der gleichen Methode. Hinweis: Jeder Stich ist erforderlich, um sicherzustellen, dass die systemeigene Seite leicht in das Transplantat eingebettet ist.</li>
	<li>Die distalen Klammer um das Blut zu fließen in das Transplantat zu ermöglichen, dann entfernen Sie die proximale Klemme.</li>
	<li>Drücken Sie die Fadenenden zu stoppen die Blutung ein steriler Wattebausch oder einem kleinen Gaze Schwamm. Drücken Sie für ca. 3 min bis Blutstillung.</li>
	<li>Den Darm in die Bauchhöhle zurück.</li>
	<li>Spülen Sie die Bauchhöhle mit warmer physiologischer Kochsalzlösung mit Gentamicin (320 U/mL).</li>
	<li>Die Bauchdecke mit einer 3: 0-Nylon-Naht in der Muskeln und Haut Schicht bzw. vernähen.</li>
	<li>Die Ratte in einem sauberen und trockenen Käfig legen Sie und ein Heizkissen unter den Käfig zu tierischen Körpertemperatur aufrechtzuerhalten; dann warten Sie, bis die Ratte aus der Narkose zu erholen. Kümmern Sie sich um das Tier, bis es ausreichend Bewusstsein zur Aufrechterhaltung der sternalen liegen wiedererlangt hat.</li>
	<li>Nachdem er das Bewusstsein wiedererlangt, setzen Sie die Ratte in einem einzigen Käfig mit Futter und Wasser. Gelten Sie Jod auf die Wunde zur Vorbeugung von Infektionen nach der Operation. Die Ratte, die Gesellschaft anderer Tiere zurück, bis es vollständig erholt hat.</li>
	<li>Ratten nach institutionellen Richtlinien zu vorgegebenen Zeitpunkten einschläfern.</li>
</ol>

<ol><li>Coombs, K. E., Leonard, A. T., Rush, M. N., Santistevan, D. A., Hedberg-Dirk, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+effect+of+material+stiffness+on+valvular+interstitial+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Isolated effect of material stiffness on valvular interstitial cell differentiation.</a> J Biomed Mater Res A. 105 (1), 51-61 (2017).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sandwich+tubular+scaffold+derived+from+chitosan+for+blood+vessel+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">A sandwich tubular scaffold derived from chitosan for blood vessel tissue engineering.</a> J Biomed Mater Res A. 77 (2), 277-284 (2006).</li>
<li>Thottappillil, N., Nair, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaffolds+in+vascular+regeneration%3A+current+status%5BTitle%5D)+AND+%22Vasc+Health+Risk+Manag%22%5BJournal%5D)">Scaffolds in vascular regeneration: current status.</a> Vasc Health Risk Manag. 11, 79-91 (2015).</li>
<li>Pektok, E., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19029464">Degradation and healing characteristics of small-diameter poly (e-caprolactone) vascular grafts in the rat systemic arterial circulation.</a> Circulation. 118 (24), 2563-2570 (2008).</li>
<li>Innocente, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paclitaxel-eluting+biodegradable+synthetic+vascular+prostheses%3A+a+step+towards+reduction+of+neointima+formation%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Paclitaxel-eluting biodegradable synthetic vascular prostheses: a step towards reduction of neointima formation?</a> Circulation. 120 (11 Suppl), S37-S45 (2009).</li>
<li>de Valence, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+of+bilayered+vascular+grafts+for+surgical+applicability+and+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Advantages of bilayered vascular grafts for surgical applicability and tissue regeneration.</a> Acta Biomater. 8 (11), 3914-3920 (2012).</li>
<li>Assmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acceleration+of+autologous+in+vivo+recellularization+of+decellularized+aortic+conduits+by+fibronectin+surface+coating%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Acceleration of autologous in vivo recellularization of decellularized aortic conduits by fibronectin surface coating.</a> Biomaterials. 34 (25), 6015-6026 (2013).</li>
<li>Hasan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+scaffolds+for+tissue+engineering+of+vascular+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Electrospun scaffolds for tissue engineering of vascular grafts.</a> Acta Biomater. 10 (1), 11-25 (2014).</li>
<li>Baker, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+to+improve+cell+infiltration+in+composite+fiber-aligned+electrospun+scaffolds+by+the+selective+removal+of+sacrificial+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The potential to improve cell infiltration in composite fiber-aligned electrospun scaffolds by the selective removal of sacrificial fibers.</a> Biomaterials. 29 (15), 2348-2358 (2008).</li>
<li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+macropores+in+electrospun+silk+fibroin+scaffolds+using+sacrificial+PEO-microparticles+to+enhance+cellular+infiltration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+A%22%5BJournal%5D)">Creation of macropores in electrospun silk fibroin scaffolds using sacrificial PEO-microparticles to enhance cellular infiltration.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 101 (12), 3474-3481 (2013).</li>
<li>Lee, B. L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Femtosecond+laser+ablation+enhances+cell+infiltration+into+three-dimensional+electrospun+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Femtosecond laser ablation enhances cell infiltration into three-dimensional electrospun scaffolds.</a> Acta Biomaterialia. 8 (7), 2648-2658 (2012).</li>
<li>Rnjak-Kovacina, J., Weiss, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+the+pore+size+of+electrospun+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+B+Rev%22%5BJournal%5D)">Increasing the pore size of electrospun scaffolds.</a> Tissue Eng Part B Rev. 17 (5), 365-372 (2011).</li>
<li>Zhong, S., Zhang, Y., Lim, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+large+pores+in+electrospun+nanofibrous+scaffolds+for+cellular+infiltration%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+B+Rev%22%5BJournal%5D)">Fabrication of large pores in electrospun nanofibrous scaffolds for cellular infiltration: a review.</a> Tissue Eng Part B Rev. 18 (2), 77-87 (2012).</li>
<li>Pham, Q. P., Sharma, U., Mikos, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+poly%28epsilon-caprolactone%29+microfiber+and+multilayer+nanofiber%2Fmicrofiber+scaffolds%3A+characterization+of+scaffolds+and+measurement+of+cellular+infiltration%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Electrospun poly(epsilon-caprolactone) microfiber and multilayer nanofiber/microfiber scaffolds: characterization of scaffolds and measurement of cellular infiltration.</a> Biomacromolecules. 7 (10), 2796-2805 (2006).</li>
<li>Rnjak-Kovacina, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tailoring+the+porosity+and+pore+size+of+electrospun+synthetic+human+elastin+scaffolds+for+dermal+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Tailoring the porosity and pore size of electrospun synthetic human elastin scaffolds for dermal tissue engineering.</a> Biomaterials. 32 (28), 6729-6736 (2011).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+thick+fibers+and+large+pores+of+electrospun+poly%28epsilon-caprolactone%29+vascular+grafts+on+macrophage+polarization+and+arterial+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The effect of thick fibers and large pores of electrospun poly(epsilon-caprolactone) vascular grafts on macrophage polarization and arterial regeneration.</a> Biomaterials. 35 (22), 5700-5710 (2014).</li>
<li>Hutcheson, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genesis+and+growth+of+extracellular-vesicle-derived+microcalcification+in+atherosclerotic+plaques%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mater%22%5BJournal%5D)">Genesis and growth of extracellular-vesicle-derived microcalcification in atherosclerotic plaques.</a> Nat Mater. 15 (3), 335-343 (2016).</li>
<li>Tara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Well-organized+neointima+of+large-pore+poly%28L-lactic+acid%29+vascular+graft+coated+with+poly%28L-lactic-co-epsilon-caprolactone%29+prevents+calcific+deposition+compared+to+small-pore+electrospun+poly%28L-lactic+acid%29+graft+in+a+mouse+aortic+implantation+model%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">Well-organized neointima of large-pore poly(L-lactic acid) vascular graft coated with poly(L-lactic-co-epsilon-caprolactone) prevents calcific deposition compared to small-pore electrospun poly(L-lactic acid) graft in a mouse aortic implantation model.</a> Atherosclerosis. 237 (2), 684-691 (2014).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine finanziellen widerstreitenden Interessen.

Zelle Infiltration ist entscheidend für die Erneuerung und Umbau der Gefäßprothese in Vivo16. Begrenzte Zelle eindringen bezieht sich oft auf die relativ kleinen Poren des Transplantats, die die Migration von Zellen in der Transplantat Wand behindern. Um dieses Problem zu beheben, entwickelten wir eine modifizierte Methode um Electrospun PCL vascular Grafts mit großen Porenstruktur vorzubereiten. Im einzelnen stiegen die Porengröße mit der Zunahme der Dicke Faser, die leicht von den Verar...

Vaskuläre Transplantate aus synthetischen Polymeren hergestellt werden allgemein in Klinik für die Therapie von Herz-Kreislauf-Erkrankungen (CVDs) eingesetzt. Leider, bei kleinem Durchmesser vascular Grafts (D < 6 mm) gibt es keine erfolgreiche Produkte aufgrund der niedrigen Durchgängigkeit, ausgelöst durch reduzierte Blut Strömungsgeschwindigkeit, führt oft zu Thrombose und der Intima-Hyperplasie Komplikationen-1.
Gewebe-Engineering bietet eine alternative Strategie zur langfristigen Durchgängigkeit und Homöostase basierend auf einem Gerüst-geführte vaskuläre Regeneration und Wiederaufbau zu realisieren. Im Detail, die Gefäßprothese als dreidimensionale Vorlage könnte bieten mechanische Unterstützung und strukturelle Führung während der Regeneration der Aderhaut und Einfluss zelluläre Funktionen, einschließlich der Zelladhäsion, Migration, Verbreitung, und Sekretion der extrazellulären Matrix2. Bisher wurden verschiedene synthetische Polymere für Anwendungen in der Aderhaut Technik bewertet. Unter dieser Polymere ist poly(ε-caprolactone) (PCL) Aufgrund guter Handy-Kompatibilität und langsamer Abbau von mehreren Monaten bis hin zu zwei Jahren3intensiv untersucht worden. In einer Ratte Aorta Modell4,5,6, PCL vaskulären Transplantate durch Elektrospinnen verarbeitet ausgestellt hervorragende strukturelle Integrität und Durchgängigkeit, sowie möglichst kontinuierlich erhöhten ZELLINVASION und Neovaskularisation in der Transplantat Wand für bis zu 6 Monaten. Jedoch unerwünschte Gewebe Umbau, einschließlich Regression von Zellen und Kapillaren und Verkalkung, auch beobachtet an längeren Zeitpunkten bis zu 18 Monaten.
Cellularization von der Gefäßprothese ist ein Schlüsselfaktor Bestimmung der Geweberegeneration und7umformt. Elektrospinnen, wurde als eine vielseitige Technik allgemein für die Zubereitung von vaskulären Grafts mit Nano-faserige Struktur8eingesetzt. Leider führt die relativ kleine Porenstruktur oft zu unzureichend Zelle eindringen in die Electrospun Gefäßprothese, die die nachfolgenden Geweberegeneration begrenzt. Um dieses Problem zu beheben, haben verschiedene Techniken versucht, Erhöhung der Porengröße und insgesamt Porosität, einschließlich das Salz/Polymer Auslaugung9,10, Änderung der Kollektor Apparat, Nachbehandlung durch Laserstrahlung11 , etc.. In der Tat ist die Struktur der Electrospun Transplantate (einschließlich Faserdurchmesser, Porengröße und Porosität) in engem Zusammenhang mit der Verarbeitung Bedingungen12,13. Während Elektrospinnen kann der Faserdurchmesser leicht durch Veränderung der Parameter, wie die Konzentration der Polymerlösung, Durchfluss, Spannung, usw.gesteuert werden. 14 , 15, und daher haben die Porengröße und Porosität entsprechend erhöht worden.
Wir berichteten vor kurzem eine modifizierte PCL Electrospun Transplantat mit makroporösen Struktur (Fasern mit Durchmesser von 5 bis 7 µm und Poren von 30-40 µm). In Vivo Implantation durch den Ersatz der bauchschlagader Ratte zeigten hohe Rate der Durchgängigkeit, sowie gute Endothelialization und glatten Muskulatur Regeneration bei 3 Monate nach der Operation16. Noch wichtiger ist, konnte keine negativen Gewebe Umbau einschließlich Verkalkung und Zelle Regression auch nach einem Jahr der Implantation beobachtet werden.

<table><tbody><tr><td>Poly(&epsilon;-caprolacton) (PCL)-Pellets (Mn=80.000)</td><td>Sigma</td><td>704067</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Tianjin Chemical Reagenz Company</td><td>1060</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol</td><td>Tianjin Chemical Reagenz Company</td><td>1083</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Tianjin Chemical Reagenz Company</td><td>A1007</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Tianjin Fengchuan Unternehmen</td><td>2296</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Alfa Aesar</td><td>A16046</td><td></td></tr><tr><td>Sprague Dawley Ratten</td><td>Labortierzentrum der Akademie für Militärmedizinische Wissenschaften</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Normale Kochsalzlösung</td><td>Hebei Tiancheng Pharmaunternehmen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chloralhydrat</td><td>Tianjin Ruijinte Chemieunternehmen</td><td>2223</td><td></td></tr><tr><td>Heparin-Natrium-Injektion</td><td>Tianjin Biochem Pharmaunternehmen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin Sulfate Injection</td><td>Jiangsu Lianshui Pharmaunternehmen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maus Anti-& Alpha;-SMA Primärantikörper</td><td>Abcam</td><td>ab7817</td><td></td></tr><tr><td>Maus Anti-Glatt MYH Primärantikörper</td><td>Abcam</td><td>ab683</td><td></td></tr><tr><td>Kaninchen Polyklonaler Anti-Ratten-Elastin-Antikörper</td><td>Abcam</td><td>ab23748</td><td></td></tr><tr><td>Kaninchen Anti-von Willebrand Faktor primärer Antikörper</td><td>Abcam</td><td>ab6994</td><td></td></tr><tr><td>Ziege Anti-Maus IgG (Alexa Fluor 488)</td><td>Invitrogen</td><td>ab150117</td><td></td></tr><tr><td>Ziege Anti-Kaninchen IgG (Alexa Fluor 488)</td><td>Invitrogen</td><td>ab150077</td><td></td></tr><tr><td>5% normales Ziegenserum</td><td>Zhongshan Golden Bridge</td><td>ZLI9022</td><td></td></tr><tr><td>Hämatoxylin und Eosin (H& E)</td><td>Beijing leagene biotech</td><td>DH0006</td><td></td></tr><tr><td>Masson's trichrome</td><td>Beijing leagene</td><td>biotech DC0032</td><td></td></tr><tr><td>Verhoeff-van Gieson (VVG)</td><td>Beijing leagene biotech</td><td>DC0059</td><td></td></tr><tr><td>Von Kossa</td><td>Beijing leagene biotech</td><td>DS0003</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische Nahtnadeln mit Faden, 3-0 Seide</td><td>Shanghai Jinhuan medical supplies company</td><td>G3002b</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische Nahtnadeln mit Faden, 9-0 Seide</td><td>Shanghai Jinhuan Medical Supplies Company</td><td>H901</td><td></td></tr></tbody></table>

implantation von electrospun vascular grafts mit optimierter struktur in einem rattenmodell

Implantation of Electrospun Vascular Grafts with Optimized Structure in a Rat Model

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um makroporöse PCL Gefäßprothese zu fabrizieren und beschreiben eine Auswertung Protokoll mithilfe von einem Rattenmodell der bauchschlagader Ersatz. Die Electrospun vascular Grafts besitzen oft relativ kleine Poren, die Zelle eindringen in die Transplantate zu begrenzen und behindert die Regeneration und Remodellierung der Neo-Arterien. In dieser Studie wurden PCL vascular Grafts mit dickeren Fasern (5 – 6 µm) und größere Poren (~ 30 µm) mit einer modifizierten Verarbeitungstechnik hergestellt. Das Langzeitverhalten des Transplantats wurde durch die Implantation in einem Rattenmodell Bauchaorta bewertet. Ultraschall-Analyse zeigte, dass die Transplantate patent ohne Aneurysma oder Stenose auch nach 12 Monaten der Implantation auftreten blieb. Makroporösen Struktur verbessert die Zelle Einwachsen und so gefördert Gewebe regeneriert nach 3 Monaten. Noch wichtiger ist, gab es keine Anzeichen von nachteiligen Umbau, z. B. Verkalkungen innerhalb der Transplantat Wand nach 12 Monaten. Electrospun PCL vascular Grafts mit modifizierten makroporösen Verarbeitung halten Sie daher, mögliche eine Arterie Ersatz für langfristige Implantation.

Die PCL-Transplantate wurden auf 3 Monate und 12 Monate postoperativ explantiert und analysiert durch histologische Standardtechniken für Hämatoxylin und Eosin (H &amp; E), Masson trichrome, Verhoeff-van Gieson (VVG), Von Kossa und Immunfluoreszenz-Färbung für α-SMA, MYH, vWF und Elastin. Die histologische Bilder wurden mit einem aufrechten Mikroskop und die Immunfluoreszenz-Bilder wurden mit einem Fluoreszenzpräparate Mikroskop.
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1...

Hier präsentieren wir Ihnen eine geänderte Elektrospinnen Methode PCL vascular Grafts mit dicken Fasern und große Poren zu fabrizieren, und beschreiben ein Protokoll, um die in Vivo -Leistung in einem Rattenmodell der bauchschlagader Ersatz zu bewerten.

Implantation von Electrospun Vascular Grafts mit optimierter Struktur in einem Rattenmodell

Here, we present a protocol to fabricate macroporous PCL vascular graft and describe an evaluation protocol by using a rat model of abdominal aorta ...

Das übergeordnete Ziel dieses chirurgischen Eingriffs ist es, ein elektrogesponnenes Gefäßtransplantat in eine Bauchschlagader der Ratte zu transplantieren und die langfristige Leistung des Transplantats zu bewerten. Diese Methode wurde von Professor Deling Kong und anderen Kollegen in unserer Gruppe etabliert und kann dazu beitragen, Schlüsselfragen bei der Untersuchung von elektrogesponnenen Gefäßtransplantaten zu beantworten, wie z. B. den Einfluss der Struktur und der Oberflächeneigenschaften des Transplantats auf die Gefäßregeneration. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine gute Wiederholbarkeit und eine hohe Überlebensrate der Tiere aufweist.Außerdem ist das Tiermodell einfach und kostengünstig zu handhaben. Diese Arbeit wird von unserem Kollegen, Dr. Wang, durchgeführt. Bereiten Sie zunächst die Polymerlösung vor, indem Sie Polycaprolacton in einer 1- bis 5-Mischung aus Methanol und Chloroform auflösen und 12 Stunden lang bei Raumtemperatur rühren.Laden Sie die Polymerlösung in eine 10-Milliliter-Glasspritze und rüsten Sie sie mit einer stumpfen 21-Gauge-Nadel aus. Setzen Sie dann einen Edelstahldorn auf das Sammelinstrument und stellen Sie sicher, dass es richtig geerdet ist. Stellen Sie den Arbeitsabstand von der Nadelspitze zum Sammler auf 17 Zentimeter für die 25%ige Polycaprolacton-Lösung ein.Stellen Sie dann die Durchflussmenge an der Spritzenpumpe auf acht Milliliter pro Stunde ein. Stellen Sie als Nächstes die Spannung am Netzteil auf 11 Kilovolt ein und beginnen Sie, den Dorn bei 40 U/min zu drehen, um elektrogesponnene Fasern für eine geeignete Faserverteilung zu sammeln. Wenn nun alles eingerichtet ist, schalten Sie das Netzteil und die Spritzenpumpe ein, um mit dem Sammeln der elektrogesponnenen Fasern zu beginnen.Schalten Sie nach 4,5 Minuten die Spritzenpumpe, das Netzteil und den Dornmotor aus. Lassen Sie das Transplantat eine Stunde lang in der Haube trocknen. Entfernen Sie dann das Transplantat mit absolutem Alkohol vom Dorn und legen Sie es über Nacht in ein Vakuum, um das restliche Lösungsmittel zu entfernen.Sterilisieren Sie das Transplantat mit Ethylenoxid und lassen Sie es in einer sterilen biologischen Containment-Haube trocknen. Erhalten Sie mit Standardtechniken REM-Bilder des Lumens der Transplantate und importieren Sie sie in ImageJ. Verwenden Sie die Messwerkzeuge, um sowohl den Faserdurchmesser als auch die durchschnittliche Porengröße in jedem Bild zu messen, um die Konsistenz zwischen den Proben zu gewährleisten.Um Informationen über die mechanischen Eigenschaften des Transplantatmaterials zu erhalten, schneidet man zunächst ein Rohrgerüst mit einer Rasierklinge in drei Millimeter große Abschnitte. Verwenden Sie dann Messschieber, um die Dicke der Gerüste zu messen. Laden Sie anschließend die Gerüste in die Spannzeuge einer Zugprüfmaschine, so dass zwischen den Spannzeugen ein Millimeter liegt.Halten Sie die Gerüste axial mit einer Geschwindigkeit von 10 Millimetern pro Minute, bis sie reißen. Achten Sie darauf, sowohl die Zugfestigkeit als auch die endgültige Bruchdehnung für die Proben aufzuzeichnen. Vor der Operation schnelle männliche Sprague-Dawley-Ratten mit einem Gewicht von 240 bis 270 Gramm für 24 Stunden vor der Implantationsoperation.Betäuben Sie die Ratte und bereiten Sie sie auf die Operation vor, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben. Bestätigen Sie eine angemessene Anästhesie, indem Sie sicherstellen, dass die Ratte entspannte Muskeln und eine gleichmäßige Atmung hat. Legen Sie die Ratte dann in Rückenlage unter das Operationsmikroskop.Führen Sie mit einer chirurgischen Schere einen vier bis fünf Zentimeter langen Laparotomieschnitt in der Mittellinie durch und legen Sie die Bauchhöhle frei. Ziehen Sie den Darm vorsichtig zurück und umwickeln Sie ihn mit Gaze, die mit Kochsalzlösung angefeuchtet wurde. Während Sie durch das Operationsmikroskop schauen, entfernen Sie die Bauchschlagader von den angrenzenden Geweben.Identifizieren und ligatieren Sie alle kleinen Äste der absteigenden Aorta mit 9-0 monofilen Nylonnähten. Verwenden Sie anschließend Gefäßklemmen, um einen bis zu einem Zentimeter isolierten Abschnitt der Aorta zu klemmen. Verwenden Sie dann eine Mikroschere, um die Bauchschlagader zwischen den Klemmen zu durchtrennen.Spülen Sie die beiden Enden der Aorta mit heparinisierter Kochsalzlösung, um das restliche Blut zu entfernen. Ziehen Sie die Adventitia der eingespannten Aorta mit einer Mikroschere ab. Platzieren Sie dann einen einen Zentimeter langen Abschnitt des sterilisierten Transplantats in der Lücke, die durch den entfernten Abschnitt der Aorta entsteht.Konstruieren Sie unter Verwendung von monofilen Nylonnähten 9-0 vier Anastomosen unter Verwendung eines Achter-Nahtmusters bei neun Uhr, drei Uhr, 12 Uhr und dann sechs Uhr auf der proximalen Seite. Konstruieren Sie dann die anderen vier Anastomosen zwischen den Nähten auf der proximalen Seite. Platzieren Sie das Transplantat senkrecht, um das gleiche Intervall zwischen den acht Stichen unter dem Operationsmikroskop zu zeigen.Wiederholen Sie nach Beendigung der proximalen Naht den Vorgang auf der distalen Seite. Sobald das Transplantat angebracht wurde, entfernen Sie die distale Klemme, damit das Blut in das Transplantat fließen kann, und entfernen Sie dann die proximale Klemme. Üben Sie mit einem sterilen Wattebausch Druck aus, um die beobachteten Blutungen an den Nahtpunkten zu stoppen.Drücken Sie etwa drei Minuten lang, bis die Blutstillung auftritt. Als nächstes führen Sie den Darm wieder in die Bauchhöhle zurück und spülen Sie die Bauchhöhle mit einer warmen physiologischen Kochsalzlösung, die Gentamicin enthält. Nähen Sie dann die Bauchdecke mit 3-0 Nylon-Naht in den Muskel- und Hautschichten zusammen.Verwenden Sie Jod nach der Operation nur einmal auf dem Schnitt. Bringen Sie die Ratte in die Gesellschaft anderer zurück, sobald sie sich vollständig erholt hat. Die Konzentration von Polycaprolacton in der Elektrospinnlösung kann sowohl den Faserdurchmesser als auch die mechanischen Eigenschaften der Transplantate beeinflussen.Die 25%ige Lösung mit höherer Konzentration erzeugt Gefäßtransplantate mit dickeren Fasern und größeren Poren als die 10%ige Lösung. Nach drei Monaten in vivo zeigte die histologische Färbung eine Schicht neuen Gewebes, die sich auf dem Lumen des Transplantats gebildet hatte, und eine signifikante Menge an Kollagenablagerungen im Transplantat selbst. Diese neue Gewebeschicht ist mit Endothelzellen ausgekleidet, unter denen sich eine Schicht aus glatten Muskelzellen und zirkumferentiell ausgerichtetem Elastin befindet.Nach 12 Monaten in vivo schien das neue Gewebe gut integriert zu sein, und die endothelialen und glatten Muskelschichten blieben intakt. Einmal gemeistert, kann diese Technik in ein bis zwei Stunden abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Nach diesem Verfahren können andere Messungen wie Farbdoppler-Ultraschall durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z. B. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die elektrogesponnenen Gefäßtransplantate hergestellt werden, und ihre In-vivo-Leistung in einem Modell zum Ersatz der Baucharterie an der Ratte bewerten.

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Biology

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