Implantation von Electrospun Vascular Grafts mit optimierter Struktur in einem Rattenmodell

Das übergeordnete Ziel dieses chirurgischen Eingriffs ist es, ein elektrogesponnenes Gefäßtransplantat in eine Bauchschlagader der Ratte zu transplantieren und die langfristige Leistung des Transplantats zu bewerten. Diese Methode wurde von Professor Deling Kong und anderen Kollegen in unserer Gruppe etabliert und kann dazu beitragen, Schlüsselfragen bei der Untersuchung von elektrogesponnenen Gefäßtransplantaten zu beantworten, wie z. B. den Einfluss der Struktur und der Oberflächeneigenschaften des Transplantats auf die Gefäßregeneration. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine gute Wiederholbarkeit und eine hohe Überlebensrate der Tiere aufweist.

Außerdem ist das Tiermodell einfach und kostengünstig zu handhaben. Diese Arbeit wird von unserem Kollegen, Dr. Wang, durchgeführt. Bereiten Sie zunächst die Polymerlösung vor, indem Sie Polycaprolacton in einer 1- bis 5-Mischung aus Methanol und Chloroform auflösen und 12 Stunden lang bei Raumtemperatur rühren.

Laden Sie die Polymerlösung in eine 10-Milliliter-Glasspritze und rüsten Sie sie mit einer stumpfen 21-Gauge-Nadel aus. Setzen Sie dann einen Edelstahldorn auf das Sammelinstrument und stellen Sie sicher, dass es richtig geerdet ist. Stellen Sie den Arbeitsabstand von der Nadelspitze zum Sammler auf 17 Zentimeter für die 25%ige Polycaprolacton-Lösung ein.

Stellen Sie dann die Durchflussmenge an der Spritzenpumpe auf acht Milliliter pro Stunde ein. Stellen Sie als Nächstes die Spannung am Netzteil auf 11 Kilovolt ein und beginnen Sie, den Dorn bei 40 U/min zu drehen, um elektrogesponnene Fasern für eine geeignete Faserverteilung zu sammeln. Wenn nun alles eingerichtet ist, schalten Sie das Netzteil und die Spritzenpumpe ein, um mit dem Sammeln der elektrogesponnenen Fasern zu beginnen.

Schalten Sie nach 4,5 Minuten die Spritzenpumpe, das Netzteil und den Dornmotor aus. Lassen Sie das Transplantat eine Stunde lang in der Haube trocknen. Entfernen Sie dann das Transplantat mit absolutem Alkohol vom Dorn und legen Sie es über Nacht in ein Vakuum, um das restliche Lösungsmittel zu entfernen.

Sterilisieren Sie das Transplantat mit Ethylenoxid und lassen Sie es in einer sterilen biologischen Containment-Haube trocknen. Erhalten Sie mit Standardtechniken REM-Bilder des Lumens der Transplantate und importieren Sie sie in ImageJ. Verwenden Sie die Messwerkzeuge, um sowohl den Faserdurchmesser als auch die durchschnittliche Porengröße in jedem Bild zu messen, um die Konsistenz zwischen den Proben zu gewährleisten.

Um Informationen über die mechanischen Eigenschaften des Transplantatmaterials zu erhalten, schneidet man zunächst ein Rohrgerüst mit einer Rasierklinge in drei Millimeter große Abschnitte. Verwenden Sie dann Messschieber, um die Dicke der Gerüste zu messen. Laden Sie anschließend die Gerüste in die Spannzeuge einer Zugprüfmaschine, so dass zwischen den Spannzeugen ein Millimeter liegt.

Halten Sie die Gerüste axial mit einer Geschwindigkeit von 10 Millimetern pro Minute, bis sie reißen. Achten Sie darauf, sowohl die Zugfestigkeit als auch die endgültige Bruchdehnung für die Proben aufzuzeichnen. Vor der Operation schnelle männliche Sprague-Dawley-Ratten mit einem Gewicht von 240 bis 270 Gramm für 24 Stunden vor der Implantationsoperation.

Betäuben Sie die Ratte und bereiten Sie sie auf die Operation vor, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben. Bestätigen Sie eine angemessene Anästhesie, indem Sie sicherstellen, dass die Ratte entspannte Muskeln und eine gleichmäßige Atmung hat. Legen Sie die Ratte dann in Rückenlage unter das Operationsmikroskop.

Führen Sie mit einer chirurgischen Schere einen vier bis fünf Zentimeter langen Laparotomieschnitt in der Mittellinie durch und legen Sie die Bauchhöhle frei. Ziehen Sie den Darm vorsichtig zurück und umwickeln Sie ihn mit Gaze, die mit Kochsalzlösung angefeuchtet wurde. Während Sie durch das Operationsmikroskop schauen, entfernen Sie die Bauchschlagader von den angrenzenden Geweben.

Identifizieren und ligatieren Sie alle kleinen Äste der absteigenden Aorta mit 9-0 monofilen Nylonnähten. Verwenden Sie anschließend Gefäßklemmen, um einen bis zu einem Zentimeter isolierten Abschnitt der Aorta zu klemmen. Verwenden Sie dann eine Mikroschere, um die Bauchschlagader zwischen den Klemmen zu durchtrennen.

Spülen Sie die beiden Enden der Aorta mit heparinisierter Kochsalzlösung, um das restliche Blut zu entfernen. Ziehen Sie die Adventitia der eingespannten Aorta mit einer Mikroschere ab. Platzieren Sie dann einen einen Zentimeter langen Abschnitt des sterilisierten Transplantats in der Lücke, die durch den entfernten Abschnitt der Aorta entsteht.

Konstruieren Sie unter Verwendung von monofilen Nylonnähten 9-0 vier Anastomosen unter Verwendung eines Achter-Nahtmusters bei neun Uhr, drei Uhr, 12 Uhr und dann sechs Uhr auf der proximalen Seite. Konstruieren Sie dann die anderen vier Anastomosen zwischen den Nähten auf der proximalen Seite. Platzieren Sie das Transplantat senkrecht, um das gleiche Intervall zwischen den acht Stichen unter dem Operationsmikroskop zu zeigen.

Wiederholen Sie nach Beendigung der proximalen Naht den Vorgang auf der distalen Seite. Sobald das Transplantat angebracht wurde, entfernen Sie die distale Klemme, damit das Blut in das Transplantat fließen kann, und entfernen Sie dann die proximale Klemme. Üben Sie mit einem sterilen Wattebausch Druck aus, um die beobachteten Blutungen an den Nahtpunkten zu stoppen.

Drücken Sie etwa drei Minuten lang, bis die Blutstillung auftritt. Als nächstes führen Sie den Darm wieder in die Bauchhöhle zurück und spülen Sie die Bauchhöhle mit einer warmen physiologischen Kochsalzlösung, die Gentamicin enthält. Nähen Sie dann die Bauchdecke mit 3-0 Nylon-Naht in den Muskel- und Hautschichten zusammen.

Verwenden Sie Jod nach der Operation nur einmal auf dem Schnitt. Bringen Sie die Ratte in die Gesellschaft anderer zurück, sobald sie sich vollständig erholt hat. Die Konzentration von Polycaprolacton in der Elektrospinnlösung kann sowohl den Faserdurchmesser als auch die mechanischen Eigenschaften der Transplantate beeinflussen.

Die 25%ige Lösung mit höherer Konzentration erzeugt Gefäßtransplantate mit dickeren Fasern und größeren Poren als die 10%ige Lösung. Nach drei Monaten in vivo zeigte die histologische Färbung eine Schicht neuen Gewebes, die sich auf dem Lumen des Transplantats gebildet hatte, und eine signifikante Menge an Kollagenablagerungen im Transplantat selbst. Diese neue Gewebeschicht ist mit Endothelzellen ausgekleidet, unter denen sich eine Schicht aus glatten Muskelzellen und zirkumferentiell ausgerichtetem Elastin befindet.

Nach 12 Monaten in vivo schien das neue Gewebe gut integriert zu sein, und die endothelialen und glatten Muskelschichten blieben intakt. Einmal gemeistert, kann diese Technik in ein bis zwei Stunden abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Nach diesem Verfahren können andere Messungen wie Farbdoppler-Ultraschall durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z. B. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die elektrogesponnenen Gefäßtransplantate hergestellt werden, und ihre In-vivo-Leistung in einem Modell zum Ersatz der Baucharterie an der Ratte bewerten.