Optogenetische Mitnahme von Hippocampal Theta Schwingungen im Verhalten der Mäuse

Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Neurophysiologie zu beantworten, wie z.B. die kausale Rolle der Theta-Oszillation bei der speziellen Navigation und den damit verbundenen Verhaltensweisen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine Echtzeitkontrolle über die Häufigkeit und Regelmäßigkeit von Theta-Oszillationen im Hippocampus bei sich verhaltenden Mäusen ermöglicht. Das Verfahren wird von Dr. Franziska Bender, einer ehemaligen Doktorandin in meinem Labor, vorgeführt.

Beginnen Sie mit der vollständig betäubten Maus, die im stereotaktischen Rahmen befestigt ist. Bohren Sie ein Loch über dem medialen Septum. Tauchen Sie die Spitze der Injektionsnadel in ein Tröpfchen Virus auf einem Stück Paraffinfilm und ziehen Sie das Virus vorsichtig mit etwa 500 Nanolitern pro Minute auf, während Sie den Füllstand der Flüssigkeit beobachten.

Um zu verhindern, dass Luft in die Injektionsnadel eindringt, stoppen Sie die Entnahme, bevor das Virus vollständig aufgenommen wird. Reinige die Nadel mit einem Papiertaschentuch. Vergewissern Sie sich, dass das Virus und das Öl durch eine Luftblase getrennt sind, und markieren Sie den Virusgehalt auf dem Röhrchen.

Positionieren Sie die Nadel über dem Kraniotomie und führen Sie sie an der ersten Injektionsstelle langsam in das Gehirn ein. Injizieren Sie 450 Nanoliter des Virus mit einer Geschwindigkeit von 100 bis 150 Nanolitern pro Minute. Warten Sie nach der Injektion 10 Minuten.

Bewegen Sie die Nadel nach 10 Minuten vorsichtig 0,1 Millimeter nach oben und warten Sie weitere fünf Minuten. Verwenden Sie einen Mikroabisolierer, um 125 Mikrometer Mantel von einer Multimode-Glasfaser abzuisolieren, während die Faser noch an der Faserspule befestigt ist. Schneiden Sie die Faser dann mit einem Diamantmesser auf eine Länge von etwa zwei bis drei Zentimetern ab.

Führen Sie die optische Faser in eine Zirkonoxid-Keramik-Stabzwinge mit einem Innendurchmesser von 126 Mikrometern ein. Etwa 0,5 bis 1 Millimeter der Faser sollten aus der konvexen Seite der Ferrule herausragen. Tragen Sie mit einer Nadel einen Tropfen Epoxidkleber auf beide Enden der Zwinge auf, jedoch nicht auf die Seiten der Zwinge.

Verwenden Sie nach dem Trocknen einen Diamant-Läppfaser-Polierfilm mit drei Mikron Körnung, um die konvexe Seite der Ferrule zu polieren. Um das Wolframdraht-Array vorzubereiten, kleben Sie zunächst mehrere 100-Mikron-Silica-Rohrführungen auf die klebrige Seite eines Stücks Klebeband. Fädeln Sie dann mit einer Pinzette formvar-isolierte 45-Mikron-Wolframdrähte durch die Führungsrohre.

Verwenden Sie dann ein Skalpell, um die Isolierung von beiden Enden von sechs emaillierten, isolierten feinen Kupferbindedrähten von etwa fünf Millimetern Länge zu entfernen. Lösen Sie dann die Isolierung an beiden Enden eines Erdungskabels von etwa zwei bis drei Zentimetern Länge ab. Löten Sie jeden abisolierten Draht an die Nanosteckerstifte.

Verbinden Sie jeden Bonddraht mit einem Tropfen leitfähiger Silberfarbe mit einem Wolframdraht. Tragen Sie nach dem Trocknen eine kleine Menge Zement auf, um die Kupferdrähte zu bedecken. Vermeiden Sie das Auftragen von Zement auf den oberen Teil des Nanokonnektors.

Nachdem Sie den Zement mindestens 30 Minuten lang trocknen gelassen haben, schneiden Sie die Wolframdrähte mit einer stumpfen Edelstahlschere in einem Winkel von fünf bis 20 Grad ab. Beginnen Sie damit, vier Löcher mit einem Durchmesser von 0,8 mm in den sauberen Schädel des betäubten Tieres zu bohren. Bohren Sie zwei Löcher rostral zur koronalen Naht und zwei oberhalb des Kleinhirns.

Platzieren Sie anschließend Knochenschrauben aus Edelstahl zur Erdung und Stabilisierung des Implantats. Positionieren Sie die Erdungsschraube, die mit einem Kupferdraht verbunden ist, über dem Kleinhirn. Decken Sie die Schraube vollständig mit Zement ab, um Muskelartefakte während der elektrophysiologischen Aufzeichnungen zu vermeiden.

Baue einen Cment Ring, der alle Schrauben verbindet. Führen Sie eine Kraniotomie oberhalb der Implantationsstelle durch und tragen Sie dann etwa einen Mikroliter sterile Kochsalzlösung auf die Oberfläche des Hirngewebes auf. Verwenden Sie die Stereotax, um das Drahtarray langsam in die Kraniotomie abzusenken.

Tragen Sie dann etwa fünf Mikroliter warmes flüssiges Wachs über der Implantationsstelle auf, um das Hirngewebe zu schützen. Tragen Sie Zement um das Drahtgitter auf und bedecken Sie den Schädel mit Zement. Tragen Sie einen Tropfen Flussmittel auf den vorgelöteten Erdungsdraht oder den vorgelöteten Draht auf, der mit der Erdungsschraube verbunden ist, und schmelzen Sie die Drähte mit einer Lötmaschine zusammen.

Decken Sie zum Schluss das gesamte Erdungskabel mit Zement ab. Überprüfen Sie die Lichtleistung des Patchkabels. Wenn die Übertragungsrate der implantierten Faser 50 % betrug, stellen Sie sicher, dass die Lichtleistung an der Spitze des Patchkabels 20 Milliwatt beträgt.

Verbinden Sie den Vorverstärker der Kopfstufe mit dem implantierten Stecker und verbinden Sie das Glasfaser-Patchkabel mit der implantierten Hippocampusfaser für die optogenetische Stimulation. Zeichnen Sie das Grundlinienverhalten für eine Dauer auf, die für die zu messenden Parameter geeignet ist. Öffnen Sie die Software, um den Stimulusgenerator zu steuern.

Klicken Sie auf Datei, öffnen Sie und wählen Sie die gewünschte Protokolldatei aus. Klicken Sie auf Herunterladen und starten, um die Lichtstimulation zu starten. Beobachte die Kontrolle des Theta-Rhythmus durch die Lichtimpulse.

Hier ist das lokale Feldpotential des Hippocampus während spontaner Theta-Oszillationen zu sehen. Beachten Sie die Gamma-Hüllkurven, ein Indikator für den physiologischen Theta-Rhythmus. Hier ist das lokale Feldpotential des Hippocampus bei sieben Hertz während des optogenetischen Entrainments zu sehen.

Blaue Streifen zeigen die Zeitfenster der Lichtanwendung an. Beachten Sie die Phasenrückstellung durch den Lichtimpuls, der hier durch einen Pfeil gekennzeichnet ist. Das lokale Feldpotential des Hippocampus bei 10 Hertz spiegelt optogenetisches Entrainment wider.

Beachten Sie, dass die phasengekoppelte Gamma-Hüllkurve und die Phasenumkehr zwischen Stratham orian und Stratum radiatum auch während des Entrainments beibehalten werden. Einmal gemeistert, kann diese Technik in vier Stunden Experimentierzeit plus sechs Wochen für die Virusexpression durchgeführt werden. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, eine effiziente Virustransduktion zu gewährleisten.

Verbinden Sie das Glasfaserimplantat ordnungsgemäß mit dem Patchkabel und erhalten Sie eine gute Qualität der spontanen Theta-Oszillationen mit lokalem Feldpotential.