Quantifizierung der Lipid-Fülle und Bewertung von Lipid Verteilung in Caenorhabditis Elegans von Nil-rot und Öl rot O Färbung

Das übergeordnete Ziel dieser Färbemethoden ist es, die intrazelluläre Lipidhäufigkeit zu quantifizieren und die Lipidverteilung zwischen verschiedenen Geweben zu bewerten. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Fettstoffwechsel zu beantworten, z. B. wie Lipide genetisch und biochemisch reguliert werden und welche Krankheitszustände dadurch die Lipidhomöostase regulieren. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie relativ einfach und kostengünstig durchzuführen ist.

Um die Nilrot-Lipidfärbung durchzuführen, plättieren Sie Würmer auf Nematodenwachstumsmedium oder NGM, die mit spätem log OP50 E.coli besiedelt sind, und züchten Sie die Würmer bei 20 Grad Celsius bis zum frühen L4-Stadium. Waschen Sie die Würmer mit einem Millimeter PBST-Lösung und geben Sie die Wurmsuspension in ein 1,5-Milliliter-Mikrofuge-Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Würmer eine Minute lang bei der 560-fachen Schwerkraft.

Entfernen Sie dann den Überstand und wiederholen Sie die PBST-Wäsche, bis die E.coli aus der Suspension entfernt sind. Geben Sie anschließend 100 Mikroliter 40 % Isopropanol oder 60 % für die ORO-Färbung in das Wurmpellet und inkubieren Sie die Probe drei Minuten lang bei Raumtemperatur. Die Zugabe von Isopropanol ist entscheidend für die richtige Permeabilisierung der Würmer vor der Färbung.

Zentrifugieren Sie die Würmer eine Minute lang bei der 560-fachen Schwerkraft und entfernen Sie den Überstand, ohne das Wurmpellet zu beschädigen. Es ist wichtig, die Lichteinwirkung während der Zentrifugationsschritte zu minimieren. Geben Sie nun im Dunkeln 600 Mikroliter der zuvor vorbereiteten NR-Arbeitslösung zu jeder Probe.

Drehen Sie die Röhrchen dreimal um und mischen Sie die Würmer und die Lösung vollständig. Dann inkubieren Sie die Probe zwei Stunden lang im Dunkeln bei Raumtemperatur. Nach der Inkubation die Würmer zentrifugieren und den Überstand entfernen.

Fügen Sie dann 600 Mikroliter PBST hinzu und inkubieren Sie die Proben 30 Minuten lang im Dunkeln, um den überschüssigen NR-Fleck zu entfernen. Nachdem die Proben erneut wie zuvor gedreht wurden, werden alle bis auf etwa 50 Mikroliter Überstand entfernt und das Wurmpellet in der restlichen Lösung wieder suspendiert. Um Objektträger für die Bildgebung vorzubereiten, pipettieren Sie fünf Mikroliter Wurmsuspension auf einen Objektträger und tragen Sie vorsichtig ein Deckglas auf, um Luftblasen nicht einzuschließen.

Verwenden Sie den FITC-GFP-Kanal, um NR-gefärbte Würmer abzubilden, und probieren Sie verschiedene Belichtungszeiten aus, um die Würmer mit fünffacher Vergrößerung abzubilden, um mehrere Tiere pro Sichtfeld zu erfassen. Wechseln Sie dann zur 10-fachen Vergrößerung für eine bessere Quantifizierung einzelner Würmer. Um die Bilder zu quantifizieren, laden Sie die Mikrographen auf ImageJ hoch.

Passen Sie im Bild-Pulldown-Menü die Helligkeit und den Kontrast des Bilddecks an und übertragen Sie die Änderungen auf alle Bilder, indem Sie auf Anwenden klicken. Verwenden Sie das Polygonauswahlwerkzeug, um jeden abgebildeten Wurm abzugrenzen, und verwenden Sie im Pulldown-Menü "Analyse" die Funktion "Messen", um die von NR emittierte Fluoreszenzintensität zu qualifizieren. Messen Sie für jedes Bild fünf Hintergrundpositionen, und berechnen Sie die durchschnittliche Hintergrundfluoreszenzintensität. Geben Sie 600 Mikroliter Oil Red O- oder ORO-Arbeitslösung zu jeder Probe und drehen Sie das Röhrchen dreimal um, um die Würmer und das ORO gut zu mischen.

Drehen Sie die Proben zwei Stunden lang bei 30 U/min und RT. Die Proben werden eine Minute lang bei der 560-fachen Schwerkraft zentrifugiert und der gesamte Überstand mit Ausnahme von 100 Mikrolitern abgesaugt. Verwenden Sie dann 600 Mikroliter PBST, um die Proben zu resuspendieren, und drehen Sie die Röhrchen 30 Minuten lang bei 30 U/min, um überschüssige ORO-Flecken zu entfernen.

Um die Position der Keimbahn der Tiere in den Darmzellen besser zu unterscheiden, färben Sie die Zellkerne, indem Sie je einen Mikroliter DAPI pro Milliliter ORO-Arbeitslösung hinzufügen. Um dann Objektträger für die Bildgebung vorzubereiten, resuspendieren Sie die Würmer und den restlichen Überstand und mischen Sie die Lösung gut. Geben Sie fünf Mikroliter Wurmsuspension auf einen Objektträger und bringen Sie vorsichtig ein Deckglas an, um darauf zu achten, dass sich keine Luftblasen bilden.

Um die mit ORO gefärbten Würmer abzubilden, verwenden Sie eine farbfähige Kamera mit fünffacher Vergrößerung, um mehrere Würmer in einem Sichtfeld abzubilden. Wechseln Sie dann zur 10-fachen Vergrößerung, um einzelne Würmer besser untersuchen zu können. Nachdem Sie die Bilder auf ImageJ hochgeladen und ein Bilddeck gemäß dem Textprotokoll erstellt haben, kategorisieren Sie die Bilder nach der Lipidakkumulation im gesamten Körper des Tieres oder in bestimmten Geweben.

SKN-1 teilt die Homologie mit Nrf2 aus Säugetieren und vermittelt nachweislich die Fettsäureoxidation. Diese Abbildung zeigt aktivierte SKN-1-Tiere, die Bedingungen ausgesetzt waren, die zu einem Anstieg der Lipidspiegel führten. Wie auf diesen Bildern zu sehen ist, ist die NR-Fluoreszenz, die mit dem FITC-GFP-Kanal erfasst wurde, entlang des Darms ausgeprägt, aber im Kopf-, Schwanz- und Darmlumen schwächer.

Während es einfach ist, die Würmer nach dem Vorhandensein oder Fehlen von altersabhängiger somatischer Erschöpfung von Fett oder ASDF zu kategorisieren, kann es schwierig sein, Tiere mit intermediärem Fettverlust zu identifizieren. Im Vergleich zu Nicht-ASDF-Tieren, die im ganzen Körper eine hellrote Färbung mit wenigen durchscheinenden Bereichen aufweisen, zeigen ASDF-Würmer einen spürbaren Fettabbau in den Darmzellen. Tiere, die sich im Prozess der Entwicklung von ASDF befinden, zeigen oft durchscheinende Stellen, an denen der größte Teil des Fettabbaus schließlich stattfindet.

Darüber hinaus können ASDF-Würmer immer noch hellrote Färbungen im Kopf- und Schwanzbereich aufweisen, da der Phänotyp nicht durch einen vollständigen somatischen Fettabbau definiert wird, sondern durch einen ausgeprägten Fettabbau im Vergleich zu nicht gealterten Tieren. Einmal gemeistert, kann diese Technik in drei Stunden plus Bildgebungszeit durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, Würmer nicht länger als 30 Minuten vor dem Färben zu waschen und zu permeabilisieren.

Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie die CARS-Mikroskopie durchgeführt werden, um die Art der Lipidspezies zu vergleichen, die jede Technologie identifiziert, und um zu bestimmen, welche Methode für bestimmte Arten von Fragen besser geeignet ist. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Lipide quantifiziert und die Lipidverteilung in den Würmern mithilfe der Nilrot- und Ölrot-O-Färbung bewertet, gefolgt von der ImageJ-Mikroskopieanalyse.