Name: Quantifizierung der Lipid-Fülle und Bewertung von Lipid Verteilung in Caenorhabditis Elegans von Nil-rot und Öl rot O Färbung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: Lernen Sie die Quantifizierung von Lipiden und die Bewertung ihrer Verteilung in Caenorhabditis elegans mittels Nile-red- und Oil-red-O-Färbung. Diese einfachen Methoden ermöglichen Einblicke in den Lipidstoffwechsel.

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Diese Arbeit wurde ermöglicht durch den NIH-Zuschuss: R01GM109028 (S.P.C.)

(1) Nil rot (NR) Färbung der Lipide
<ol><li>Vorbereitung von 5 mg/mL NR Stammlösung<ol>
<li>Fügen Sie 100 mg NR Pulver in einen 500-mL-Flasche hinzu 200 mL 100 % Aceton.</li>
		<li>Decken Sie die Flasche mit Alufolie zu jeder Lichteinfall zu vermeiden.</li>
		<li>Vor dem Gebrauch rühren Sie die Lösung für 2 h im Dunkeln.</li>
		<li>Für langfristigen Gebrauch speichern Sie NR Vorratslösung in einer gut verschlossenen Flasche ohne jede Belichtung. NR-Stammlösung nach Forschungsbedarf zu skalieren. Sicherstellen Sie, dass die gleichen Stammlösung über NR-Färbung Experimente verwendet wird, um einheitliche Färbung und imaging Ergebnisse erhalten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vorbereitung der Arbeitslösung NR<ol>
<li>Fügen Sie für jeden 1 mL 40 % Isopropanol (V/V) 6 µL der Stammlösung NR.</li>
		<li>Jede Probe 600 µL Arbeitslösung NR vorbereiten. Hinweis: Stellen Sie frische NR arbeiten Lösung direkt vor der Färbung. NR-Stammlösung Bedürfnissen verwenden Sie eine 15 mL oder 50 mL absolvierte konischem Rohr.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vorbereitung von Würmern NR Lipid Färbung<ol>
<li>Wachsen Sie Würmer zu früh L4 bei 20 ° C auf Nematoden Wachstumsmedium (NGM) mit späten Log OP50 E. Coliausgesät.</li>
		<li>Waschen Sie die Würmer aus der Platte mit 1 mL 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung + 0,01 % Triton x-100 (PBST) Lösung und die Wurm-Suspension in einem 1,5 mL Microfuge Rohr.</li>
		<li>Zentrifuge aus Aussetzung entfernen die Würmer bei 560 X g für 1 min. die überstand und wiederholen Sie diesen Schritt bis E. Coli deaktiviert ist.</li>
		<li>Das Wurm-Pellet 100 µL 40 % Isopropanol hinzu und bei Raumtemperatur 3 min inkubieren.</li>
		<li>Die Würmer bei 560 X g für 1 min Zentrifugieren und Entfernen des Überstands ohne Unterbrechung der Wurm Pellet. Hinweis: Nutzung höhere Volumina der PBST die Würmer von den Tellern zu waschen, wenn mit größeren Platten oder Färbung mehr Würmer pro Platte. Waschen Sie die Würmer in PBST mehr als 15 min vor der Fixierung der Probe nicht. Führen Sie weitere Waschungen, wenn der Überstand der Bakterien nicht deaktiviert ist. Führen Sie die Inkubation in 40 % Isopropanol mit einem Nutator oder Wippe. Immer überwachen Sie die Rohre, um sicherzustellen, dass vollständige Probe Erregung stattfindet.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lipid Färbung mit NR<ol>
<li>Fügen Sie in der Dunkelheit 600 µL Arbeitslösung NR jeder Probe hinzu. Invertieren Sie die Rohre dreimal und mischen Sie die Würmer in NR-Lösung vollständig zu.</li>
		<li>Drehen Sie die Probe im Dunkeln bei Raumtemperatur für 2 h.</li>
		<li>Nach der Inkubation die Würmer bei 560 X g für 1 min Zentrifugieren und den Überstand zu entfernen.</li>
		<li>Fügen Sie 600 µL PBST und inkubieren Sie die Proben in der Dunkelheit für 30 min um überschüssige NR Fleck zu entfernen.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Proben bei 560 X g für 1 min und entfernen Sie alle ca. 50 µL überstand. Hinweis: NR Inkubation erfordert keine Unruhe. Absetzen von Würmern ist üblich bei diesem Schritt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Erstellung von Folien für Mikroskop Bildgebung<ol>
<li>Das Wurm-Pellet im restlichen überstand aufzuwirbeln.</li>
		<li>5 µL der Wurm Aussetzung auf einen Objektträger legen Sie und einem Deckgläschen auf sorgfältig einfangen von Luftblasen zu vermeiden.</li>
		<li>Das Deckglas mit Nagellack vor imaging Würmer zu versiegeln.</li>
		<li>Bereiten Sie nur ein Paare Folien zu einem Zeitpunkt. Dadurch wird sichergestellt, dass NR Bildgebung über Proben konstant bleibt. Die Qualität der NR-gefärbten Bilder verringert sich nach 6 h. diskrete Lipid Tröpfchen schwer sind zu beobachten und Hintergrundfluoreszenz erhöht, die stört NR Signalerkennung.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bildgebung des NR-gefärbten Würmer<ol>
<li>Bild der Würmer bei 5 X Vergrößerung, mehrere Tiere pro Gesichtsfeld zu erfassen.</li>
		<li>Wechseln Sie zu 10-facher Vergrößerung für bessere Quantifizierung der einzelnen Würmer.</li>
		<li>Verwenden Sie FITC/GLP-Kanal Bild NR-gefärbten Würmer und versuchen unterschiedliche Belichtungszeiten zu bestimmen, die optimale Bedingungen für die Quantifizierung.</li>
		<li>Speichern von Dateien im TIF-Format, um Datenverlust durch Kompression zu vermeiden. Hinweis: Typische Belichtungszeiten reichen von 100-1000 Frau, die eine optimale Belichtungszeit, verwenden Sie es für alle Proben um zu bildgebenden Konsistenz zu gewährleisten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>NR Färbung Bild Quantifizierung<ol>
<li>Hochladen Sie Mikrographen auf ImageJ. Verwenden Sie im Pulldown-Menü Plugins die Bio-Formate-Funktion, wenn die Image-Datei nicht erkannt wird.</li>
		<li>Verwenden Sie in der Bild-Pull-Down-Menü unter dem Stapel-Funktion Bilder-Stack, um einem Bildstapel zu erstellen, wenn mehrere Aufnahmen verglichen werden.</li>
		<li>In der gleichen Pull-Down-Menü anpassen von Helligkeit/Kontrast im Bild-Stapel und Änderungen auf alle Bilder zu verbreiten, indem Sie auf Übernehmen geklickt.</li>
		<li>Beschäftigen Sie die Polygon-Auswahl-Werkzeug jeder abgebildeten Wurm abzugrenzen und die Messfunktion unter Analyse Pull-Down-Menü um Fluoreszenzintensität emittierten NR zu quantifizieren.</li>
		<li>Messen Sie für jedes Bild fünf Hintergrund Standorten und berechnen Sie die durchschnittliche Hintergrund Fluoreszenz-Intensität.</li>
		<li>Subtrahieren Sie die Hintergrund-Fluoreszenzintensität von jeder abgebildeten Wurm mit Hilfe der Formel N = G - (A x B), wobei N für net Fluoreszenz, G für grobe Fluoreszenz, für insgesamt Wurm Bereich A und B für durchschnittliche Hintergrundfluoreszenz steht.</li>
		<li>Um der Fluoreszenzintensität nach Wurm Größe zu normalisieren, Teilen des Wurms net Fluoreszenz durch seine Gesamtfläche. Die Ergebnisse werden als Fluoreszenzintensität, in beliebigen Einheiten (AE), pro Pixel dargestellt. Hinweis: Vermeiden Sie die Bilder im JPEG-Format exportieren. Während Kompression Dateien übersichtlicher macht zu speichern, ist die Integrität der Daten durch dieses Format gefährdet. Stellen Sie sicher, dass alle Bilder modifiziert und identisch analysiert sind. Denken Sie daran, eine Maßstabsleiste um Größe bei verschiedenen Vergrößerungen richtig zu bewerten. Um Unterschiede in der Fluoreszenzintensität mit ImageJ besser zu visualisieren, wechseln Sie Bildtyp aus RGB 8-Bit zu und wählen Sie Feuer aus dem Menü "Bild Lookup Tabellen (LUT)". Dadurch entsteht eine Heatmap Bild in welcher erhöhte Farbe Helligkeit mit erhöhten Fluoreszenzintensität korreliert.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Öl rot O Färbung (ORO) von Lipiden
<ol><li>Vorbereitung der ORO-Stammlösung<ol>
<li>In einer 250 mL Flasche 100 mL 100 % Isopropanol 500 mg Pulver ORO hinzufügen und gut verrühren.</li>
		<li>Nachdem vorbereitet, speichern Sie die Lösung, die dicht mit keine Belichtung.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vorbereitung der Arbeitslösung ORO<ol>
<li>ORO-Stammlösung in Wasser (3:2) zu 60 % Isopropanol zu verdünnen.</li>
		<li>Vor dem Gebrauch filtern Sie die Arbeitslösung ORO durch einen 0,2 µm Celluloseacetat sterile Spritze filter Hinweis: Für beste Lösungsqualität bereiten Sie Arbeitslösung ORO am Vortag vor, und lassen Sie es über Nacht mischen. Jedoch wenn Lösung benötigte gleichentags, verdünnen Sie und mischen Sie ORO Lösung auf einer Wippe für mindestens 2 Stunden vor Gebrauch. Wickeln Sie vor Schaukeln, konische Rohr in Paraffin Band zum Auslaufen der ORO-Lösung zu vermeiden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vorbereitung von Würmern ORO Lipid Färbung<ol>
<li>Wachsen Sie die Würmer bei 20 ° C auf Nematoden Wachstumsmedium (NGM) mit späten Log OP50 E. Coli , gewünschte Lebensstadium ausgesät.</li>
		<li>Die Platte 1 mL PBST-Lösung hinzu und schwenken Sie, bis alle Würmer aus der Platte sind. Kippen Sie die Platte und waschen Sie ihn mit 1 mL der PBST. Übertragen Sie die Wurm-Aussetzung zu einem 1,5 mL Microfuge Schlauch.</li>
		<li>Zentrifuge, die Würmer bei 560 X g für 1 min. den Überstand entfernen ohne Pellets und wiederholen Sie die Reinigung Schritt mit 1 mL PBST dreimal zu stören. Entfernen Sie alle überstand aber 100 µL.</li>
		<li>Das Wurm-Pellet 600 µL 40 % Isopropanol hinzu und bei Raumtemperatur 3 min rock.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Würmer auf 560 x g für 30 s und entfernen alle überstand aber 100 µL ohne Unterbrechung der Wurm Pellet. Hinweis: Verwenden Sie höhere Volumina der PBST Würmer von Tellern zu waschen, wenn Hochdurchsatz-Färbung zu tun. Waschen Sie Würmer in PBST mehr als 15 min vor der Probe Fixierung nicht. Weitere Waschungen zu tun, wenn Überstand der Bakterien nicht deaktiviert ist. Inkubation in 40 % Isopropanol mit einem Nutator oder Wippe durchführen. Immer überwachen Sie Röhren, um sicherzustellen, dass vollständige Probe Erregung stattfindet.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lipid Färbung mit ORO<ol>
<li>Jede Probe 600 µL ORO Arbeitslösung hinzufügen. Invertieren der Röhre dreimal und die Würmer in ORO gut mischen.</li>
		<li>Drehen Sie die Proben bei 30 u/min für 2 h bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Proben bei 560 X g für 1 min und beseitigen Sie alle überstand aber 100 µL.</li>
		<li>Aufschwemmen Sie Proben in 600 µL PBST und drehen Sie der Rohre bei 30 u/min für 30 min um überschüssige ORO Fleck zu entfernen.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie Proben bei 560 X g für 1 min und beseitigen Sie alle, aber 50 µL überstand.</li>
		<li>Um den Speicherort der Keimbahn und Darmzellen des Tieres besser zu unterscheiden, Fleck Kerne durch Zugabe von 1 µL (2-(4-amidinophenyl) - 1 H-Indol-6-Carboxamidine) (DAPI) für jeden 1 mL ORO funktionierende Lösung. ORO Färbung für 2 h mit dem Hinzufügen von DAPI vor der Montage der Folien für die Bildgebung durchführen. Intestinale Kerne sind größer und die Gonade zeichnet sich durch die entwickelnden Keimzellen. Hinweis: Nach ORO Färbung, können Würmer halten an den Seiten des Microfuge Rohres und nicht zu einen spürbaren Pellet bilden. In diesem Fall Zentrifugieren Sie die Würmer wieder oder lassen Sie Würmer durch die Schwerkraft für mindestens 10 min zu begleichen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vorbereitung der Folien auf Wurm imaging<ol>
<li>Aufschwemmen Sie der Würmer im restlichen überstand und mischen Sie die Lösung gut.</li>
		<li>5 µL der Wurm Aussetzung auf einen Objektträger und stellen Sie einem Deckgläschen sorgfältig, um sicherzustellen, dass keine Form Luftblasen.</li>
		<li>Das Deckglas mit Nagellack und Bild Würmer zu versiegeln. Hinweis: Nach Fixierung und Färbung, können Würmer sehr steif und schwer zu pipette sein. Um dies zu umgehen, stellen Sie weite Bohrung Pipetten durch das Abschneiden ihrer Spitzen.</li>
		<li>Speichern Sie die Folien in einem Mikro-Zentrifuge Rack bei 4 ° C bis zu 24 Stunden, wenn nicht sofort nach dem Färben imaging.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bildgebung der ORO-gefärbten Würmer<ol>
<li>Verwenden Sie eine Farbe-fähigen Kamera Bild ORO-gefärbten Würmer.</li>
		<li>Verwenden Sie 5 X Vergrößerung, um mehrere Würmer in einem Blickfeld Bild.</li>
		<li>Wechseln Sie zu 10-facher Vergrößerung für bessere Prüfung der einzelnen Würmer.</li>
		<li>Exportieren Sie Bilder im TIF-Format, um Datenverlust durch Kompression zu vermeiden. Hinweis: Wenn Färbung mit ORO + DAPI, wechseln Sie die Farbe-fähigen Kamera zu einem, die Fluoreszenz erfassen können.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bildanalyse von ORO-gefärbten Würmer<ol>
<li>Laden Sie Micrograph(s) auf ImageJ. Verwenden Sie im Pulldown-Menü Plugins die Bio-Formate-Funktion, wenn die Image-Datei nicht erkannt wird.</li>
		<li>Verwenden Sie in der Bild-Pull-Down-Menü unter dem Stapel-Funktion Bilder-Stack, um einem Bildstapel zu erstellen, wenn mehrere Aufnahmen verglichen werden.</li>
		<li>Passen Sie Helligkeit/Kontrast unter der gleichen Pull-Down-Menü zur Verbesserung der Sichtbarkeit der Lipid-Tröpfchen.</li>
		<li>Kategorisieren Sie die Bilder nach Lipid-Akkumulation im gesamten Körper des Tieres oder in bestimmten Geweben.</li>
		<li>Zur besseren Beurteilung des Lipid-Lokalisierung und für die Identifizierung von unspezifischen Bildartefakte mit ImageJ wählen Sie die Farbe-Funktion unter dem Pulldown-Menü "Bild" und klicken Sie auf Stapel zu RGB, die Signale der einzelnen RGB-Komponenten zu zeigen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Der Anstieg der Adipositas und metabolische Krankheit Preise macht C. Elegans ein geeignetes Modell, die Mechanismen zu studieren, die Fettansammlung in Zellen und Geweben zu regulieren. Aktuelle Hinweise darauf, dass die Änderungen im Blutfettwerte mit zellulärer Prozesse von Insulin Signalisierung8, die Aktivierung der Hormon-Rezeptoren als2Reproduktionsleistung5korreliert sind. Im Vergleich zu markierungsfreie Mikroskopie und Chromatograp...

Lipide sind lebensnotwendig. Sie sind integrale Bestandteile von Membranen, fungieren als sekundäre Botenstoffe und signal-Wandler und haben wichtige Funktionen der Energiespeicherung. Wenn Fettstoffwechsel Dysregulated ist, führt dies zu Krankheiten wie Adipositas und Diabetes Typ II, die öffentliche Gesundheit Bedenken9drücken. Caenorhabditis elegans (C. Elegans) ist eine ausgezeichnete Modellorganismus in der Fettstoffwechsel zu studieren, weil es eine relativ kurze Lebensdauer, ein transparenter Körper, eine bekannte Zelle Abstammung und ein vollständig sequenzierte Genom hat. In erster Linie ein Hermaphrodit, C. Elegans erlaubt es den Forschern zu zahlreicher isogenen Tiere in kurzen Zeiträume Mitnahmeservice Hochdurchsatz-vorwärts genetischer Bildschirme, eine breite Palette von metabolischen Gene und Wege4zu studieren. Dieser Ansatz hat ein hohes Maß an Schutz in 273 C. Elegans -Lipid-Stoffwechsel-Genen zwischen Menschen, Mäuse, Ratten und Drosophila ergeben. Darüber hinaus haben mehr als 300 Lipid-Gene in C. Elegans menschlichen Orthologe, die mit Krankheiten, die in keinem Zusammenhang mit metabolischem Syndrom11verbunden sind. Prüfung der Lipid-Lagerung in C. Elegans hat traditionell meist auf Farbstoff-markierten Assays, gestützt, die robuste über Lipid-Ansammlung Auskunft. Seltener ist eine Beschreibung von Lipiden wo lokalisieren und gemessenen Unterschiede in Hülle und Fülle Lipid über Gewebe. Neuere Arbeiten ergaben jedoch, dass Lipid Verteilung genauso wichtig wie Lipid Ansammlung6sein kann.
In letzter Zeit Studien haben begonnen, Integration von Methoden wie hohe Leistung flüssige Chromatographie-Massenspektrometrie (HPLC-MS), Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) und kohärente Anti-stokes Raman-Streuung (Autos) Mikroskopie an Adresse der Mängel der Fleck-basierte Ansätze direkt analysiert den Inhalt der Lipid-Extrakte, spezielle Lipid Brüche und Lipid Ablagerungen, bzw.10,11. Darüber hinaus hat CARS-Mikroskopie ergeben, dass Nils rot nur als Proxy für Fettansammlung Verwendung als Fixativ Farbstoff, für den Einsatz als ein wichtige Fleck zum Ziel-Färbung des Auto-fluoreszierende Organellen10 führtdienen kann. Jedoch die erforderliche technische Know-how und Kosten im Zusammenhang mit diese Chromatographie und Mikroskopieverfahren nutzen ihre unhaltbar für viele Fragestellungen. In diesem Artikel besprechen wir eine bequeme und sichere Methode zum fixieren und neutral Lipid-Ablagerungen in C. Elegans mit Nil rot färben und Öl rot O um Lipid Fülle in ganze Tiere und in bestimmten Geweben zu unterscheiden.
Nil-rot, 9-diethylamino-5H-benzo[α]phenoxazine-5-one, ist ein Benzophenoxazone Farbstoff, der leicht löst sich in verschiedenen organischen Lösungsmitteln, aber meist in Wasser unlöslich. Es ist eine ausgezeichnete Lysochrome Farbstoff verwendet, neutralere Lipiden wie Triglyceride zu beflecken oder Cholesterin Ester da freuen Sie sich auf eine starke Farbe solubilisiert gut in Lipiden, hat vernachlässigbare Interaktion mit umgebenden Gewebe und ist weniger löslich im Lösungsmittel als in Lipide. Es verfügt über eine Anregung und Emission Maxima von 450-500 und 520 nm, bzw.1. Bei Nil rot gefärbten C. Elegans für grüne Fluoreszenz angezeigt wird, können diskrete Lipid Körper beobachtet in den Darm und anderen Geweben entweder in Clustern oder gleichmäßig verteilt, je nach Genotyp oder experimentelle Behandlung des Tieres 7.
Öl rot O ist ein Lysochrome, fettlösliche Färbemittel verwendet, Triglyceride und Lipoproteine zu beflecken. Es ist eine Azo-Farbstoff genannt, weil seine chemische Struktur zwei azo Gruppen an drei aromatischen Ringen befestigt enthält. Es ist schwer zu ionisieren, das macht es sehr löslich in Lipiden. Seine Fleck Farbe ist rot und seine maximale Lichtabsorption 518 nm 3. C. Elegans gebeizt mit Öl rot O zeigen rote Lipid-Tröpfchen, die sich gegen das Tier durchsichtigen Körper, die qualitative Bewertung der Lipid-Verteilung zwischen den verschiedenen Geweben6erleichtert.

<table><tbody><tr><td>Imager.M2m Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>n/a</td><td>Fluoreszenzmikroskop</td></tr><tr><td>ERC5s Kamera</td><td>Axiocam</td><td>n/a</td><td>Farbfähige</td></tr><tr><td>MRm Kamera</td><td>Axiocam</td><td>n/a</td><td>Fluoreszenzfähig</td></tr><tr><td>Nilrot</td><td>Thermo Fisher</td><td>N1142</td><td>Lipidfleck</td></tr><tr><td>Öl rot O</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12989</td><td>Lipidfleck</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher</td><td>D1306</td><td>DNA-Färbung</td></tr><tr><td>Isopropylalkohol</td><td>BDH</td><td>BDH1133-1LP</td><td>Fixierlösung</td></tr><tr><td>0,2 & Mikro; m seterile Spritzenvorsatzfilter</td><td>VWR</td><td>28145-477</td><td>Celluloseacetat-Filter</td></tr><tr><td>Zentrifuge 5430</td><td>Eppendorf</td><td>5428000015</td><td>Zentrifugenschüttler</td></tr><tr><td>Rotisserie</td><td>Lab Quake</td><td>400110Q</td><td>Shaker</td></tr><tr><td>Tube Rotator</td><td>VWR</td><td>10136-084</td><td>Rotator</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7758-11-4</td><td>NGM</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7778-77-0</td><td>NGM</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Alfa Aesar</td><td>7786-30-3</td><td>NGM</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10035-04-8</td><td>NGM</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7647-14-5</td><td>NGM</td></tr><tr><td>Cholesterin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>57-88-5</td><td>NGM</td></tr><tr><td>Pepton</td><td>BD Biosciences</td><td>211677</td><td>NGM</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Teknova</td><td>L9110</td><td>NGM</td></tr><tr><td>LB Medien</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3147</td><td>Bakterienwachstum</td></tr></tbody></table>

quantifizierung der lipid-fülle und bewertung von lipid verteilung in caenorhabditis elegans von nil-rot und Öl rot o färbung

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

Caenorhabditis Elegans ist eine außergewöhnliche Modellorganismus in der Lipidstoffwechsel und Energie-Homöostase zu studieren. Viele seiner Lipid-Gene sind beim Menschen konserviert und metabolisches Syndrom oder anderen Krankheiten zugeordnet werden. Prüfung der Lipid-Akkumulation in diesem Organismus kann durch Fixativ Farbstoffe oder markierungsfreie Methoden durchgeführt werden. Fixativ Flecken wie Nil rot und rot O Öl sind preiswerte, zuverlässige Methoden zur Messung quantitativ Blutfettwerte und qualitativ Lipid-Verteilung über Gewebe, bzw. zu beobachten. Darüber hinaus erlauben diese Flecken für Hochdurchsatz-Screening von verschiedenen Lipid-Stoffwechsel-Gene und Wege. Darüber hinaus ihre hydrophoben Natur erleichtert Lipid Löslichkeit, Interaktion mit der umgebenden Gewebe reduziert und Dissoziation in das Lösungsmittel verhindert. Obwohl diese Methoden effektiv bei der allgemeinen Fettgehalt zu prüfen sind, bieten sie keine detaillierte Informationen über die chemische Zusammensetzung und Vielfalt der Lipid-Ablagerungen. Für diese Zwecke markierungsfreie Methoden wie GC-MS und CARS-Mikroskopie besser geeignet, deren Kosten trotz.

SKN-1 ist ein bZip, zellschützenden Transkriptionsfaktor, der teilt Homologie mit Säugetieren NRF2 und hat gezeigt, dass Fettsäureoxidation vermitteln. Abhängig von der Glukosekonzentration in ihrer Ernährung zeigen Würmer mit einer konstitutiv aktivierten Skn-1 Allel verschiedene Blutfettwerte bei Nil rot7klebt. Abbildung 1A -C zeigt aktivierten Skn-1 -Tiere, die Bedingungen, die zur Erhöhung der Blu...

Nil rote Färbung der festen Caenorhabditis Elegans ist eine Methode zur quantitativen Messung der neutral Lipid Ablagerungen, während Öl rote Färbung O qualitative Bewertung der Lipid-Verteilung zwischen den Geweben ermöglicht.

Quantifizierung der Lipid-Fülle und Bewertung von Lipid Verteilung in Caenorhabditis Elegans von Nil-rot und Öl rot O Färbung

Caenorhabditis elegans is an exceptional model organism in which to study lipid metabolism and energy homeostasis. Many of its lipid genes are conserved ...

Das übergeordnete Ziel dieser Färbemethoden ist es, die intrazelluläre Lipidhäufigkeit zu quantifizieren und die Lipidverteilung zwischen verschiedenen Geweben zu bewerten. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Fettstoffwechsel zu beantworten, z. B. wie Lipide genetisch und biochemisch reguliert werden und welche Krankheitszustände dadurch die Lipidhomöostase regulieren. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie relativ einfach und kostengünstig durchzuführen ist.Um die Nilrot-Lipidfärbung durchzuführen, plättieren Sie Würmer auf Nematodenwachstumsmedium oder NGM, die mit spätem log OP50 E.coli besiedelt sind, und züchten Sie die Würmer bei 20 Grad Celsius bis zum frühen L4-Stadium. Waschen Sie die Würmer mit einem Millimeter PBST-Lösung und geben Sie die Wurmsuspension in ein 1,5-Milliliter-Mikrofuge-Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Würmer eine Minute lang bei der 560-fachen Schwerkraft.Entfernen Sie dann den Überstand und wiederholen Sie die PBST-Wäsche, bis die E.coli aus der Suspension entfernt sind. Geben Sie anschließend 100 Mikroliter 40 % Isopropanol oder 60 % für die ORO-Färbung in das Wurmpellet und inkubieren Sie die Probe drei Minuten lang bei Raumtemperatur. Die Zugabe von Isopropanol ist entscheidend für die richtige Permeabilisierung der Würmer vor der Färbung.Zentrifugieren Sie die Würmer eine Minute lang bei der 560-fachen Schwerkraft und entfernen Sie den Überstand, ohne das Wurmpellet zu beschädigen. Es ist wichtig, die Lichteinwirkung während der Zentrifugationsschritte zu minimieren. Geben Sie nun im Dunkeln 600 Mikroliter der zuvor vorbereiteten NR-Arbeitslösung zu jeder Probe.Drehen Sie die Röhrchen dreimal um und mischen Sie die Würmer und die Lösung vollständig. Dann inkubieren Sie die Probe zwei Stunden lang im Dunkeln bei Raumtemperatur. Nach der Inkubation die Würmer zentrifugieren und den Überstand entfernen.Fügen Sie dann 600 Mikroliter PBST hinzu und inkubieren Sie die Proben 30 Minuten lang im Dunkeln, um den überschüssigen NR-Fleck zu entfernen. Nachdem die Proben erneut wie zuvor gedreht wurden, werden alle bis auf etwa 50 Mikroliter Überstand entfernt und das Wurmpellet in der restlichen Lösung wieder suspendiert. Um Objektträger für die Bildgebung vorzubereiten, pipettieren Sie fünf Mikroliter Wurmsuspension auf einen Objektträger und tragen Sie vorsichtig ein Deckglas auf, um Luftblasen nicht einzuschließen.Verwenden Sie den FITC-GFP-Kanal, um NR-gefärbte Würmer abzubilden, und probieren Sie verschiedene Belichtungszeiten aus, um die Würmer mit fünffacher Vergrößerung abzubilden, um mehrere Tiere pro Sichtfeld zu erfassen. Wechseln Sie dann zur 10-fachen Vergrößerung für eine bessere Quantifizierung einzelner Würmer. Um die Bilder zu quantifizieren, laden Sie die Mikrographen auf ImageJ hoch.Passen Sie im Bild-Pulldown-Menü die Helligkeit und den Kontrast des Bilddecks an und übertragen Sie die Änderungen auf alle Bilder, indem Sie auf Anwenden klicken. Verwenden Sie das Polygonauswahlwerkzeug, um jeden abgebildeten Wurm abzugrenzen, und verwenden Sie im Pulldown-Menü "Analyse" die Funktion "Messen", um die von NR emittierte Fluoreszenzintensität zu qualifizieren. Messen Sie für jedes Bild fünf Hintergrundpositionen, und berechnen Sie die durchschnittliche Hintergrundfluoreszenzintensität. Geben Sie 600 Mikroliter Oil Red O- oder ORO-Arbeitslösung zu jeder Probe und drehen Sie das Röhrchen dreimal um, um die Würmer und das ORO gut zu mischen.Drehen Sie die Proben zwei Stunden lang bei 30 U/min und RT. Die Proben werden eine Minute lang bei der 560-fachen Schwerkraft zentrifugiert und der gesamte Überstand mit Ausnahme von 100 Mikrolitern abgesaugt. Verwenden Sie dann 600 Mikroliter PBST, um die Proben zu resuspendieren, und drehen Sie die Röhrchen 30 Minuten lang bei 30 U/min, um überschüssige ORO-Flecken zu entfernen.Um die Position der Keimbahn der Tiere in den Darmzellen besser zu unterscheiden, färben Sie die Zellkerne, indem Sie je einen Mikroliter DAPI pro Milliliter ORO-Arbeitslösung hinzufügen. Um dann Objektträger für die Bildgebung vorzubereiten, resuspendieren Sie die Würmer und den restlichen Überstand und mischen Sie die Lösung gut. Geben Sie fünf Mikroliter Wurmsuspension auf einen Objektträger und bringen Sie vorsichtig ein Deckglas an, um darauf zu achten, dass sich keine Luftblasen bilden.Um die mit ORO gefärbten Würmer abzubilden, verwenden Sie eine farbfähige Kamera mit fünffacher Vergrößerung, um mehrere Würmer in einem Sichtfeld abzubilden. Wechseln Sie dann zur 10-fachen Vergrößerung, um einzelne Würmer besser untersuchen zu können. Nachdem Sie die Bilder auf ImageJ hochgeladen und ein Bilddeck gemäß dem Textprotokoll erstellt haben, kategorisieren Sie die Bilder nach der Lipidakkumulation im gesamten Körper des Tieres oder in bestimmten Geweben.SKN-1 teilt die Homologie mit Nrf2 aus Säugetieren und vermittelt nachweislich die Fettsäureoxidation. Diese Abbildung zeigt aktivierte SKN-1-Tiere, die Bedingungen ausgesetzt waren, die zu einem Anstieg der Lipidspiegel führten. Wie auf diesen Bildern zu sehen ist, ist die NR-Fluoreszenz, die mit dem FITC-GFP-Kanal erfasst wurde, entlang des Darms ausgeprägt, aber im Kopf-, Schwanz- und Darmlumen schwächer.Während es einfach ist, die Würmer nach dem Vorhandensein oder Fehlen von altersabhängiger somatischer Erschöpfung von Fett oder ASDF zu kategorisieren, kann es schwierig sein, Tiere mit intermediärem Fettverlust zu identifizieren. Im Vergleich zu Nicht-ASDF-Tieren, die im ganzen Körper eine hellrote Färbung mit wenigen durchscheinenden Bereichen aufweisen, zeigen ASDF-Würmer einen spürbaren Fettabbau in den Darmzellen. Tiere, die sich im Prozess der Entwicklung von ASDF befinden, zeigen oft durchscheinende Stellen, an denen der größte Teil des Fettabbaus schließlich stattfindet.Darüber hinaus können ASDF-Würmer immer noch hellrote Färbungen im Kopf- und Schwanzbereich aufweisen, da der Phänotyp nicht durch einen vollständigen somatischen Fettabbau definiert wird, sondern durch einen ausgeprägten Fettabbau im Vergleich zu nicht gealterten Tieren. Einmal gemeistert, kann diese Technik in drei Stunden plus Bildgebungszeit durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, Würmer nicht länger als 30 Minuten vor dem Färben zu waschen und zu permeabilisieren.Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie die CARS-Mikroskopie durchgeführt werden, um die Art der Lipidspezies zu vergleichen, die jede Technologie identifiziert, und um zu bestimmen, welche Methode für bestimmte Arten von Fragen besser geeignet ist. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Lipide quantifiziert und die Lipidverteilung in den Würmern mithilfe der Nilrot- und Ölrot-O-Färbung bewertet, gefolgt von der ImageJ-Mikroskopieanalyse.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Video beschreibt ein Protokoll zur Färbung von Lipiden in ganzen, fixierten Würmern mit dem Farbstoff Nilrot. Um speziell die neutralen Lipide im Kern von Lipidtröpfchen zu betrachten, stellen Sie sich die grünen Emissionsspektren der gefärbten C. elegans vor.

Nilrot-Färbung von C. elegans: Eine Methode zur Visualisierung von Lipidtröpfchen bei fixierten Tieren

Dieses Video zeigt ein Protokoll zum Nachweis und zur Quantifizierung neutraler Lipide in Algenzellen durch Färben mit Nilrot-Farbstoff.

Nilrot-Färbung: Eine Technik zum Nachweis und zur Quantifizierung intrazellulärer neutraler Lipide in Algen

Wir präsentieren robust biochemischen und mikroskopischen Methoden zur...

Biochemische und High Throughput Mikroskopische Beurteilung der Fettmasse in<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Ein einfaches Protokoll, um die neutrale Lipidgehalt der Algenzellen zu bestimmen, mit einer Nil-Rot-Färbung Verfahren beschrieben. Diese zeitsparende Technik bietet eine Alternative zu herkömmlichen gravimetrischen basierten Lipid Quantifizierung Protokolle. Es ist für die spezielle Anwendung der Überwachung Bioprozess Leistung ausgelegt.

Eine einfache und schnelle Protokoll zur Messung neutralen Lipiden in Algenzellen mit Fluoreszenz

Hier werden detaillierte Methoden zur Zerlegung und Lipidtröpfchenfärbung von Önozyten in Drosophila-Larven mit BODIPY 493/503, einem Lipidtropfen-spezifischen fluoreszierenden Farbstoff, vorgestellt.

Dissektion und Lipid Tröpfchen Färbung von Oenocytes in Drosophila Larven

Die stimulierte Raman-Streumikroskopie (SRS) ermöglicht eine selektive, markierungsfreie Abbildung bestimmter chemischer Bestandteile und wurde effektiv zur Abbildung von Lipidmolekülen in vivo eingesetzt. Hier geben wir eine kurze Einführung in das Prinzip der SRS-Mikroskopie und beschreiben Methoden zu deren Einsatz bei der bildgebenden Lipidspeicherung bei Caenorhabditis elegans.

Markierungsfreie Bildgebung der Lipidspeicherdynamik in Caenorhabditis elegans mit stimulierter Raman-Streumikroskopie

Das vorliegende Protokoll beschreibt Lipidergänzungsmethoden in Flüssig- und On-Plate-Kulturen für Caenorhabditis elegans, gekoppelt mit Längsschnittstudien und Gentranskriptionsanalysen von Massen oder einigen wenigen Würmern und Wurmgeweben.

Lipidsupplementierung für Langlebigkeit und Gentranskriptionsanalyse bei Caenorhabditis elegans

In dieser Arbeit demonstrieren wir ein optimiertes BODIPY 493/503 Fluoreszenz-basiertes Protokoll zur Charakterisierung von Lipidtröpfchen in Lebergewebe. Durch die Verwendung von orthogonalen Projektionen und 3D-Rekonstruktionen ermöglicht der Fluorophor eine erfolgreiche Unterscheidung zwischen mikrovesikulärer und makrovesikulärer Steatose und kann einen komplementären Ansatz zu den klassischen histologischen Protokollen zur Beurteilung der hepatischen Steatose darstellen.

Analyse fluoreszenzgefärbter Lipidtröpfchen mit 3D-Rekonstruktion zur Beurteilung der Lebersteatose

Degenerative Augenerkrankungen, die die retinale Pigmentepithelschicht des Auges betreffen, sind monogenen und polygenen Ursprungs. Mehrere Krankheitsmodelle und eine Softwareanwendung, LipidUNet, wurden entwickelt, um Krankheitsmechanismen sowie mögliche therapeutische Interventionen zu untersuchen.

LipidUNet-Machine-Learning-basierte Methode zur Charakterisierung und Quantifizierung von Lipidablagerungen unter Verwendung von iPSC-abgeleitetem retinalem Pigmentepithel

Lipophagie ist eine selektive Form der Autophagie, bei der Lipidtröpfchen abgebaut werden. Funktionsstörungen in diesem Prozess werden mit der Entstehung von Krebs in Verbindung gebracht. Die genauen Mechanismen sind jedoch noch nicht vollständig verstanden. Dieses Protokoll beschreibt quantitative Bildgebungsansätze, um das Zusammenspiel zwischen Autophagie, Fettstoffwechsel und Krebsprogression besser zu verstehen.

Erforschung der Regulation des Lipidtröpfchen-Katabolismus durch Lipophagie

Hier finden Sie eine Anleitung zur effektiven Nutzung von SegElegans, einem von uns entwickelten Deep-Learning-System zur automatisierten Segmentierung einzelner Würmer in Weitfeldmikroskopiebildern, für die anschließende Verwendung in Bildanalysesoftware wie ImageJ. Wir bieten Möglichkeiten, das System sowohl online als auch offline zu nutzen.

Automatisierte Analyse von C. elegans-Fluoreszenzbildern mit SegElegans

Lernen Sie die Quantifizierung von Lipiden und die Bewertung ihrer Verteilung in Caenorhabditis elegans mittels Nile-red- und Oil-red-O-Färbung. Diese einfachen Methoden ermöglichen Einblicke in den Lipidstoffwechsel.

Quantifizierung der Lipid-Fülle und Bewertung von Lipid Verteilung in Caenorhabditis Elegans von Nil-rot und Öl rot O Färbung

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