Tracking von Drosophila Larven Verhalten als Reaktion auf optogenetische Stimulation der olfaktorischen Neuronen
21. März 2018
Dieses Protokoll analysiert Navigations Verhalten von Drosophila Larve in Reaktion auf die gleichzeitige optogenetische Stimulation der olfaktorischen Neuronen. 630 nm Wellenlänge wird verwendet, um einzelne olfaktorischen Neuronen mit dem Ausdruck einer rot-verschoben Kanal Rhodopsin zu aktivieren. Larval Bewegung gleichzeitig verfolgt, digital erfasst und mit individuell geschriebenen Software analysiert.
Das übergeordnete Ziel dieser Methodik ist es, das Navigationsverhalten von Drosophila-Larven als Reaktion auf die gleichzeitige optogenetische Stimulation ihrer Geruchsneuronen zu analysieren. Diese Methode ermöglicht die umfassende Aufschlüsselung der Funktion des Geruchskreislaufs und ergänzt Studien darüber, wie sich die Funktion des Geruchskreislaufs in die Verhaltensreaktion übersetzt. Der Hauptvorteil dieser Technik ist ihre Spezifität und zeitliche Kontrolle, indem ein Licht anstelle von herkömmlichen Geruchsgradienten verwendet wird, um einzelne Geruchsneuronen zu aktivieren.
Um das Experiment zu beginnen, bauen Sie eine Arena für lichtentzogenes Verhalten auf. Konstruieren Sie eine Box mit den Maßen 89 x 61 x 66 Zentimeter aus schwarz gefärbten Plexiglas-Acrylplatten mit einer Dicke von drei Millimetern. Stellen Sie die Box auf eine Tischplatte im Verhaltensraum.
Montieren Sie als Nächstes eine monochrome USB 3.0-CCD-Kamera, die mit einem IR-Longpass-Filter von 830 Nanometern und einem acht Millimeter großen Objektiv mit F1,4-C-Bajonett ausgestattet ist, in der Mitte der Decke der Blackbox. Legen Sie zwei Infrarot-LED-Streifen auf die Tischplatte, um die Larven in der dunklen Arena zu beleuchten. Besorgen Sie sich dann eine 22 Zentimeter x 22 Zentimeter große quadratische Aluminiumplatte, um die LED-Plattform zu bauen.
Schneiden Sie in der Mitte der Platte mit einem Metallschneider ein Loch, das groß genug ist, um um die CCD-Kamera zu passen. Decken Sie die Metallplatte mit roten LED-Lichtbändern ab. Löten Sie die LED-Lichtbanddrähte in Reihe und führen Sie die Streifendrähte in ein Optokopplerrelais ein, das von einem Raspberry Pi 2B-Mikroprozessor gesteuert wird.
Montieren Sie als Nächstes die LED-Plattform um die CCD-Kamera. Installieren und konfigurieren Sie dann ein Ubuntu MATE Raspbian Jessie Linux-basiertes Betriebssystem auf dem Raspberry Pi-Prozessor, bevor Sie das Optokoppler-Relais an die LED-Streifen anschließen. Schließen Sie ein Netzteil an, um die LED-Streifen und den Optokoppler mit Strom zu versorgen.
Stellen Sie sicher, dass an verschiedenen Stellen um die CCD-Kamera herum im Verhaltensbereich eine homogene Bestrahlungsstärke vorhanden ist. Stellen Sie mit Hilfe eines Spektrometers die absolute Bestrahlungsstärke an der Oberfläche der Arena sicher und bestimmen Sie sie auf etwa 1,3 Watt pro Quadratmeter, bezogen auf die gesamte Oberfläche der Arena. Halten Sie die Fliegen auf Standard-Fliegenfutter bei 25 Grad Celsius und 50 % relativer Luftfeuchtigkeit in einem 12-stündigen, 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus.
Um CsChrimson in einem einzigen Paar von ORNs zu exprimieren, kreuzen Sie die jungfräulichen Weibchen aus einer UAS-IVS-CsChrimson-Linie mit Männchen aus einer ORX-GAL4-Linie. Nachdem sich männliche und weibliche Fliegen in einer Kreuzung 48 Stunden lang paaren und Eier legen konnten, setzen Sie die erwachsenen Fliegen in ein frisches Fläschchen um. Auf die Oberfläche der Durchstechflasche mit Eiern werden 400 Mikroliter einer Mischung gegeben, die 400 mikromolare all-trans-retinal (ATR) enthält, gelöst in Dimethylsulfoxid oder DMSO, in 89 millimolare Saccharose, gelöst in destilliertem Wasser.
Sobald ATR in die Lebensmittelfläschchen mit Eiern gegeben wurde, inkubieren Sie die Durchstechflaschen weitere 72 Stunden lang im Dunkeln. Nach der Inkubation extrahieren Sie die Larven des dritten Stadiums von der Oberfläche des Fliegenfutters, indem Sie sie mit einer hochdichten 15%igen Saccharoselösung schwimmen lassen. Trennen Sie mit einer P1000-Mikropipette die auf der Oberfläche der Saccharoselösung schwimmenden Larven in ein 1.000-Milliliter-Glasbecherglas.
Waschen Sie die Larven viermal, indem Sie jedes Mal 800 Milliliter frisches destilliertes Wasser im Becherglas austauschen. Lassen Sie die Larven nach der letzten Wäsche 10 Minuten ruhen, bevor Sie sie dem Verhaltenstest unterziehen. Halten Sie für den Verhaltenstest eine konstante Temperatur und Luftfeuchtigkeit im Verhaltensraum aufrecht.
Bereiten Sie dasLarvenkriechmedium vor, indem Sie 150 Milliliter geschmolzene 1,5%ige Agarose in eine 22 cm x 22 Zentimeter große Petrischale gießen. Lassen Sie die Agarose ein bis zwei Stunden in den Petrischalen fest werden und abkühlen, bevor Sie sie für den Verhaltenstest verwenden. Nachdem die Agarose fest geworden ist, setzen Sie nicht mehr als 20 der vorbereiteten Larven des dritten Stadiums in die Mitte der Petrischale um und decken Sie die Petrischale mit ihrem Deckel ab.
Platzieren Sie die Petrischale in der Verhaltensarena unter der CCD-Kamera. Schalten Sie die 850-Nanometer-Infrarot-LED-Lichtquelle ein, um Larven im Video zu visualisieren. Starten Sie die CCD-Kamera, um die Bewegung der Larven aufzuzeichnen.
Fahren Sie schließlich mit der Datenverarbeitung und -analyse fort. Wenn ORN 7a, das CsChrimson exprimiert, durch Licht stimuliert wurde, gab es eine signifikante Abnahme der Lauflänge im Vergleich zu Kontrolltieren. Umgekehrt, wenn ORN 42a, das CsChrimson exprimiert, durch Licht stimuliert wurde, gab es eine signifikante Zunahme der Lauflänge im Vergleich zu Kontrolltieren.
Wir fanden heraus, dass für ORN 42a unterschiedliche zeitliche Muster der Lichtstimulation unterschiedliche Verhaltensreaktionen hervorriefen. Während wir diese Methode für die olfaktorischen Rezeptorneuronen erster Ordnung demonstriert haben, ermöglicht unsere Methode auch eine Vielzahl zukünftiger Anwendungen, wie z.B. die Messung des Einflusses von nachgeschalteten Neuronen wie Projektionsneuronen und lokalen Neuronen auf das Verhalten der Larven. Wir erwarten, dass diese Technik den Weg für eine umfassende Aufklärung der Funktion des olfaktorischen Schaltkreises der Larven ebnet.
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Übersicht
Dieses Protokoll analysiert das Navigationsverhalten von Drosophila-Larven als Reaktion auf eine simultane optogenetische Stimulation ihrer olfaktorischen Neuronen. Es verwendet Licht mit einer Wellenlänge von 630 nm, um spezifische olfaktorische Neuronen zu aktivieren, die ein rotverschobenes Kanalrhodopsin exprimieren, und ermöglicht detaillierte Untersuchungen der Funktion olfaktorischer Schaltkreise und des Verhaltens als Reaktion darauf.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Verhaltensneurowissenschaften
- Optogenetik
- Drosophila-Genetik
Hintergrund
- Diese Methodik ermöglicht die Untersuchung, wie die Funktion olfaktorischer Schaltkreise mit Verhaltensantworten korreliert.
- Sie bietet zeitliche Kontrolle über die Aktivierung mittels Licht anstelle traditioneller Duftstoffkonzentrationsgradienten.
- Der Ansatz erleichtert die Untersuchung spezifischer Neuronen im olfaktorischen System von Drosophila.
Zweck der Studie
- Die Funktion olfaktorischer Schaltkreise präzise zu untersuchen.
- Die Verhaltensreaktionen von Larven auf gezielte neuronale Stimulation zu beobachten.
- Einblicke darüber zu gewinnen, wie einzelne olfaktorische Neuronen Navigationsentscheidungen beeinflussen.
Verwendete Methoden
- Die Studie nutzt eine speziell konstruierte Verhaltensarena zur Analyse der Larvenbewegung.
- Drosophila-Larven, die CsChrimson in olfaktorischen Rezeptorneuronen (ORNs) exprimieren, wurden mit Licht stimuliert.
- Der Verhaltensassay umfasst die Herstellung eines Agarose-Kriechmediums und die Videoaufzeichnung der Larvenbewegungen.
- Bedeutende Schritte beinhalten den Bau der Arena, die Montage der Ausrüstung und die Vorbereitung der Larven unter bestimmten Bedingungen.
Hauptergebnisse
- Die Lichtstimulation spezifischer olfaktorischer Rezeptorneuronen führte zu signifikanten Unterschieden in der Laufstrecke der Larven, was auf unterschiedliche Verhaltensreaktionen hinweist.
- Unterschiedliche zeitliche Stimulationsmuster riefen jeweils verschiedene Effekte auf das Navigationsverhalten hervor.
- Diese Methode ist geeignet, zukünftige Untersuchungen der downstream wirksamen neuronalen Einflüsse auf das Larvenverhalten zu ermöglichen.
Schlussfolgerungen
- Die Studie veranschaulicht einen neuartigen Ansatz zur Analyse olfaktorischer Schaltkreise und ihrer Verhaltensauswirkungen.
- Sie ermöglicht es Forschenden, die spezifischen Funktionen gezielt adressierter Neuronen im Kontext eines lebenden Organismus zu untersuchen.
- Diese Erkenntnisse vertiefen unser Verständnis der neuronalen Mechanismen bei der sensorischen Verarbeitung und dem Verhalten.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Diese Methode ermöglicht eine präzise Untersuchung der Funktion olfaktorischer Schaltkreise, indem Duftreize durch optogenetische Kontrolle ersetzt werden, wodurch eine zentrale Herausforderung bei der Target-Validierung adressiert wird, bei der Verhaltensauslesungen mit spezifischer neuronaler Aktivität verknüpft werden müssen. Sie unterstützt die mechanistische Risikominimierung in der frühen Entdeckungsphase, indem sie den Beitrag einzelner olfaktorischer Rezeptorneuronen zum Navigationsverhalten isoliert und so das Vorhersagevertrauen bei der Target-Auswahl verbessert. Der Ansatz verbessert die translationale Kontinuität vom molekularen Target bis zum phänotypischen Schaltkreisniveau und ist somit relevant für die Risikominimierung von Targets in neurowissenschaftlich ausgerichteten Entdeckungsprogrammen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen, indem die Aktivierung spezifischer olfaktorischer Neuronen mit definierten Verhaltensausgaben verknüpft wird.
- Operationaler Wert: Bietet ein reproduzierbares System zur funktionellen Validierung neuronaler Zielstrukturen mittels lichtbasierter Stimulation.
- Wissenschaftlicher Wert: Unterstützt die biologische Risikominimierung durch isolierte Manipulation einzelner ORNs, um deren Rolle im navigationalen Verhalten von Larven zu klären.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt quantitative Verhaltensparameter (z. B. Änderungen der Laufstrecke), die eine standardisierte Beurteilung der Effekte neuronaler Modulation ermöglichen.
- Operationaler Wert: Schafft eine skalierbare Testplattform zur Untersuchung genetischer oder pharmakologischer Modulatoren der olfaktorischen Schaltkreisfunktion.
- Wissenschaftlicher Wert: Erleichtert die Standardisierung von Assays, indem sie die Flüchtigkeit von Duftstoffen und Variabilität in der Applikation durch optogenetische Stimulation eliminiert.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Unterstützt die Modellierung krankheitsrelevanter Systeme, indem die Aufklärung der Übersetzung von sensorischen Reizen in Verhalten in einem genetisch handhabbaren Organismus ermöglicht wird.
- Operationaler Wert: Bietet einen präklinisch kompatiblen Arbeitsablauf zur Bewertung der Auswirkungen neuronaler Zielstrukturen auf das Verhalten vor der Validierung an Säugetieren.
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die mechanistische Risikominimierung, indem geklärt wird, wie neuronale Aktivität auf vorgeschalteter Ebene in nachgeschaltete Verhaltensphänotypen übersetzt wird.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in den frühen Entdeckungsprozess ein, unterstützt die Target-Validierung durch Verhaltens-Phänotypisierung und leitet die Identifizierung von Leitstrukturen ein, indem sie neuronale Zielstrukturen klärt, die messbare Ausgaben hervorrufen.
- Entdeckungsbiochemie: Ermöglicht die Hypothesenprüfung der Funktion einzelner olfaktorischer Neuronen bei der Steuerung des Navigationsverhaltens von Larven.
- Screening: Liefert quantitative, reproduzierbare Verhaltensmetriken (Laufstrecke), die zur Bewertung von Substanzen oder genetischen Modulatoren geeignet sind.
- Analytik: Bietet nachvollziehbare Verhaltensausgaben und statistische Vergleiche zwischen stimulierten und Kontrollbedingungen.
- Translationale Forschung: Verbindet neuronale Schaltkreisaktivität mit Verhaltensantworten und unterstützt die Übertragung auf komplexere Modelle.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform für die systematische Untersuchung neuronaler Zielstrukturen in olfaktorischen und anderen sensorischen Schaltkreisen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit, indem Mehrdeutigkeiten bei der Verknüpfung neuronaler Aktivierung mit Verhaltensausgängen reduziert werden.
- Operationaler Wert: Verbessert die Reproduzierbarkeit und Standardisierung durch optogenetische Steuerung, die variable Duftreize ersetzt.
- Strategischer Wert: Verbessert Go/No-Go-Entscheidungen, indem klarere mechanistische Verbindungen zwischen Zielstrukturen und verhaltensbezogenen Phänotypen bereitgestellt werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht die risikoadjustierte Priorisierung von Zielstrukturen basierend auf validiertem verhaltensbezogenem Einfluss in einem entdeckungsrelevanten System.
Umsetzungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Drosophila-Genetik, Optogenetik und im Design von Verhaltensassays.
- Benötigt spezialisierte Instrumente wie eine Verhaltensarena, Infrarotbeleuchtung, eine CCD-Kamera und eine auf Raspberry Pi basierende Stimulationssteuerung.
- Erfordert eine Standardisierung über Teams hinweg hinsichtlich der Larvenpräparation, der Zubereitung des Agarosemediums und der Videotrackingsprotokolle.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen, wenn die Methode auf verschiedene neuronale Typen (z. B. Projektionsneuronen, lokale Neuronen) oder Entwicklungsstadien ausgeweitet wird.
- Eingeschränkt durch die Notwendigkeit genetischer Zugänglichkeit und der Retinazufuhr im Modellsystem, was die Übertragbarkeit auf Nicht-Drosophila-Systeme einschränken kann.
