Tracking von Drosophila Larven Verhalten als Reaktion auf optogenetische Stimulation der olfaktorischen Neuronen

Das übergeordnete Ziel dieser Methodik ist es, das Navigationsverhalten von Drosophila-Larven als Reaktion auf die gleichzeitige optogenetische Stimulation ihrer Geruchsneuronen zu analysieren. Diese Methode ermöglicht die umfassende Aufschlüsselung der Funktion des Geruchskreislaufs und ergänzt Studien darüber, wie sich die Funktion des Geruchskreislaufs in die Verhaltensreaktion übersetzt. Der Hauptvorteil dieser Technik ist ihre Spezifität und zeitliche Kontrolle, indem ein Licht anstelle von herkömmlichen Geruchsgradienten verwendet wird, um einzelne Geruchsneuronen zu aktivieren.

Um das Experiment zu beginnen, bauen Sie eine Arena für lichtentzogenes Verhalten auf. Konstruieren Sie eine Box mit den Maßen 89 x 61 x 66 Zentimeter aus schwarz gefärbten Plexiglas-Acrylplatten mit einer Dicke von drei Millimetern. Stellen Sie die Box auf eine Tischplatte im Verhaltensraum.

Montieren Sie als Nächstes eine monochrome USB 3.0-CCD-Kamera, die mit einem IR-Longpass-Filter von 830 Nanometern und einem acht Millimeter großen Objektiv mit F1,4-C-Bajonett ausgestattet ist, in der Mitte der Decke der Blackbox. Legen Sie zwei Infrarot-LED-Streifen auf die Tischplatte, um die Larven in der dunklen Arena zu beleuchten. Besorgen Sie sich dann eine 22 Zentimeter x 22 Zentimeter große quadratische Aluminiumplatte, um die LED-Plattform zu bauen.

Schneiden Sie in der Mitte der Platte mit einem Metallschneider ein Loch, das groß genug ist, um um die CCD-Kamera zu passen. Decken Sie die Metallplatte mit roten LED-Lichtbändern ab. Löten Sie die LED-Lichtbanddrähte in Reihe und führen Sie die Streifendrähte in ein Optokopplerrelais ein, das von einem Raspberry Pi 2B-Mikroprozessor gesteuert wird.

Montieren Sie als Nächstes die LED-Plattform um die CCD-Kamera. Installieren und konfigurieren Sie dann ein Ubuntu MATE Raspbian Jessie Linux-basiertes Betriebssystem auf dem Raspberry Pi-Prozessor, bevor Sie das Optokoppler-Relais an die LED-Streifen anschließen. Schließen Sie ein Netzteil an, um die LED-Streifen und den Optokoppler mit Strom zu versorgen.

Stellen Sie sicher, dass an verschiedenen Stellen um die CCD-Kamera herum im Verhaltensbereich eine homogene Bestrahlungsstärke vorhanden ist. Stellen Sie mit Hilfe eines Spektrometers die absolute Bestrahlungsstärke an der Oberfläche der Arena sicher und bestimmen Sie sie auf etwa 1,3 Watt pro Quadratmeter, bezogen auf die gesamte Oberfläche der Arena. Halten Sie die Fliegen auf Standard-Fliegenfutter bei 25 Grad Celsius und 50 % relativer Luftfeuchtigkeit in einem 12-stündigen, 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus.

Um CsChrimson in einem einzigen Paar von ORNs zu exprimieren, kreuzen Sie die jungfräulichen Weibchen aus einer UAS-IVS-CsChrimson-Linie mit Männchen aus einer ORX-GAL4-Linie. Nachdem sich männliche und weibliche Fliegen in einer Kreuzung 48 Stunden lang paaren und Eier legen konnten, setzen Sie die erwachsenen Fliegen in ein frisches Fläschchen um. Auf die Oberfläche der Durchstechflasche mit Eiern werden 400 Mikroliter einer Mischung gegeben, die 400 mikromolare all-trans-retinal (ATR) enthält, gelöst in Dimethylsulfoxid oder DMSO, in 89 millimolare Saccharose, gelöst in destilliertem Wasser.

Sobald ATR in die Lebensmittelfläschchen mit Eiern gegeben wurde, inkubieren Sie die Durchstechflaschen weitere 72 Stunden lang im Dunkeln. Nach der Inkubation extrahieren Sie die Larven des dritten Stadiums von der Oberfläche des Fliegenfutters, indem Sie sie mit einer hochdichten 15%igen Saccharoselösung schwimmen lassen. Trennen Sie mit einer P1000-Mikropipette die auf der Oberfläche der Saccharoselösung schwimmenden Larven in ein 1.000-Milliliter-Glasbecherglas.

Waschen Sie die Larven viermal, indem Sie jedes Mal 800 Milliliter frisches destilliertes Wasser im Becherglas austauschen. Lassen Sie die Larven nach der letzten Wäsche 10 Minuten ruhen, bevor Sie sie dem Verhaltenstest unterziehen. Halten Sie für den Verhaltenstest eine konstante Temperatur und Luftfeuchtigkeit im Verhaltensraum aufrecht.

Larvenkriechmedium vor, indem Sie 150 Milliliter geschmolzene 1,5%ige Agarose in eine 22 cm x 22 Zentimeter große Petrischale gießen. Lassen Sie die Agarose ein bis zwei Stunden in den Petrischalen fest werden und abkühlen, bevor Sie sie für den Verhaltenstest verwenden. Nachdem die Agarose fest geworden ist, setzen Sie nicht mehr als 20 der vorbereiteten Larven des dritten Stadiums in die Mitte der Petrischale um und decken Sie die Petrischale mit ihrem Deckel ab.

Platzieren Sie die Petrischale in der Verhaltensarena unter der CCD-Kamera. Schalten Sie die 850-Nanometer-Infrarot-LED-Lichtquelle ein, um Larven im Video zu visualisieren. Starten Sie die CCD-Kamera, um die Bewegung der Larven aufzuzeichnen.

Fahren Sie schließlich mit der Datenverarbeitung und -analyse fort. Wenn ORN 7a, das CsChrimson exprimiert, durch Licht stimuliert wurde, gab es eine signifikante Abnahme der Lauflänge im Vergleich zu Kontrolltieren. Umgekehrt, wenn ORN 42a, das CsChrimson exprimiert, durch Licht stimuliert wurde, gab es eine signifikante Zunahme der Lauflänge im Vergleich zu Kontrolltieren.

Wir fanden heraus, dass für ORN 42a unterschiedliche zeitliche Muster der Lichtstimulation unterschiedliche Verhaltensreaktionen hervorriefen. Während wir diese Methode für die olfaktorischen Rezeptorneuronen erster Ordnung demonstriert haben, ermöglicht unsere Methode auch eine Vielzahl zukünftiger Anwendungen, wie z.B. die Messung des Einflusses von nachgeschalteten Neuronen wie Projektionsneuronen und lokalen Neuronen auf das Verhalten der Larven. Wir erwarten, dass diese Technik den Weg für eine umfassende Aufklärung der Funktion des olfaktorischen Schaltkreises der Larven ebnet.