Name: Mikromanipulation von Chromosomen in Insekten Spermatozyten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 45 s
Description: Erfahren Sie die Mikromanipulation von Chromosomen in lebenden Insekten-Spermatozyten mit piezoelektrischen Manipulatoren. Diese nicht-tödliche Technik ermöglicht die Untersuchung von Spannungseffekten auf Chromosomenverhalten während der Meiose.

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Wir danken für ihre wertvolle Diskussion Jessica Hall.

1. Vorbereitung der primären Insekt Spermatocyte Zellkultur Mikromanipulation
<ol><li>Schieben Sie Vorbereitung<ol>
<li>Erhalten Sie einen 75 mm x 25 mm-Objektträger mit einem 20 mm Durchmesser rundes Loch in der Mitte der Folie ausgeschnitten. Hinweis: Diese wurden aus einem einzigen Blatt von Fensterglas auf die Größe von einem Objektträger mit einem Loch in der Mitte geschnitten.</li>
		<li>Ein 25 x 25 mm #1.5-Deckglas durchlaufen einen Bunsenbrenner Flamme für 2 s.</li>
		<li>Vakuum Fett rund um den Rand des Lochs in der gläsernen Objektträger auftragen</li>
		<li>Legen Sie das Deckglas auf das Loch wie in Abbildung 1. Drücken sie die Taste und stellen Sie sicher, eine gute Abdichtung zu bilden.</li>
		<li>Drehen Sie den Objektträger und füllen Sie die Dissektion Halocarbon Öl gut ein.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Spermatocyte Kultur Vorbereitung für die Anzeige am Mikroskop Hinweis: Hier beschreiben wir die Art der Kultur-Zubereitung mit Heuschrecke oder Kricket Zellen. Hoden-Inhalte von anderen Arthropoden können mit einer ähnlichen Methode kultiviert werden.<ol>
<li>Subadulte männliche Grillen (oder Heuschrecken) erhalten. Legen Sie eine lebende Insekt im Kühlschrank für ca. 2 min um Kälte-betäuben. Mit sezierenden Schere, schnell Durchtrennen der dorsalen Oberfläche parallel zur Längsachse des Bauches direkt hinter dem Flügel Knospen. Manuell drücken Sie den Bauch sanft um die Hoden durch den Schnitt in das Exoskelett (Abbildung 2) drücken.</li>
		<li>Mit Pinzette, legen Sie die isolierten Hoden in eine Dissektion auch Halocarbon ölhaltigen.</li>
		<li>Bei Bedarf die Hoden unter dem Mikroskop sezierenden Blick. Teilen Sie diese in kleinere Stücke mit feinen Spitzen Pinzette entfernen Fett für die Hoden und verwenden Sie feine Spitzen Pinzette zum Aufbrechen der Hoden (Abbildung 3A und 3 b) zu. Verbreiten Sie die Hoden Inhalte unter das Öl auf der Oberfläche des Deckglases (Abbildung 3).</li>
		<li>Die Hoden-Inhalte zu verbreiten, bis die Ausbreitung Teil der Hoden kaum spürbar auf die Augen (Abbildung 3 ist). Bei Bedarf verwenden Sie zusätzliche Öl beladenen Dissoziation Brunnen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(2) Mikromanipulation
<ol><li>Produktion von der microneedle<ol>
<li>Platzieren Sie ein Ende aus einer Glasröhre (0,85 mm Außendurchmesser, 0,65 mm Innendurchmesser) in der Flamme einen Bunsenbrenner. Ziehen Sie das Ende von der Glasröhren derart, dass ein Winkel von 150° gebildet wird, und ein erweiterter Bereich von engen Glasröhren entsteht. Brechen Sie den Schlauch in der dünnen Region, so dass die dünne Region erstreckt sich von der Winkel ca. 10 mm lang (Abb. 4A ist).</li>
		<li>Mit einem Microforge (entweder entsprechend Powell27 nach Maß oder im Handel erhältlich-siehe Tabelle der Materialien), berühren Sie die Spitze der glasnadel, um die heißen Platindraht, das Glas an der Spitze zu schmelzen. Form einer ca. 45° Winkel zwischen der Nadel und der Platindraht Microforge (Abbildung 4 b). Ziehen Sie das Glas von der heiße Draht beim Absperren der Hitze auf den Draht, bilden eine dünne Spitze von ≤1.5 mm am Ende der glasnadel. Hinweis: Der Kopfkreis werden schwer zu messen, aber ein Trinkgeld von dieser Länge wird voraussichtlich eine feste, aber flexible Nadel zu produzieren, die für Mikromanipulation geeignet ist. Alternativ könnte ein Mikropipette Abzieher Glasröhren mit einer entsprechenden Spitzendurchmesser erstellen (der Experimentator müssen verschiedene ziehen Rezepte zur Herstellung eine angemessene feste, aber flexible Microneedle für den Job testen) verwendet werden. Die Nadel kann in einem Halter platziert werden, die zur Manipulation Nadel nach dem oben beschriebenen Verfahren erstellt ebenso geprägt ist.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Positionierung der Mikromanipulator<ol>
<li>Legen Sie die vorbereitete Folie auf der Bühne von einem inversen, Phasenkontrast-Mikroskop. Die teilenden Zellen zu finden und in das Blickfeld zu zentrieren. Konzentrieren Sie sich auf die Zellen mit den niedrigsten Vergrößerung möglich. Hinweis: Wir haben ein 16 X Phasenkontrast-Ziel.</li>
		<li>Legen Sie die Microneedle in den Nadelhalter auf dem Mikromanipulator.</li>
		<li>Manuell positionieren Sie die Microneedle im Strahlengang des Mikroskops, so dass die Spitze der Nadel durch das Licht (Abb. 5 b) beleuchtet wird.</li>
		<li>Konzentrieren Sie dem Mikroskop mehrere fokale Flugzeuge über der Ebene, in der die Zellen liegen.</li>
		<li>Positionieren Sie die Microneedle mit dem Joystick Controller bei einer niedrigen Empfindlichkeit mehrmals, den Schatten der Nadel in der x- und Y-Achse zu finden. Weiter, die Position zu korrigieren, bis die Position der Spitze sichtbar ist. Passen Sie die Position der Nadel entlang der z-Achse, bis die Nadelspitze im Fokus ist.</li>
		<li>Auf die Zellen zu konzentrieren Sie, dann konzentrieren Sie die Lupe über der Zelle Ebene, so dass Zellen nur unscharf und unsichtbar sind. Passen Sie die Position der Nadel, so dass seine Spitze im Fokus in diesem Brennebene ist.</li>
		<li>Passen Sie die Vergrößerung des Mikroskops nach Bedarf an. Hinweis: Wir haben ein 100 X 1.4 numerische Apertur (NA) Phasenkontrast-Ziel für die Mikromanipulation.</li>
		<li>Nach dem fokussieren auf die Zellen mit höherer Vergrößerung Ziel, wieder konzentrieren Sie das Mikroskop über der Ebene der Zelle, so dass die Zellen nur unscharf und unsichtbar sind. Verwenden eine höhere Empfindlichkeit, die Position der Nadel neu stellen Sie damit seine Spitze im Mittelpunkt steht und in der Brennebene über der Ebene zentriert, in der die Zellen liegen ein.</li>
		<li>Auf die Zellen, deren Position anpassen, so sie in der Mitte des Sichtfeldes bleiben zu konzentrieren. Die Nadel ist nun bereit für die Mikromanipulation.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mikromanipulation der Chromosomen<ol>
<li>Mit der gleichen Einstellung der Empfindlichkeit für die Feinpositionierung bei hoher Vergrößerung, den Joystick zur Steuerung der Microneedle und herumschieben der Chromosomen der Zelle verwenden. Halten Sie die Spitze der Nadel über der Ebene der Zellen.</li>
		<li>Ziehen oder verschieben ein Chromosoms im Fokus eines Chromosoms am oberen Rand der Zelle. Hinweis: Diese Chromosomen sind leichter zu manipulieren-Manipulation Chromosomen nah an, dass das Deckglas macht es wahrscheinlich, dass die Nadel wird in das Deckglas, Platzen der Zelle und endet das Experiment zu mahlen.</li>
		<li>Passen Sie die z-Achse auf dem Joystick bringen die Nadelspitze in den Fokus, und gehen Sie dann die Nadel tip mit dem Joystick in X und Y. setzen Sie die Spitze der Nadel direkt auf dem Chromosom manipuliert werden und schieben es in die gewünschte Richtung um den Manipulator zu Repositi zu ermöglichen auf dem Chromosom.</li>
		<li>Je nachdem, wie weit das Chromosom geschoben wird das Chromosom Spannung zuweisen, oder genügend Spannung um ein Chromosom von der Welle lösen. Sobald ein Chromosom von einer Spindel entfernt wird, legen Sie sie überall innerhalb der Zelle.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Chambers, R. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/jez.1400230302">Microdissection studies II. The cell aster: a reversible gelation phenomenon.</a> Journal of Experimental Zoology. 23 (3), 483-505 (1917).</li>
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<li>Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+micromanipulation.+II.+Induced+reorientation+and+the+experimental+control+of+segregation+in+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Chromosome micromanipulation. II. Induced reorientation and the experimental control of segregation in meiosis.</a> Chromosoma. 21 (1), 17-50 (1967).</li>
<li>Nicklas, R. B., Koch, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+micromanipulation.+3.+Spindle+fiber+tension+and+the+reorientation+of+mal-oriented+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Chromosome micromanipulation. 3. Spindle fiber tension and the reorientation of mal-oriented chromosomes.</a> Journal of Cell Biology. 43 (1), 40-50 (1969).</li>
<li>Nicklas, R. B., Ward, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elements+of+error+correction+in+mitosis%3A+microtubule+capture%2C+release%2C+and+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Elements of error correction in mitosis: microtubule capture, release, and tension.</a> Journal of Cell Biology. 126 (5), 1241-1253 (1994).</li>
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<li>Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurements+of+the+force+produced+by+the+mitotic+spindle+in+anaphase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Measurements of the force produced by the mitotic spindle in anaphase.</a> Journal of Cell Biology. 97 (2), 542-548 (1983).</li>
<li>Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+forces+that+move+chromosomes+in+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics+and+Biophysical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The forces that move chromosomes in mitosis.</a> Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 17, 431-449 (1988).</li>
<li>Nicklas, R. B., Koch, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+micromanipulation.+IV.+Polarized+motions+within+the+spindle+and+models+for+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Chromosome micromanipulation. IV. Polarized motions within the spindle and models for mitosis.</a> Chromosoma. 39 (1), 1026(1972).</li>
<li>Zhang, D., Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+chromosomes+and+centrosomes+on+spindle+assembly+as+observed+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The impact of chromosomes and centrosomes on spindle assembly as observed in living cells.</a> Journal of Cell Biology. 129 (5), 1287-1300 (1995).</li>
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<li>Zhang, D., Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomes+initiate+spindle+assembly+upon+experimental+dissolution+of+the+nuclear+envelope+in+grasshopper+spermatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Chromosomes initiate spindle assembly upon experimental dissolution of the nuclear envelope in grasshopper spermatocytes.</a> Journal of Cell Biology. 131 (5), 1125-1131 (1995).</li>
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<li>Paliulis, L. V., Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+reduction+of+chromosome+number+in+meiosis+is+determined+by+properties+built+into+the+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The reduction of chromosome number in meiosis is determined by properties built into the chromosomes.</a> Journal of Cell Biology. 150 (6), 1223-1232 (2000).</li>
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<li>Forer, A., Koch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+autosome+movements+and+of+sex-chromosome+movements+on+sex-chromosome+segregation+in+crane+fly+spermatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Influence of autosome movements and of sex-chromosome movements on sex-chromosome segregation in crane fly spermatocytes.</a> Chromosoma. 40 (4), 417-442 (1973).</li>
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<li>Felt, K. D., Lagerman, M. B., Ravida, N. A., Qian, L., Powers, S. R., Paliulis, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segregation+of+the+amphitelically+attached+univalent+X+chromosome+in+the+spittlebug+Philaenus+spumarius%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">Segregation of the amphitelically attached univalent X chromosome in the spittlebug Philaenus spumarius.</a> Protoplasma. 254 (6), 2263-2271 (2017).</li>
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<li>Paliulis, L. V., Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micromanipulation+of+chromosomes+reveals+that+cohesion+release+during+cell+division+is+gradual+and+does+not+require+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Micromanipulation of chromosomes reveals that cohesion release during cell division is gradual and does not require tension.</a> Current Biology. 14 (23), 2124-2129 (2004).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Mit etwas Übung kann die Chromosomen in der Zelle bewegen zweiten Natur geworden. Nadeln, ausreichend steif und ausreichend dünn-Kreissägeblätter sind schwer zu "den Dreh raus zu bekommen" fabrizieren, aber diese Fähigkeit kommt auch mit der Praxis. Nadeln, die so fein sind, dass sie sich verformen, wenn im Öl Halocarbon verschoben werden nicht für den Druck von Chromosomen in der Zelle. Nadeln, die so stumpf, dass ihre Tipps sichtbar sind und so groß wie 1/3 der Breite eines Chromosoms (oder größer) sehr wahrscheinlich ...

Mikromanipulation hat Teile des Mechanismus für ein Chromosom Congression Spindel Checkpoint und der Anaphase Chromosom Bewegungen ergeben. Die früheste Publikation beschreibt die Ergebnisse der Mikromanipulation Experimente wurde von Robert Chambers1. Kammern verwendet eine mechanische Mikromanipulator mit einer angehängten glasnadel das Zytoplasma einer Reihe von verschiedenen Zelltypen zu untersuchen. Leider fehlten Kontrastverfahren, die erlaubt die Visualisierung der Chromosomen und viele andere Zellbestandteile in lebenden Zellen zum Zeitpunkt Chambers Experimente zeigen nicht die Auswirkungen der Neupositionierung solche Zellkomponenten. Frühe Micromanipulations, die die Chromosom-Position verändert verwendet den Kammern Apparat um zu fegen die Spindel Midzone in Anaphase Zellen zeigen, dass solche Manipulationen die Position des Chromosom Arme in Anaphase Heuschrecke Neuroblasten2 verändern könnte . Nicklas und seine Mitarbeiter waren die ersten, feine Micromanipulations der Chromosomen, durchführen, Dehnung der Chromosomen3, trennen sie von der Spindel und induzieren eine Neuorientierung3,4, Stabilisierung eine Malorientation durch die Anwendung Spannung auf den Chromosomen5,6,7, und Messung der Kräfte von Spindeln in Anaphase8,9produziert. Andere Arbeiten von Nicklas Labor zeigte, dass zytoplasmatischen Granulat auch manipulierte10 sein könnte und zentrosomen durch Mikromanipulation11neu positioniert werden können. Mikromanipulation eignet sich nicht nur zum Verschieben von Chromosomen und anderen zellulären Komponenten. Mikromanipulation Nadel kann durch eine mitotische Spindel in Demembranated Zellen12 sauber geschnitten oder Auflösen der Kernhülle13eingesetzt werden. Darüber hinaus können benachbarte Zellen durch Mikromanipulation14,15fusioniert werden.
Mit einer Vielzahl von interessanten Experimenten, die getan werden kann mit Mikromanipulation ist es auf den ersten Blick verwunderlich, dass sehr wenige Chromosom Biologen Mikromanipulation Experimente geleistet haben. Ein Grund für diesen Mangel ist, dass mitotically teilenden kultivierten Zellen, die fest gefügten Gewebe abgeleitet sind und sind weit verbreitet für das Studium Chromosom Bewegungen extrem schwer zu Micromanipulate sind. Diese Gewebekultur Zellen haben in der Regel eine kortikale Zytoskelett, dass "wird in der Weise" von der Mikromanipulation Nadel, und Chromosomen entweder nicht durch die Nadel erreichbar oder die Nadel durch die Zelle, was zu einer Zelle Bruch und Tod schleift. Wir und andere Experimentatoren, die Mikromanipulation, verwenden fanden Arthropoden Zellen Mikromanipulation zugänglich sein. Arthropoden Spermatozyten sind leicht unter einer Schicht von Öl Halocarbon verbreiten und scheinen eine viel weniger robust kortikalen Zytoskelett zugrunde liegt der Zellmembran während einer Zellteilung haben. So Arthropoden Hoden bieten eine gute Quelle von meiotically teilenden Zellen (Spermatozyten) und mitotically teilenden Zellen (Spermatogonien) mit leicht zugänglichen Chromosomen für Mikromanipulation. Eine serielle Schnitt eine Heuschrecke Spermatocyte während einer Manipulation ergeben, daß die Nadel dringt nie in der Zellmembran. die Zellmembran verformt sich um die Nadel (Nicklas r.b., persönliche Mitteilung). Spermatozyten aus einer Reihe von Insekten und Spinnen Taxa wurden Micromanipulated, einschließlich Heuschrecken, Betenden Mantiden, Fruchtfliegen, Schnaken, Grillen, schaumzirpen, Motten, Schwarze Witwe Spinnen, Keller Spinnen und Orb-Weben Spinnen erfolgreich 3,7,17,18,19,20,21,22. Kultivierte und mitotically teilenden Zellen von Insekten können Micromanipulated sein. Zum Beispiel haben die Chromosomen in Grasshopper Neuroblasten in eine Primärkultur Chromosomen, die leicht Micromanipulated2,23sein können. Wir vermuten, dass die verfügbaren Linien abgeleitet von Drosophila kultiviert und andere Insekten auch Micromanipulatable werden, obwohl die Technik mit diesen Zellen haben wir nicht getestet haben. Wir zeigen Ihnen, wie teilender Zellen, die aus Heuschrecken und Grillen auf einem Mikromanipulation vorbereitet werden kann. Grillen sind leicht von den meisten Zoohandlungen zu jeder Zeit des Jahres zu erhalten. Heuschrecken sind nur im Sommer leicht erhältlich, es sei denn, der Forscher Zugang zu einer Labor-Kolonie hat, aber Tierspezies (Melanoplus Sanguinipes) leicht Zellen und Chromosomen lange, leicht zu manipulieren abgeflachte hat.
Ein weiterer Grund warum Mikromanipulation Experimente von einer Handvoll von Biologen gemacht wurden ist, dass Mikromanipulatoren, die Chromosomen gut bewegen auf dem Markt nur selten zur Verfügung stehen. Wir haben festgestellt, dass ein Joystick gesteuerte piezoelektrischen Mikromanipulator die Nadelbewegung ohne Vibration, Drift oder Verzögerung zwischen der Joystick und die Nadelbewegung steuert, aber andere Arten von Manipulatoren können auch erfolgreich Chromosomen schieben um in der Zelle. Die Mikromanipulatoren, entworfen von Ellis und Begg25,26 sind ideal für die Mikromanipulation Chromosomen, wenn sie älteren Technologie nutzen. Piezoelektrische Mikromanipulatoren sind derzeit verfügbar und häufig verwendete in Elektrophysiologie; Diese Mikromanipulatoren sind jedoch nicht in der Regel Joystick gesteuert. Joystick-Steuerung ist der Schlüssel zu den geschmeidigen Bewegungen für eine erfolgreiche Mikromanipulation erforderlich, und so sollte ein benutzerdefinierte Joystick zu den derzeit verfügbaren piezoelektrischen Mikromanipulatoren für ein Chromosom Mikromanipulation Arbeiten konstruiert werden. Der Joystick gesteuerte piezoelektrischen Mikromanipulatoren, die beste Arbeit haben direkte Lageregelung, in dem die Bewegung des Joysticks direkt auf eine Nadelbewegung übersetzt.
Eine neu gestaltete piezoelektrischen Mikromanipulator aus handelsüblichen teilen, die leicht ausgetauscht werden können und einige kleine 3-d-gedruckten Komponenten konstruiert werden kann, und es funktioniert gut für Chromosom Mikromanipulation24. Der Mikromanipulator hat einstellbare Empfindlichkeit, manuelle grobe Positionierung und keine Vibration, Drift oder Verzögerung in der Nadelbewegung und direkte Positionskontrolle der Nadel. Wissenschaftler können die Defekte mit Anweisungen zur Verfügung Online-24konstruieren. Im folgenden sind die Methoden für die Vorbereitung einer primären Spermatocyte Zellkultur und für Micromanipulating der Chromosomen in den Zellen in dieser Kultur.

<table><tbody><tr><td>VWR Micro Cover Glas</td><td>VWR</td><td>48366 249</td><td>25 mm x 25 mm, no 1.5</td></tr><tr><td>Dow Corning High Vacuum Grease</td><td>VWR</td><td>AA44224-KT</td><td></td></tr><tr><td>KEL-F Oil #10</td><td>Ohio Valley Specialty Chemical</td><td>10189</td><td></td></tr><tr><td>Mikrodisparierschere, Edelstahl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3271-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 feine</td><td>Vorstöße Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>0,85 mm Außendurchmesser, 0,65 mm Innendurchmesser Pyrex Glasrohr&nbsp;</td><td>Drummond Scientific</td><td>Sonderanfertigung - Rufen Sie an, um Anfrage zu stellen</td><td></td></tr><tr><td>Inverses Phasenkontrastmikroskop mit 10-facher oder 16-facher Vergrößerung und 60-facher oder 100-facher Vergrößerung Objektiv mit hoher Vergrößerung</td> Jede <td>Marke</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microforge</td><td>entweder Sonderanfertigung oder Narashige</td><td>MF-900</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>entweder Sonderanfertigung oder Burleigh PCS-6000 mit kundenspezifischem Piezo-Steuerjoystick</td><td>PCS-6300</td><td></td></tr></tbody></table>

mikromanipulation von chromosomen in insekten spermatozyten

Micromanipulation of Chromosomes in Insect Spermatocytes

Die Mikromanipulation Chromosomen hat eine wesentliche Methode zur Beleuchtung des Mechanismus zum Chromosom Congression Spindel Checkpoint und Anaphase Chromosom Bewegungen, und wurde Schlüssel zum Verständnis, was Chromosom Bewegungen steuert während der Zellteilung. Eine erfahrene Biologe können einem Mikromanipulator um Chromosomen von der Spindel, um Chromosomen innerhalb der Zelle neu zu positionieren und Chromosomen mit Hilfe einer kleinen Glas-Nadel mit einer sehr feinen Spitze Kräfte zuweisen zu lösen. Während Störungen an Chromosomen, die mit anderen Methoden wie optische fallen und andere Verwendungen von einem Laser vorgenommen werden können, kann bisher keine andere Methode der Neupositionierung der zellulären Komponenten auf der Skala der Dutzende bis Hunderte von Mikron mit wenig bis keine Beschädigung der Zelle .
Die Auswahl und Vorbereitung der entsprechenden Zellen für die Mikromanipulation der Chromosomen, die Vorbereitung der Heuschrecke und Cricket Spermatocyte Primärkulturen für den Einsatz in live Cell Imaging und Mikromanipulation, genau beschreiben hier beschrieben. Darüber hinaus zeigen wir den Aufbau einer Nadel verwendet werden für das Verschieben von Chromosomen innerhalb der Zelle und die Verwendung von einem Joystick gesteuerte piezoelektrischen Mikromanipulator mit einer glasnadel attached to it. Chromosomen innerhalb teilenden Zellen neu zu positionieren. Ein Beispielergebnis zeigt die Verwendung von einem Mikromanipulator, ein Chromosom von einer Spindel in eine primäre Spermatocyte zu lösen und das Chromosom innerhalb der Zelle neu zu positionieren.

Abbildung 6 zeigt ein Beispiel Mikromanipulation von 2 benachbarten Grasshopper primären Spermatozyten in mehrere Beispiele für die Einsatzmöglichkeiten der Mikromanipulation. Dieses Experiment wurde durchgeführt mit Hilfe einer inversen, Phasenkontrast-Mikroskop. Die 0:00 (angezeigten Uhrzeiten sind in Min: s) Bild zeigt beide Zellen vor der Manipulation. Ein Chromosom in die untere Zelle zeigt unter Spannung durch die Mikromanipulation Nadel (0:05; schwarze...

In diesem Protokoll beschreiben wir die Auswahl und Vorbereitung der entsprechenden Zellen für Mikromanipulation und den Einsatz von piezoelektrischen Mikromanipulator Chromosomen in den Zellen neu zu positionieren.

Mikromanipulation von Chromosomen in Insekten Spermatozyten

The micromanipulation of chromosomes has been an essential method for illuminating the mechanism for chromosome congression, the spindle checkpoint, and ...

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen in der Zellbiologie zu beantworten, wie, wie wichtig Spannung bei der Befriedigung des Spindel-Checkpoints ist und welche Rolle spielt die Spindelbefestigung im Chromosomverhalten in Miose? Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass es sich um eine nichttödliche Technik handelt, die es dem Experimentator ermöglicht, Verspannungen auf eine lebende Zelle anzuwenden oder sie neu zu positionieren. Bereiten Sie zunächst einen 75 mal 25 Millimeter großen Schlitten mit einem kreisförmigen Loch von 20 Millimetern aus der Mitte vor.Dann laufen Sie eine 25 mal 25 Millimeter Nummer 1,5 Abdeckung Schlitz durch eine Brötchenbrenner Flamme für zwei Sekunden. Tragen Sie Vakuumfett um den Rand des Lochs in der Glasrutsche auf. Als nächstes legen Sie den Deckel über das Loch und drücken Sie es, um eine enge Dichtung zu bilden.Drehen Sie den Schlitten um, und füllen Sie die neu erstellte Sezierstrecke gut mit Halocarbonöl. Nachdem Sie einige erwachsene männliche Grillen erhalten haben, verwenden Sie eine Sezierendereine, um die dorsale Oberfläche parallel zur langen Achse des Bauches direkt hinter den Flügelknospen zu durchschneiden. Dann drücken Sie vorsichtig den Bauch, um die Hoden durch den Schnitt im Exoskelett zu drücken.Mit Zangen die isolierten Hoden in den Sezierenbrunnen geben. Verwenden Sie unter dem Sezieren des Mikroskops feine Zeigezangen, um die Hoden in kleinere Stücke aufzuteilen und Fett zu entfernen. Dann verteilen Sie den Inhalt der Hoden unter dem Öl auf der Oberfläche des Deckschlitzes.Den Inhalt der Hoden weiter verbreiten, bis der Streuteil mit bloßem Auge kaum sichtbar ist. Bei Bedarf können zusätzliche ölbelastete Sezierbrunnen verwendet werden. Legen Sie zunächst das Ende eines Glasrohrs in die Flamme des Brötchenbrenners.Halten Sie das Ende der Schläuche, um einen 150-Grad-Winkel und einen erweiterten Bereich aus schmalen Glasschläuchen zu schaffen. Brechen Sie die Schläuche im dünnen Bereich, so dass der dünne Bereich, der sich aus dem zuvor erstellten Winkel erstreckt, etwa 10 Millimeter lang ist. Schmelzen Sie mit der Mikroschmiede die Spitze der Glasnadel und bilden einen 45-Grad-Winkel zwischen der Nadel und dem Platindraht der Mikroschmiede.Ziehen Sie dann das Glas vom Draht weg und schalten Sie gleichzeitig die Hitze aus. Legen Sie das zuvor vorbereitete Dia auf die Bühne eines invertierten Phasenkontrastmikroskops. Suchen Sie dann die teilenden Zellen und zentrieren Sie sie im Sichtfeld mit der geringstmöglichen Vergrößerung.Legen Sie die Mikronadel in den Nadelhalter des Mikromanipulators. Positionieren Sie dann die Mikronadel manuell im Lichtpfad des Mikroskops. Fokussieren Sie das Mikroskop mehrere Brennebenen über der Ebene, die die Zellen enthält.Als Nächstes verwenden Sie den Joystick-Controller, um die Mikronadel mehrmals neu zu positionieren, um den Schatten der Nadel in den x- und y-Achsen zu finden. Passen Sie die Nadelposition nach, bis die Position der Spitze sichtbar ist, und passen Sie dann die Position der Nadel entlang der z-Achse an, bis die Spitze im Fokus steht. Als nächstes konzentrieren Sie sich erneut auf die Zellen, und fokussieren Sie das Mikroskop direkt über der Zellebene.Richten Sie dann die Position der Nadel so ein, dass die Spitze in dieser Brennebene im Fokus steht. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit dem höheren Vergrößerungsziel und einer höheren Empfindlichkeitseinstellung. Konzentrieren Sie sich erneut auf die Zellen, und passen Sie ihre Position an, damit sie in der Mitte des Sichtfeldes verbleiben.Verwenden Sie den Joystick, um die Mikronadel zu steuern, während sie Chromosomen in der Zelle schiebt. Stellen Sie sicher, dass die Nadelspitze in der Ebene über den Zellen verbleibt. Um das Chromosom zu bewegen, konzentrieren Sie sich auf ein Chromosom in der Nähe der Oberseite der Zelle.Passen Sie dann die z-Achse am Joystick an, um die Nadelspitze in den Fokus zu rücken, und bewegen Sie die Nadel mit dem Joystick in x und y. Legen Sie die Spitze der Nadel direkt auf das von Interesse, und drücken Sie es in die gewünschte Richtung. Tragen Sie genügend Spannung auf, um das Chromosom von der Spindel zu trennen.Platzieren Sie das Chromosom schließlich an einer beliebigen Stelle innerhalb der Zelle. Mit diesem Protokoll ist es möglich, ein Chromosom mit Mikromanipulation neu zu positionieren, Spannung auf sich zu nehmen und ein Chromosom vollständig von einer Spindel zu lösen. In diesem Beispiel wurden zwei manipulierte Chromosomen daran gehindert, sich wieder an die Spindel anzuheften, indem sie ständig mit einer Mikromanipulationsnadel genuddelt wurden.Nach der Beherrschung können Proben für manipulationsbereit vorbereitet werden, und der Mikromanipulator kann in 15 bis 20 Minuten positioniert werden. Mikromanipulationsexperimente können von wenigen Sekunden bis zu mehreren Stunden dauern. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, Chromosomen auf der Seite der Zelle am weitesten vom Deckbedeckungsschlupf zu manipulieren.Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Zellbiologie, um den Spindel-Checkpoint in Heuschrecken und betenden Mantis zu erforschen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Mikroinjektion und hochauflösende Bildgebung in...

Mikroinjektion Techniken zur Untersuchung Mitose in der Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

Eizellen sind anfällig für Aneuploidie aufgrund von Fehlern in Chromosomensegregation während meiotischen Reifung. Aneuploiden Eier können zu Unfruchtbarkeit, Fehlgeburten oder Entwicklungsstörungen wie dem Down-Syndrom. Hier beschreiben wir Methoden, um Material der Wahl in Oozyten und Methoden zur meiotischen Reifung zu studieren und zu bewerten Ploidie einzuführen.

Maus Oocyte Mikroinjektion, Reifung und Ploidie Beurteilung

Verfahren zur Isolierung und Herstellung von Drosophila Hoden Proben (leben und fest) für die Bildgebung durch Phasenkontrast-und Fluoreszenzmikroskopie sind hierin beschrieben.

Die zytologische Analyse der Spermatogenese: Live-und Fest Zubereitungen aus<em&gt; Drosophila</em&gt; Hoden

Chromosomenmalerei ist eine nützliche Methode, um die Organisation des Zellkerns und die Evolution des Karyotyps zu untersuchen. Hier zeigen wir einen Ansatz zur Isolierung und Verstärkung bestimmter Interessenbereiche von einzelnen Polytenchromosomen, die anschließend  für die zwei- und dreidimensionale Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung (FISH) verwendet werden.

2D und 3D Chromosom Malerei in Malaria-Mücken

Meiose ist der Entwicklungsprozess durch den Gameten durch eine einzelne Runde der DNA-Replikation und zwei aufeinanderfolgenden Runden Chromosom Segregation gebildet werden. Säugetier-Meiose kann untersucht werden, durch die Verwendung einer Technik um meiotische Chromosomen breitet sich vorzubereiten. Hier zeigen wir einen Weg der Vorbereitung der Oberfläche verbreitet Kerne aus Maus Spermatozyten.

Vorbereitung der meiotischen Chromosom erstreckt sich von Maus Spermatozyten

Diese Röhrchen-Squash-Technik soll rasch zytologischen Merkmale entwickeln Maus Spermatozyten unter Beibehaltung der zellulären Integrität zu beurteilen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von allen Stufen der Spermatogenese und neben anderen biochemischen und molekularen biologischen Ansätze zur Erforschung der Maus Meiose leicht umgesetzt werden kann.

Eine Seminiferous Röhrchen-Squash-Technik für die zytologische Analyse der Spermatogenese mit dem Maus-Modell

Nukleare Oberflächenausbreitungen sind ein unverzichtbares Werkzeug, um Chromosomenereignisse während der Meiose zu untersuchen. Hier zeigen wir eine Methode zur Vorbereitung und Visualisierung meiotischer Chromosomen während der Prophase I aus Zebrafisch-Spermatozyten.

Zubereitung von meiotischen Chromosomenaufstrichen aus Zebrafisch Spermatozyten

Hier präsentieren wir eine einfache und effiziente Methode, um lebende meiotische und postmeiotische Keimzellen von erwachsenen Maushoden zu isolieren. Mit einem zytotoxischen, violett-erregten DNA-Bindungsfarbstoff und fluoreszenzaktivierter Zellsortierung kann man hoch angereicherte spermatogene Zellpopulationen für viele nachgelagerte Anwendungen isolieren.

Isolierung von murinen Spermatogenic Cells mit einem violett-erregten Zellpermeable DNA Binding Dye

Dieser Artikel berichtet über eine in vivo Hemmung von CENP-E durch abdominale Chirurgie und Hodeninjektion von GSK923295, einem wertvollen Modell für die männliche meiotische Teilung. Mit Hilfe der Immunfluoreszenz-, Durchflusszytometrie- und Transmissionselektronenmikroskopie-Assays zeigen wir, dass die CENP-E-Hemmung zu Chromosomenfehlstellungen und Genominstabilität in Mausspermatozyten führt.

Funktionelle Bewertung von Kinesin-7 CENP-E in Spermatozyten mittels In-vivo-Inhibition , Immunfluoreszenz und Durchflusszytometrie

Aufgrund ihrer einfachen Anatomie bieten Anopheles-Hoden ein gutes zytologisches Modell für die Untersuchung der Spermatogenese. Dieses Protokoll beschreibt die Whole-Mount-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung , eine Technik, die zur Untersuchung dieses biologischen Prozesses verwendet wird, sowie den Phänotyp transgener Stämme, die Mutationen in den Genen aufweisen, die an der Spermienproduktion beteiligt sind.

Ganzkörper-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung zur Untersuchung der Spermatogenese in der Anopheles-Mücke

Hier stellen wir eine Methode zur Durchführung der runden Spermatideninjektion (ROSI) bei Mäusen vor, eine Technik mit vielversprechenden klinischen Anwendungen und Nutzen für die Untersuchung der Mechanismen, die der Embryonalentwicklung zugrunde liegen.

Runde Maus-Spermatiden-Injektion

Erfahren Sie die Mikromanipulation von Chromosomen in lebenden Insekten-Spermatozyten mit piezoelektrischen Manipulatoren. Diese nicht-tödliche Technik ermöglicht die Untersuchung von Spannungseffekten auf Chromosomenverhalten während der Meiose.

Mikromanipulation von Chromosomen in Insekten Spermatozyten

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