Ein Multi-well-Format Polyacrylamid-basierten Test zur Untersuchung der Wirkung der extrazellulären Matrix Steifigkeit auf die bakterielle Infektion von adhärenten Zellen

Das übergeordnete Ziel dieser Methodik ist es, die Charakterisierung des Einflusses der extrazellulären Matrixsteifigkeit auf die bakterielle Infektion adhärenter Zellen in einer hochquantitativen Weise zu ermöglichen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen auf dem aufstrebenden Gebiet der Wirt-Pathogen-Biomechanik zu beantworten, z. B. welche Rolle mechanische Kräfte bei der Modulation der bakteriellen Infektionsanfälligkeit von Wirtszellen spielen. Diese Technik hilft bei der Erstellung hochauflösender Zeitraffer-Videosequenzen, während gleichzeitig mehrere Bedingungen überprüft und bestimmte Verfahren automatisiert werden.

Um die Glasaktivierung von 24-Well-Schalen durchzuführen, fügen Sie 500 Mikroliter Tumalo-Natriumhydroxid pro Well mit 13 Millimeter Durchmesser hinzu und inkubieren Sie die Platten eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie das Natriumhydroxid und spülen Sie die Vertiefungen einmal mit Reinstwasser aus. Geben Sie dann 500 Mikroliter zweiprozentiges Triethoxysilan in 95 % Ethanol in jede Vertiefung und inkubieren Sie sie fünf Minuten lang.

Spülen Sie die Vertiefungen einmal mit Wasser aus. Geben Sie dann 500 Mikroliter 0,5% Glutaraldehyd in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Platten 30 Minuten lang. Nachdem Sie die Platten einmal mit Wasser abgespült haben, trocknen Sie sie bei 60 Grad Celsius mit abgenommenem Deckel.

Zur Herstellung von Hydrogelen mit einstellbarer Steifigkeit stellen Sie wässrige Lösungen her, die je nach gewünschter Steifigkeit des Hydrogels drei bis 10 Prozent einer 40%igen Acrylamidlösung und 06 bis 6 Prozent einer zweiprozentigen Bis-Acrylamidlösung enthalten. Danach das Wasser hinzufügen. Für jede Steifigkeit ist Lösung eins perlenfrei, während Lösung zwei 03 %0,1 Mikrometer fluoreszierende Mikrokügelchen enthält.

Entgasen Sie die Lösungen eins und zwei 15 Minuten lang durch Vakuum, um den Sauerstoff zu eliminieren, der die Polymerisation hemmt. Fügen Sie dann, während Sie schnell handeln, 0,43 % TEMED und 0,6 % der 10-Gramm-pro-Milliliter-Stamm-APS-Lösung zu Lösung Eins hinzu. Geben Sie 3,6 Mikroliter der Lösung in die Mitte jeder Vertiefung der 24-Well-Schale.

Verwenden Sie sofort 12-Millimeter-Deckgläser, um die Vertiefungen abzudecken, und lassen Sie die Lösung 20 Minuten lang einwirken, damit sie vollständig polymerisiert. Klopfen Sie vorsichtig mit einer Spritzennadel auf eine harte Oberfläche, um an der Spitze einen kleinen Haken zu erzeugen, um das Entfernen der Deckgläser zu erleichtern, und heben Sie dann die Deckgläser mit der Nadel an. Fügen Sie als Nächstes 0,43 % TEMED und 0,6 % der 10-Gramm-pro-Milliliter-Stamm-APS-Lösung zu Lösung Zwei hinzu.

Geben Sie dann 2,4 Mikroliter der Mischung auf die 12 Millimeter dicken, kreisförmigen Deckplatten. Legen Sie die kreisförmigen Deckgläser mit einem Tropfen Lösung Zwei auf die erste Polyacrylamidschicht und drücken Sie sie mit einer Pinzette vorsichtig nach unten, um sicherzustellen, dass die Dicke der zweiten Schicht minimal ist. Lassen Sie dann Lösung Zwei 20 Minuten polymerisieren.

Geben Sie 500 Mikroliter 50 millimolare HEPES pH 7,5 in jede der Vertiefungen und entfernen Sie mit der Spritzennadel und der Pinzette die Glasabdeckungsschlüpfer. Um die Hydrogele zu sterilisieren, legen Sie sie in eine Gewebekulturhaube und setzen Sie sie eine Stunde lang der UV-Strahlung aus. Bereiten Sie nun eine Mischung aus 0,5 % Gewicht pro Volumen Sulfo-SANPAH und einem Prozent DMSO und 50 Millimolar HEPES pH 7,5 vor.

Geben Sie 200 Mikroliter der Lösung auf die Oberseite der Hydrogele. Arbeiten Sie dann schnell und belichten Sie sie 10 Minuten lang 302 Nanometer UV, um sie zu aktivieren. Verwenden Sie einen Milliliter 50 Millimolar HEPES pH 7,5, um die Hydrogele zweimal zu waschen, und wiederholen Sie dies bei Bedarf, um überschüssigen Vernetzer zu entfernen.

Beschichten Sie die Hydrogele mit 200 Mikrolitern 0,25 Milligramm pro Milliliter Rattenschwanzkollagen I und 50 Millimolar HEPES. Inkubieren Sie die Hydrogele mit dem Kollagen über Nacht bei Raumtemperatur. Bevor Sie die interessierenden Zellen auf die Hydrogele säen, fügen Sie einen Milliliter Medium hinzu und äquilibrieren Sie sie eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius.

Um menschliche mikrovaskuläre Endothelzellen zu säen, entfernen Sie nach der Kultivierung und Herstellung einer Zellsuspension gemäß dem Textprotokoll das Medium aus den Hydrogelen und fügen Sie dann einen Milliliter Zellsuspension in jede Vertiefung hinzu. Nach der Vorbereitung einer Übernachtkultur von L. monocytogenes gemäß dem Textprotokoll wird ein Milliliter der Kultur in ein Mikrozentrifugenröhrchen überführt und bei 2.000 g bei Raumtemperatur vier Minuten lang geschleudert. Nachdem Sie das Pellet zweimal mit PBS in Gewebekulturqualität gewaschen haben, verwenden Sie einen Milliliter PBS, um das Pellet wieder zu suspendieren.

Bereiten Sie die Infektionsmischung vor, indem Sie 10 oder 50 Mikroliter der Bakteriensuspension mit einem Milliliter MCDB 131 Vollmedium für eine Vielzahl von Infektionen (MOI) von etwa 50 Bakterien pro Wirtszelle oder 10 Bakterien pro Wirtszelle kombinieren. Entfernen Sie das Medium aus den Vertiefungen der 24-Well-Platten und achten Sie darauf, die Hydrogele oder die Zellen nicht zu beschädigen. Verwenden Sie einmal einen Milliliter MCDB 131 Vollmedium, um die Zellen zu waschen, und geben Sie dann einen Milliliter der Bakterien in jede Vertiefung

Legen Sie den Deckel auf die Teller und wickeln Sie sie mit Polyethylenfolie ein, um ein Auslaufen zu vermeiden. Zentrifugieren Sie die Platten 10 Minuten lang bei 2.000 g g, um die Invasion zu synchronisieren, und inkubieren Sie die Kulturen dann 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Waschen Sie die Proben mit dem Vollmedium MCDB 131 viermal und geben Sie sie wieder in den Gewebekultur-Inkubator.

Nach weiteren 30 Minuten ersetzen Sie das Medium durch MCDB 131 Vollmedium, das mit 20 Mikrogramm pro Milliliter Gentamicin ergänzt wird. Um eine Durchflusszytometrie durchzuführen, entfernen Sie acht Stunden nach der Infektion das Medium aus den Vertiefungen der 24-Well-Platte und verwenden Sie die Gewebekultur PBS, um die Vertiefungen einmal zu waschen. Geben Sie nach der Entfernung des PBS 200 Mikroliter Trypsin-EDTA-Kollagenase-Mischung in jede Vertiefung

Stellen Sie die Schale für 10 Minuten in den Gewebekultur-Inkubator, um eine vollständige Ablösung der Zellen zu ermöglichen. Nachdem Sie jede Vertiefung achtmal vorsichtig pipettiert haben, fügen Sie 200 Mikroliter Vollmedium hinzu, um das Trypsin zu neutralisieren. Übertragen Sie die 400 Mikroliter Zelllösung aus jeder Vertiefung in ein Fünf-Milliliter-Polystyrolröhrchen mit einer 35-Mikrometer-Zellsiebkappe.

Analysieren Sie die Proben mittels Durchflusszytometrie. Nach der Aussaat von HMEC-1-Zellen auf Pa-Hydrogelen und der Behandlung mit Gentamicin gemäß dem Textprotokoll inkubieren Sie die Platte fünf Stunden lang, damit sich der ActA-Promotor einschalten und die Expression des offenen mTagRFP-Leserahmens steuern kann. Mischen Sie vier Stunden nach der Infektion einen Mikroliter eines Milligramms pro Milliliter Hoechst-Farbstoff mit einem Milliliter L-15-Vollmedium und geben Sie es in jede Vertiefung, um die Zellkerne zu färben.

Nachdem Sie die Zellen 10 Minuten lang inkubiert haben, ersetzen Sie das Medium durch einen Milliliter L-15-Vollmedium, das mit 20 Mikrogramm pro Milliliter Gentamicin ergänzt wird. Bilde alle fünf Minuten mehrere Positionen mit einer Autofokus-Funktion, um zu überwachen, wie sich LM-Bakterien durch HMEC-1-Monoschichten ausbreiten, die auf Hydrogelen unterschiedlicher Steifigkeit ausgesät sind. Wie in dieser Grafik dargestellt, wurden AFM-Messungen durchgeführt, um die genaue Steifigkeit der Pa-Hydrogele zu bestätigen, die mit dem Protokoll in diesem Video hergestellt wurden.

Hier wurden HMEC-1-Zellen auf Matrizen unterschiedlicher Steifigkeit mit einem LM-Stamm infiziert, der nach der Internalisierung einen fluoreszierenden Marker exprimiert, der nur den Nachweis von intrazellulären Bakterien erlaubt. Die Zellen wurden mit dem Forward-versus-Side-Scatter-Plot gated und ein zweiter Gating-Schritt schloss Zellen aus, die eine Autofluoreszenz zeigten. Die durchflusszytometrische Analyse zeigte, dass die LM-Infektion bei steifen 70-Kilopascal-Hydrogelen etwa doppelt so hoch war wie bei 0,6 Kilopascal-Hydrogelen.

Um zu testen, ob eine erhöhte LM-Adhäsion an HMEC-1 eine erhöhte LM-Invasion in HMEC-1 oder beides für die erhöhte Anfälligkeit für eine Infektion kurz nach der Infektion mit LM konstitutiv exprimierendem GFP verantwortlich war, wurden die HMEC-1-Zellen fixiert und adhärente Bakterien mit Antikörpern gefärbt. Wie hier gezeigt, gab es signifikant mehr Bakterien, die an HMEC-1 hafteten, wenn die Wirtszellen auf steifen im Vergleich zu weichen Gelen hafteten. In Übereinstimmung mit den Durchflusszytometrie-Daten gibt es signifikant mehr Bakterien, die von HMEC-1 internalisiert werden, wenn die Wirtszellen auf steifen Zellen sitzen, als im Vergleich zu weichen Gelen.

Sobald dieser Assay gemeistert ist, kann er in etwa drei Tagen durchgeführt werden, da dazwischen lange Inkubationsschritte erforderlich sind. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, so steril wie möglich zu sein, um sicherzustellen, dass Hydrogele und Wirtszellen frei von Verunreinigungen sind. In Anlehnung an dieses Verfahren können auch andere Methoden wie die Rasterkraftmikroskopie einbezogen werden, um Fragen zu beantworten, wie sich beispielsweise die Steifigkeit von Wirtszellen bei einer Infektion verändert und ob dieser Effekt von der Steifigkeit der Matrix abhängt.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Mechanobiologie, um die Rolle der biomechanischen Wechselwirkungen von Krankheitserregern in Wirtszellen zu untersuchen, indem sie verschiedene Wirtszellen, wie z. B. Epithelzellen, und verschiedene bakterielle Krankheitserreger, wie z. B. Rickettsia parkeri, verwendeten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Hydrogele mit einstellbarer Steifigkeit auf Multi-Well-Platten herstellt und wie man den Infektionsassay durchführt. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit pathogenen Bakterien gefährlich sein kann.

Daher sollten bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden, wie z. B. das Einfügen von Barrieren zwischen der Eintrittsstelle und dem Erreger sowie die Verhinderung der Bildung von Aerosolen.