Erzeugung einer großen Zahl von myeloischen Vorläuferzellen und dendritischen Zellen Vorstufen aus murinen Knochenmark mit einer neuartigen Zelle Sortieren Strategie

Diese Methode kann es Forschern ermöglichen, eine ausreichende Anzahl von Zelltypen zu gewinnen, um zentrale Fragen der Entwicklungsimmunologie zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie auf wenigen ausgewählten Markern beruht, um eine große Anzahl von Zellen zu isolieren, die traditionell ex vivo in geringer Anzahl vorkommen. Die Implikation dieser Technik erstreckt sich auch auf die therapeutische Knochenmarktransplantation, da sie die Isolierung einer großen Anzahl von Vorläuferzellen ermöglicht.

Um das Protokoll zu beginnen, sättigen Sie die Hinterbeine und den Oberkörper einer zuvor präparierten Maus mit 75 % Ethanol und machen Sie mit einer gebogenen Gewebeschere flache Schnitte durch die Haut um das Hüftgelenk. Entfernen Sie dann die Hinterbeine und streifen Sie sie. Ziehen Sie die Haut mit einer Pinzette fest von der Hüfte nach unten in Richtung Knöchel, so dass der Muskel zum Vorschein kommt, und entfernen Sie mit einer Schere den Hautlappen.

Schneiden Sie direkt über dem Oberschenkel- und Hüftgelenk und entfernen Sie das gesamte Hinterbein, indem Sie den Knochen durchschneiden. Übertragen Sie die Beine in einer sterilen Biosicherheitswerkbank in eine der zuvor vorbereiteten Petrischale. Schneide mit einer Schere knapp unterhalb des Knöchels und entferne vorsichtig so viel Muskel und elastisches Bindegewebe wie möglich.

Übertragen Sie den gereinigten Knochen in die zweite vorbereitete Petrischale. Trennen Sie als Nächstes den Oberschenkelknochen, das Knie und das Schienbein. Halten Sie das Bein mit einer Pinzette am Knie und lokalisieren Sie das Mark, eine schwache rote Linie in der Knochenhöhle am oberen Ende des Oberschenkelknochens und am Ende der Tibia.

Schneide mit einer Schere das Schienbein knapp über der Stelle, an der das Knochenmark zu enden scheint. Schneiden Sie knapp unterhalb des Kniegelenks, schneiden Sie knapp über dem Kniegelenk. Spülen Sie dann das Knochenmark aus dem Oberschenkelknochen und dem Schienbein.

Füllen Sie eine 10-Milliliter-Spritze mit vollständigem Medium aus dem konischen 50-Milliliter-Röhrchen und verschließen Sie die Spritze mit einer 23-Gauge-Nadel. Halten Sie den Knochen mit einer Pinzette über die dritte vorbereitete Petrischale, führen Sie die Nadel in den Knochenkanal ein und schieben Sie das Medium hindurch, wodurch die Zellen ausgespült werden. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis keine Farbe mehr durch den Knochen zu sehen ist.

Setzen Sie den Vorgang fort, indem Sie die Epiphyse zerquetschen. Während Sie sich noch in der zweiten Petrischale befinden, halten Sie die Kniescheibe mit einer Pinzette fest und zerdrücken Sie die Knie mit der Spitze der Spritze. Fahren Sie fort, bis die Epiphysen nicht mehr rot sind.

Übertragen Sie die Zellen aus der zweiten und dritten Petrischalen mit der Spritze in das 50-Milliliter-Röhrchen. Brechen Sie Klumpen auf, indem Sie vorsichtig auf und ab pipettieren, und versuchen Sie, Blasenbildung zu vermeiden. Zentrifugieren Sie die Zellen.

Entfernen Sie dann den Überstand mit der serologischen Pipette, lösen Sie das Pellet durch Schnippen und lysieren Sie die roten Blutkörperchen, indem Sie sie in einem Milliliter Ammoniumchlorid-Kalium oder ACK-Lysepuffer eine Minute lang bei Raumtemperatur inkubieren. Geben Sie mit einer serologischen Pipette 40 Milliliter HBSS-Puffer hinzu. Filtrieren Sie die Zellen mit einer serologischen Pipette durch ein 70-Mikrometer-Zellsieb in ein neues konisches 50-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie die Zellen.

Entfernen Sie mit einer serologischen Pipette den Überstand und kultivieren Sie die Knochenmarkzellen in vollständigen Medien mit 10 Nanogramm pro Milliliter rekombinanter Maus GM-CSF bei einer Dichte von eins mal 10 bis 6 Zellen pro Milliliter. Übertragen Sie die Zellen mit einer serologischen Pipette auf Gewebekulturplatten und inkubieren Sie sie bei 37 Grad Celsius in 5 % Kohlendioxid, bis sie mit der Färbung fortfahren können. Pipettieren Sie die Zellen vorsichtig, aber gründlich auf und ab, um lose anhaftende Zellen zu entfernen.

Übertragen Sie die Zellen mit einer serologischen Pipette in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie die Zellen. Gießen Sie den Überstand vorsichtig ab und waschen Sie die pelletierten Zellen, indem Sie mit der serologischen Pipette 30 Milliliter FACS-Waschpuffer (SFWB) hinzufügen. Zentrifugieren Sie dann die Zellen und wiederholen Sie den Waschvorgang.

Als nächstes suspendieren und färben Sie die Zellen gemäß den Anweisungen des Antikörperherstellers. Resuspendieren Sie fünfmal 10 bis die 7. Zellen in einem Milliliter FWB und fügen Sie jeweils zwei Mikrogramm Anti-Ly-6C und Anti-CD115 hinzu, die mit Fluorophoren markiert sind. Um CMP weiter von MODC zu unterscheiden, fügen Sie zwei Mikrogramm Anti-CD11C-Antikörper hinzu.

Inkubieren Sie die Proben 30 Minuten lang auf Eis. Nach der Inkubation verwenden Sie eine serologische Pipette, um 10 Milliliter FWB hinzuzufügen, und zentrifugieren Sie die Zellen. Gießen Sie den Überstand vorsichtig ab und waschen Sie die pelletierten Zellen, indem Sie mit einer serologischen Pipette 30 Milliliter FWB hinzufügen.

Zentrifugieren Sie die Zellen und wiederholen Sie den Waschvorgang. Bevor Sie die Zellen aufhängen, schnippen Sie das Rohr gründlich, um das Pellet zu lösen. Verwenden Sie eine serologische Pipette, um die Zellen einmal 10 bis 7 Zellen pro Milliliter FWB zu resuspendieren, und filtrieren Sie sie durch einen 35-Mikrometer-Zellfilter.

Verwenden Sie eine serologische Pipette, um die gefilterten Zellen in ein Polypropelyn-Röhrchen zu überführen, und stellen Sie das Röhrchen auf Eis, bis sie zum Sortieren bereit sind. Lassen Sie die Kontrolle über ungefärbte Partikel durch den Zellsortierer laufen und wenden Sie ein Tor an, um kleine Ablagerungen und hochkörnige Partikel auszuschließen. Lassen Sie die einzelnen fluoreszierenden Kontrollproben durch den Zellsortierer laufen und passen Sie die Kompensation nach Bedarf an.

Führen Sie eine Stichprobe der Stichprobe mit mehreren Beschriftungen aus, und beobachten Sie vier unterschiedliche Populationen. Wenden Sie ein Tor an, um jede der vier Hauptpopulationen zu isolieren. Bereiten Sie Entnahmeröhrchen vor, indem Sie genügend fötales Kälberserum (FCS) hinzufügen, um eine Endkonzentration von mindestens 20 % zu erreichen, wenn es voll ist.

Wenn Sie beispielsweise Fünf-Milliliter-Röhrchen verwenden, fügen Sie vor dem Sortieren einen Milliliter FCS hinzu und entfernen Sie das Röhrchen, wenn es ein Gesamtvolumen von fünf Millilitern erreicht. Um einen Membranumsatz und die Aufnahme von Antikörpern zu verhindern, sollten alle Proben während der gesamten Sortierung bei vier Grad Celsius gehalten werden. Nachdem die gewünschte Anzahl von Zellen entnommen wurde, verwenden Sie eine serologische Pipette, um die Zellen in ein neues konisches Röhrchen zu übertragen, und zentrifugieren Sie die Zellen.

Entfernen Sie vorsichtig den Überstand, resuspendieren Sie die Zellen in 10 Millilitern FWB und zentrifugieren Sie die Zellen erneut. Wiederholen Sie die FWB-Suspension für insgesamt zwei Wäschen. Entfernen Sie schließlich den Überstand nach dem zweiten Waschen und fahren Sie basierend auf dem Versuchsplan fort.

Um so viele Kanäle wie möglich für die Analyse zur Verfügung zu haben, wurden routinemäßig lebensfähige Zellen ausgewählt, basierend auf Vorwärts- und Seitenstreuung, wobei sehr kleine und sehr granulare Ereignisse ausgeschlossen wurden. Um festzustellen, ob diese Gating-Strategie tote Zellen zuverlässig ausschloss, wurden die Proben mit 7-Aminoactinomycin D gefärbt. Zellen, die unmittelbar nach der Ernte analysiert wurden, wiesen etwa 10 % der 7-AAD-positiven Zellen auf, wenn ein typisches FSC-, SSC-Gate auf frisch isolierte Zellen aus dem Knochenmark angewendet wurde. Ein ähnlicher Anteil an toten Zellen war auch bei Stay 1 und Stay 3 der Kultur vorhanden.

Am fünften Tag wurde die Anzahl der toten Zellen innerhalb des Gates auf 5 % reduziert, so dass die Verwendung eines solchen Viabilitätsgates im Allgemeinen für die Sortierung am fünften Tag und danach geeignet ist. Die Durchflusszytometrie zeigte, dass in der Ly6C-negativen CD115-Population CD3, CD45R-positive Zellen über den Tag null bis drei stark persistierten. Am vierten Tag waren nur noch wenige CD3, CD45R-positive Zellen übrig, und am fünften und sechsten Tag waren keine CD3, CD45R-exprimierenden Zellen vorhanden; daher waren innerhalb von vier Tagen nach der Kultivierung in GM-CSF abstammungspositive Zellen im Wesentlichen nicht vorhanden und wurden an den Tagen fünf und sechs der Kultur überhaupt nicht nachgewiesen.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die zelluläre Zusammensetzung von der Länge der Kultur abhängt. Die Sortierung drei Tage nach der Ernte ergibt eine hohe Anzahl von Frühstadien und wenige Spätstadien und umgekehrt bei Kulturen, die nach fünf Tagen sortiert werden.