Name: Die Isolation und die Kultur der primären Epicardial Zellen aus menschlichen Erwachsenen und fetalen Herzens Exemplare (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Lernen Sie die Isolation und Kultur primärer humaner epikardialer Zellen aus Herzgewebe. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung epikardialer Zellverhaltensweisen und der epithelial-mesenchymalen Transition für kardiovaskuläre Forschung.

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Diese Forschung wird durch die niederländische Organisation für wissenschaftliche Forschung (NWO) (VENI 016.146.079) und ein LUMC Forschungsstipendium für AMS und LUMC Bontius Stichting (MJG) unterstützt.

Alle Experimente mit menschlichen Gewebeproben wurden von der Ethikkommission des Leiden University Medical Center genehmigt und entspricht der Deklaration von Helsinki. Alle Schritte werden mit steriler Ausrüstung in einer Zelle Kultur Strömung Schrank ausgeführt.
1. Vorbereitungen
<ol><li>Bereiten Sie EPDC Medium durch Dulbeccos modifizierten Eagle Medium (DMEM Low-Glucose) und Medium 199 (M199) im Verhältnis 1:1 mischen. Fügen Sie 10 % Hitze inaktiviert fötalen Rinderserum (FBS, Hitze inaktiviert für 25 min bei 56 ° C) und mit 100 U/mL Penicillin und 100 mg/mL Streptomycin ergänzt. Vorwärmen der EPDC Medium in einem 37 ° C-Wasserbad.</li>
	<li>Vorwärmen Trypsin 0.25%/EDTA (1:1) in einem 37 ° C-Wasserbad.</li>
	<li>Mantel-Brunnen mit Gelatine. Hinzufügen von 0,1 % Gelatine/PBS in jede Vertiefung und die Platten für mindestens 15 Minuten bei 37 ° c inkubieren Richtlinien für die erforderliche Zellplatte Kultur sind in Tabelle 1zusammengefasst. Entfernen Sie vorsichtig alle Flüssigkeit vor der galvanischen Zellen.</li>
	<li>Bereiten Sie eine Stammlösung von 10 mM SB431542 (SB), verdünnt in DMSO (Vorsicht). 50 µL-Aliquots in konischen Boden aus Polypropylen Zentrifuge Röhren, wie Eppendorf Röhren, und speichern Sie diese bei-20 ° C. Beachten Sie, dass SB Aliquote nur einmal aufgetaut werden können.</li>
</ol>2. Abruf und Speicherung von Erwachsenen und fetalen Herzens Exemplare
<ol><li>Speichern von menschlichen Erwachsenen Ohrmuscheln direkt nach Entnahme während der Operation in einen 50-mL-Tube mit 15 mL High-Glukose DMEM mit 10 % FBS, 100 U/mL Penicillin und 100 mg/mL Streptomycin bei 4 ° C. Proben sind in der Regel ca. 3-5 cm groß und kann gespeichert werden, bis zu 48 h nach Dissektion.</li>
	<li>Speichern Sie fetalen Herzen aus elektiven Abtreibung Material in EPDC Medium bei 4 ° C bis zu 24 h nach Isolierung erhalten. Verwenden Sie für dieses Protokoll Proben mit einem Gestationsalter zwischen 12-22 Wochen. Beachten Sie, dass das ganze Herz zur Isolation von der Epicardium verwendet werden kann.</li>
</ol>3. Isolation der Epicardial Schicht
<ol><li>Bereiten Sie in der Laminar-Flow Kabinett ein 100-mm-Zellkultur-Gericht mit PBS und ein separates Tröpfchen (~ 200 µL) PBS im Deckel. Füllen Sie eine 15-mL-Tube mit 5 mL vorgewärmten EPDC Medium.</li>
	<li>Legen Sie das Gewebe in der Zellkultur Schale gefüllt mit PBS. Stellen Sie sicher, dass das Gewebe während des Verfahrens häufig befeuchtet wird.</li>
	<li>Mit einem Stereomikroskop, so viel der epicardial Schicht aus der Gewebeprobe möglichst durch Abziehen mit Pinzette entfernen. Hinweis: Die Epicardium kann erkannt werden, da eine sehr dünne, transparente Schicht dicht an der Außenseite des Herzens (Abbildung 1A) eingehalten. Versuchen Sie, die Kontamination mit epicardial Fettgewebe und Blutgefäßen zu vermeiden, da dies die Isolierung behindern wird.</li>
	<li>Sammeln Sie Stücke von epicardial Gewebe in den Tropfen des PBS auf dem Deckel.</li>
	<li>Schneiden Sie das epicardial Gewebe in kleine Stücke (0,5 mm3) mit einem Skalpell (Abbildung 1 b) oder mit den scharfen Spitzen der kleinen Zange. Beachten Sie, dass die Stücke ein P1 weitergeben zu können sollten 000 pipettieren Tipp (Schritt 3,6).</li>
	<li>Das epicardial Gewebe 1 mL Trypsin hinzu und sammeln Sie die Stücke und Trypsin mit P1, 000 pipettieren Tipp. Übertragen Sie das Gewebe in eine 1,5 mL konische Zentrifugenröhrchen (Abbildung 1).</li>
	<li>Inkubieren Sie das Rohr im Wasserbad 37 ° C für 10 min, unter Schütteln bei ~ 60 u/min.</li>
	<li>Nehmen Sie das Rohr aus dem Wasserbad und reinigen Sie die Außenseite des Rohres mit 70 % Ethanol.</li>
	<li>Lassen Sie das Gewebe auf den Boden des Rohres (Abbildung 1) sinken und sorgfältig übertragen des Überstands epicardial Zellen um die 15-mL-Tube mit 5 mL EPDC Medium um die Trypsin zu inaktivieren.</li>
	<li>Füllen Sie das restliche Gewebe in die konische Zentrifugenröhrchen mit 1 mL Trypsin auf, und mischen Sie, indem Sie sanft auf und ab pipettieren.</li>
	<li>Wiederholen Sie Schritt 3,7 bis 3.10 zweimal. Im letzten Schritt nach insgesamt 30 min Inkubation Trypsin, übertragen der überstand und das restliche epicardial Gewebe in das Rohr mit EPDC Medium.</li>
	<li>Wenn alle Zellen in EPDC Medium gesammelt sind, durchlaufen Sie sanft die Aussetzung einer 10 mL Spritze mit einer 19-Gauge-Nadel in eine neue 15-mL-Tube die Zellen (Abbildung 1E) mechanisch zu trennen. Hinweis: Stellen Sie sicher, dass die Aussetzung zu homogenisieren, durch pipettieren rauf und runter, bevor man die Lösung durch die Nadel, die Nadel immer behindert zu verhindern.</li>
	<li>Um die Zellen weiter zu distanzieren, wiederholen Sie Schritt 3.12 mit einer 21-Gauge-Nadel.</li>
	<li>Legen Sie ein 100 µm Zelle Sieb auf einen 50-mL-Tube und übertragen Sie die epicardial Zellen auf das Sieb mit einer 10 mL-Pipette um alle restlichen Klumpen (Abb. 1F) zu entfernen-haltigem Medium zu.</li>
	<li>Waschen Sie das Sieb verbleibende Zellen sammeln durch pipettieren 5 mL EPDC Medium auf das Sieb.</li>
	<li>Pipettieren der Zellsuspension aus dem 50-mL-Röhrchen in eine 15-mL-Tube. Da Zellen an der Unterseite des Rohres zu versenken, schütteln Sie die Lösung leicht vor dem pipettieren. Hinweis: Dieser Schritt ist, zwar nicht notwendig hilft ein kleiner Schlauch Visualisierung des Geschosses nach Zentrifugation.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie bei 200 X g für 5 min bei Raumtemperatur (Abbildung 1).</li>
	<li>Entfernen Sie den überstand und Aufschwemmen der Zelle Pellet (Abbildung 1 H) in die gewünschte Lautstärke des EPDC Medium (Tabelle 1). Hinweis: Für fetale EPDCs verwenden Sie direkt EPDC Medium mit 10 µM von der ALK5-Kinase-Inhibitor (EPDC + SB). Adulten Zellen können während der ersten Passage ohne SB überzogen.</li>
	<li>Platte der Zellsuspension auf die Gelatine beschichtet-Kultur-Platten (Abbildung 1I). Die Größe des Brunnens hängt von der Größe der epicardial Gewebeprobe (Tabelle 1). Beachten Sie, dass niedrige Konfluenz das Auftreten von EMT induziert wird.</li>
	<li>Legen Sie die Zellen in den Inkubator für mindestens 48 h bei 37 ° C, 5 % CO2 damit die Zellen an der Kultur-Platte befestigen.</li>
</ol>(4) Kultur der EPDCs
<ol><li>Ergänzen Sie das EPDC + SB-Medium mindestens alle 3 Tage.</li>
	<li>Überprüfen Sie die Zellen mindestens alle 3 Tage das Mikroskop. Wenn die Zellen Konfluenz, d. h., erreichen wenn die Kultur-Platte voll mit Zellen bedeckt ist, die passage der Zellen im Verhältnis 1:2 Oberfläche. Beachten Sie, dass erreichen Konfluenz ~ 5-10 Tage dauern kann.<ol>
<li>Aspirieren Sie das Medium mit einem pipettieren oder eine Aspirationssystem mit z. B.einem Glas pipettieren.</li>
		<li>Waschen Sie die Zellen durch Zugabe von PBS zu den Zellen vorsichtig. Vorsichtig schwenken der Plattenrandes und Aspirieren der PBS.</li>
		<li>Hinzu kommt die Platte Trypsin. Drehen Sie vorsichtig die Platte, um alle Zellen mit Trypsin zu decken und die Platte für 1 min bei 37 ° c inkubieren Hinweis: Verwenden Sie als kleine Trypsin wie möglich (Hinweis: gut 200 µL pro Bohrloch einer 6 Teller)</li>
		<li>Tippen Sie auf die Platte, um die Zellen von der Unterseite der Platte mechanisch zu lösen. Verwenden Sie das Mikroskop, um visuell zu überprüfen, ob Zellen getrennt haben. Wenn dies nicht der Fall ist, eine zusätzliche Minute Kultur Zellplatte inkubieren.</li>
		<li>Fügen Sie das erforderliche Volumen der EPDC + SB-Medium auf die Zellen, Aufschwemmen durch pipettieren rauf und runter und die Zellsuspension auf eine neue Gelatine beschichtet-Kultur-Platte zu übertragen. Hinweis: im Allgemeinen können Zellen in einer gepflasterten Morphologie bis Durchgang 8 gehalten werden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Induktion von EMT in EPDCs
<ol><li>EMT induzieren, distanzieren Sie sich die Zellen mit Trypsin und Transfer der Zellen zu neuen Gelatine beschichtete Brunnen im Verhältnis 1:2 Oberfläche in EPDC + SB Medium, wie unter 4 beschrieben, und inkubieren Sie für mindestens 24 Stunden bei 37 ° C, 5 % CO2.</li>
	<li>Check ist wenn confluency 50-70 % und haben EPDCs eine Kopfsteinpflaster-Morphologie. Hinweis: Konfluenz beeinträchtigt die Fähigkeit der EPDCs EMT zu unterziehen.</li>
	<li>Aspirieren Sie das Medium aus den Zellen und die Zellen vorsichtig mit PBS waschen (siehe Punkt 4.2.1 - 4.2.2).</li>
	<li>Stimulieren Sie Zellen mit 1 ng/mL TGFβ3 in EPDC Medium zu, und legen Sie sie in einem Inkubator bei 37 ° C, 5 % CO2 für 5 Tage. Beachten Sie, dass während der Stimulation, TGFβ3-haltigem EPDC-Medium nicht wieder aufgefüllt werden muss.</li>
	<li>Die Zellen sind täglich zu überwachen. Nach 5 Tagen sind Zellen, die EMT erfuhr eine spindelförmige Morphologie (Abbildung 2A) anerkannt.</li>
	<li>Kultur spindelförmige EPDCs nach der Methode in 4 ohne Zusatz von SB oder TGFβ EPDC Medium beschrieben. Beachten Sie, dass in der Regel spindelförmig EPDCs bis Durchgang 20 kultiviert werden können.</li>
	<li>Überprüfen Sie das Auftreten von EMT mit immunofluorescent Färbung mit Antikörpern gegen die mesenchymalen Marker αSMA oder Vimentin oder durch Phalloidin, um die Bildung von F-Aktin Stress Fasern (Abb. 2 b) zu erkennen, oder mittels qRT-PCR für EMT-Genen ( z.B., WT1, Periostin, Col1A1, αSMA, N-Cadherin, MMP3, Schnecke, Schnecke) (Abbildung 2 und Tabelle 2).</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Hier beschreiben wir ein ausführliches Protokoll zu isolieren und Kultur primäre epicardial Zellen aus menschlichen Erwachsenen und fetalen Herzen abgeleitet. Umfassende Charakterisierung dieser Zellen wurde bisher veröffentlichten17. Wir haben gezeigt, dass beide Zelltypen als Epithelzellen Kopfsteinpflaster-wie, wenn mit dem ALK5-Kinase-Inhibitor SB431542 kultiviert aufrechterhalten werden können. EMT ist fester Bestandteil des epicardial Aktivierung in Vivo während der Entwicklung und ...

Die Epicardium, eine einzellige Epithelschicht, dass Umschläge das Herz ist von entscheidender Bedeutung für die kardiale Entwicklung und Reparatur (rezensiert in Smits Et al. 1). Entwicklungsgeschichtlich, die Epicardium ergibt sich aus der Proepicardial-Orgel, eine kleine Struktur, die am Fuße des Herzens entwickeln. Um Entwicklungsstörungen Tag E9.5 Maus und 4 Wochen Post-Konzeption in der Human-beginnen Zellen migrieren aus dieser Blumenkohl-Struktur und decken die entwickelnden Myokard-2. Sobald ein einzelnes epitheliale Zellschicht gebildet wird, wird ein Teil der epicardial Zellen epithelialen, Mesenchymale Transition (EMT) unterzogen. Während EMT Zellen verlieren ihre epithelialen Eigenschaften wie Zell-Zell-Verwachsungen, und erhalten einen mesenchymalen Phänotyp verleiht ihnen die Fähigkeit, in den Entwicklungsländern Myokard einwandern. Die gebildeten epicardial abgeleiteten Zellen (EPDCs) können in mehrere kardiale Zelltypen, einschließlich der Fibroblasten, glatten Muskelzellen und potenziell Kardiomyozyten und Endothelzellen3, unterscheiden, obwohl Zell-Differenzierung des letzteren zwei Populationen bleibt Gegenstand der Debatte (rezensiert in Smits Et al. ( 4). Darüber hinaus bietet die Epicardium lehrreich Parakrine Signale an den Herzmuskel, deren Wachstum und Vaskularisierung5,6,7,8zu regulieren. Mehrere Studien haben gezeigt, dass Sehbehinderte epicardial Bildung zu Entwicklungsschäden im Herzmuskel9,10, Gefäßsystem11und Wärmeleitung System12 führt, betont das wesentliche Beitrag von Epicardium zur Bildung des Herzens.
Obwohl Erwachsene inmitten der Epicardium als ruhende Schicht vorhanden ist, wird es bei der Ischämie13reaktiviert. Epicardial Reaktivierung nach der Verletzung mehrere rekapituliert die Prozesse beschrieben für kardiale Entwicklung, einschließlich Verbreitung und EMT14, wenn auch weniger effizient. Interessant ist, obwohl der genaue Mechanismus ist nicht vollständig geklärt, die epicardial Beitrag zur Reparatur kann durch Behandlung mit z. B.Thymosin β415 verbessert werden oder geändert VEGF-A mRNA16, wodurch verbesserte Herz-Kreislauf Funktion nach Myokardinfarkt. Die Epicardium gilt daher eine interessante Zelle Quelle, endogene Reparatur des Geschädigten Herzens zu verbessern.
Mechanismen der kardialen Entwicklung sind oft bei Verletzungen, obwohl auf eine weniger effiziente Weise zusammengefaßt. Auf der Suche nach epicardial Aktivatoren ist es sehr wichtig, dass wir bestimmen und die volle Kapazität des fetalen und adulten Epicardium vergleichen. Aus therapeutischer Sicht ist es darüber hinaus wichtig, dass neben der Tierversuche, wir wissen in Bezug auf die Reaktion des menschlichen Epicardium erweitern. Hier beschreiben wir eine Methode zur Isolierung und Kultur menschlichen Erwachsenen und fetalen epicardial abgeleitete Zellen (EPDCs) in einer epithelialen Zellen ähnliche Morphologie und EMT zu induzieren. Mit diesem Modell wollen wir entdecken und vergleichen Sie Erwachsene und fetalen epicardial Zelle Verhalten.
Der Hauptvorteil dieses Protokolls ist die Verwendung von epicardial Menschenmaterial, die nicht gründlich untersucht worden. Wichtig ist, sieht das beschriebene Isolation und Zelle Kultur-Protokoll eine einzige einheitliche Methode um beide fetalen und adulten Kopfsteinpflaster EPDCs, so dass einen direkten Vergleich zwischen diesen beiden Quellen abzuleiten. Zusätzlich, da die Epicardium isoliert aufgrund seiner Lage ist, ist sichergestellt, dass die Zellen tatsächlich epicardially abgeleiteten17.
Während menschliche EPDC Isolierung Methoden bereits aufgebaut haben, setzen diese meist auf Auswuchs Protokolle wo Stücke von Herz- oder epicardial Gewebe auf eine Zelle Kultur Teller18,19überzogen sind. Dieser Ansatz wählt dabei speziell für Zellen, die teilweise ihre epithelialen Phänotyps verlieren, um zu migrieren, und sind anfälliger für spontane EMT unterziehen. In das aktuelle Protokoll erfolgt die Epicardium zuerst in eine einzelne Zelle Lösung erlaubt die isolierte EPDCs um ihre epitheliale Status beizubehalten. Diese Methode stellt daher eine solide in-Vitro -Modell, um epicardial EMT zu studieren.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco' s modifizierter Eagle" s mittel + GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>21885-025</td><td></td></tr><tr><td>mittel 199&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>31150-022</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin 0,25%</td><td>Invitrogen</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin G Natriumsalz</td><td>Roth</td><td>HP48</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycinsulfat</td><td>Roth</td><td>HP66</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin 1:250 aus der Bauchspeicheldrüse des Rindes</td><td>Serva</td><td>37289</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E4884</td><td></td></tr><tr><td>Gelatine aus Schweinehaut</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>Kulturplatten 6 well</td><td>Greiner bio-one</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>Kulturplatten 12 well</td><td>Corning</td><td>3512</td><td></td></tr><tr><td>Kulturplatten 24 well</td><td>Greiner bio-one</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>SB 431542</td><td>Tocris</td><td>1614</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td><td>Merck</td><td>102931</td><td></td></tr><tr><td>100-1000&Mikro; L Gefilterte Pipettenspitzen</td><td>Corning</td><td>4809</td><td></td></tr><tr><td>10-ml-Pipette</td><td>Greiner bio-one</td><td>607180</td><td></td></tr><tr><td>5-ml-Pipette</td><td>Greiner bio-one</td><td>606180</td><td></td></tr><tr><td>Zellkulturschale 100/20 mm</td><td>Greiner bio-one</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010056</td><td>Oder hausgemachte und sterilisierte</td></tr><tr><td>Eppendorf-Röhrchen 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td>0030120086</tr><tr><td>15-ml-Zentrifugenröhrchen</td><td>Greiner bio-one</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>50-ml-Zentrifugenröhrchen</td><td>Greiner bio-one</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Spritze</td><td>Becton Dickinson</td><td>305959</td><td></td></tr><tr><td>Nadeln 19 Gauge</td><td>Becton Dickinson</td><td>301700</td><td></td></tr><tr><td>Nadeln 21 Gauge</td><td>Becton Dickinson</td><td>304432</td><td></td></tr><tr><td>EASYstrainer Zellsiebe, 100 & Mikro; m</td><td>Greiner bio-one</td><td>542000</td><td></td></tr><tr><td>TGF&beta; 3&nbsp;</td><td>Forschung & Forschung D-Systeme</td><td>243-B3</td><td></td></tr><tr><td>Monoklonales Anti-Aktin, &alpha;-Glatte Muskulatur</td><td>Sigma</td><td>A2547&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A31570</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td><td>Invitrogen</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Ausrüstung<</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>strong>Name</td>strong<td><>Unternehmen</td><td>Katalognummer</td><td>Kommentare </td></tr><tr><td>Pipette P1.000</td><td>Gilson</td><td>F123602</td><td></td></tr><tr><td>Pipettierhilfe</td><td>Integra</td><td>155 015</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Leica</td><td>M80</td><td></td></tr><tr><td>Inverslichtmikroskop</td><td>Olympus</td><td>CK2</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5702</td><td></td></tr><tr><td>Wasserbad</td><td>GFL</td><td>1083</td><td></td></tr></tbody></table>

die isolation und die kultur der primären epicardial zellen aus menschlichen erwachsenen und fetalen herzens exemplare

The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens

Epicardium, eine epitheliale Zellschicht auf das Myokard hat eine wesentliche Rolle während der kardialen Entwicklung, sowie die Reparatur als Reaktion des Herzens nach ischämischen Verletzung. Wenn aktiviert, durchlaufen epicardial Zellen ein Verfahren bekannt als epitheliale Mesenchymale Transition (EMT) Zellen zu regenerierenden Myokard zu bieten. Darüber hinaus trägt die Epicardium durch Sekretion von wesentlichen Parakrine Faktoren. Um das regenerative Potential der Epicardium vollständig zu verstehen, ist eine menschliche zellenmodell erforderlich. Hier beschreiben wir eine neuartige Zellmodell der Kultur um menschliche Erwachsene und fetalen Herzgewebe primäre epicardial abgeleitete Zellen (EPDCs) abgeleitet. Um EPDCs zu isolieren, ist die Epicardium von außen auf das Herz-Exemplar seziert und zu einem einzigen Zellsuspension verarbeitet. Als nächstes sind EPDCs überzogen und in EPDC die ALK-5-Kinase-Inhibitor SB431542 weiterhin ihre epithelialen Phänotyps-haltigem Medium kultiviert. EMT wird durch Stimulation mit TGFβ induziert. Diese Methode ermöglicht zum ersten Mal die Untersuchung des Prozesses der menschlichen epicardial EMT in einer kontrollierten Umgebung und ermöglicht mehr Einblick in die Secretome des EPDCs, das Herz Regeneration helfen kann. Darüber hinaus ermöglicht dieser einheitlichen Ansatz zum direkten Vergleich der menschlichen Erwachsenen und fetalen epicardial Verhalten.

Hier beschreiben wir eine einfache Protokoll zur EPDCs von menschlichen Erwachsenen und fetalen Herzgewebe (Abbildung 1) zu isolieren. Dieses Protokoll nutzt die verkehrsgünstige Lage der Epicardium an der Außenseite des Herzens (Abbildung 1A). Färbung des Herzens Ohrmuschel nach Dissektion zeigt, dass die WT1 + Epicardium entfernt wird, während die zugrunde liegenden Subepicardial extrazelluläre Matrix und Herzmuskelgewebe intak...

Die Epicardium spielt eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung und Reparatur des Herzens durch die Bereitstellung von Zellen und Wachstumsfaktoren der myokardialen Wand. Hier beschreiben wir eine Methode, um menschliche primäre epicardial Zellkulturen, die die Studie und den Vergleich ihrer Entwicklungs- und Erwachsenen Eigenschaften ermöglicht.

Die Isolation und die Kultur der primären Epicardial Zellen aus menschlichen Erwachsenen und fetalen Herzens Exemplare

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, humane epikardiale Zellen zu isolieren und zu kultivieren, um das Verhalten von Epikardzellen zu untersuchen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Herzforschung zu beantworten, z. B. wie das Epikard während der kardialen Entwicklung und Erkrankung aktiviert wird. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie auf menschliche Herzgewebeproben angewendet werden kann, was bei der Übertragung der Ergebnisse in ein klinisches Umfeld helfen kann.Unser Protokoll beschreibt die Untersuchung des epithelialen zu mesenchymalen Übergangs von epikardialen Zellen. Es kann aber auch verwendet werden, um die Proliferation oder Sekretion von Faktoren zu untersuchen. Füllen Sie zunächst eine 100-Millimeter-Zellkulturschale mit PBS in den Laminar-Flow-Schrank.Geben Sie etwa 200 Mikroliter PBS in den Deckel und geben Sie dann 5 Milliliter vorgewärmtes EPDC-Medium in ein 15-Milliliter-Röhrchen. Legen Sie das Herzgewebe, das aus einem erwachsenen menschlichen Herzen isoliert wurde, in die Schale. Verwenden Sie unter einem Stereomikroskop eine Pinzette, um die Epikardschicht vorsichtig zu entfernen.Als nächstes sammeln Sie die Epikardgewebestücke im Lid und schneiden sie mit einem Skalpell in 0,5 Kubikmillimeter große Stücke. Geben Sie einen Milliliter Trypsin zu den Gewebestücken. Übertragen Sie sie mit einer P1000-Pipettenspitze in ein konisches 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.Inkubieren Sie das Röhrchen dann 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in einem Wasserbad unter ständigem Schütteln bei 60 U/min. Reinigen Sie das Röhrchen nach der Inkubation mit 70%igem Ethanol und lassen Sie das Gewebe am Boden absetzen. Übertragen Sie anschließend den Überstand, der Epikardzellen enthält, vorsichtig in ein 15-Milliliter-Röhrchen mit 5 Millilitern EPDC-Medium, um das Trypsin zu inaktivieren.Geben Sie einen Milliliter Trypsin zu dem restlichen Gewebe im Zentrifugenröhrchen und mischen Sie es durch leichtes Pipettieren. Wiederholen Sie dann den Schritt der Trypsin-Inkubation noch zwei weitere Male. Nach der endgültigen Entnahme wird das restliche Epikardgewebe in das Röhrchen mit der Zellsuspension überführt.Homogenisieren Sie die Zellsuspension gründlich durch vorsichtiges Pipettieren, verwenden Sie dann eine 10-Milliliter-Spritze mit einer 19-Gauge-Nadel, um die Zellen in der Suspension mechanisch zu dissoziieren, und überführen Sie die Suspension in ein frisches 15-Milliliter-Röhrchen. Um die Zellen weiter zu dissoziieren, führen Sie die Zellsuspension mit einer 21-Gauge-Nadel durch eine 10-Milliliter-Spritze. Verwenden Sie anschließend eine 10-Milliliter-Pipette, um die Zellsuspension auf ein 100-Mikrometer-Zellsieb auf einem 50-Milliliter-Röhrchen zu übertragen.Lassen Sie die Suspension durch das Sieb laufen, um alle verbleibenden Klumpen zu entfernen. Geben Sie 5 Milliliter EPDC-Medium auf das Sieb, um die Restzellen zu sammeln. Nach einem kurzen, schonenden Mischen die Zellsuspension in ein 15-Milliliter-Röhrchen überführen und bei 200 g fünf Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren.Entfernen Sie anschließend den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in EPDC-Medium. Entfernen Sie das Beschichtungsmedium von der mit Gelatine beschichteten Platte und fügen Sie eine angemessene Menge Zellsuspension hinzu. Inkubieren Sie die Zellen mindestens 48 Stunden lang bei 37 Grad Celsius in 5% CO2.Um Epikardzellen zu kultivieren, füllen Sie das Medium alle drei Tage auf. Verwenden Sie EPDC-Medium, das mit 10 mikromolaren ALK-5-Kinase-Inhibitoren SB431542 ergänzt wird. Verwenden Sie ein Mikroskop, um die Zellen während der Kulturperiode zu inspizieren.Bei Erreichen der Konfluenz passieren die Zellen in einem Oberflächenverhältnis von 1:2. Um die Zellen zu passieren, verwenden Sie eine Pipette oder einen Aspirator, um das Medium zu entfernen, und fügen Sie den Zellen vorsichtig PBS hinzu. Drehen Sie die Platte vorsichtig und saugen Sie PBS an.Fügen Sie Trypsin hinzu und drehen Sie die Platte vorsichtig, um sie über die Zellen zu verteilen. Inkubieren Sie die Platte eine Minute lang bei 37 Grad Celsius. Tippen Sie anschließend auf die Platte, um die Zellen mechanisch zu lösen, und verwenden Sie ein Mikroskop, um die Zellablösung zu bestätigen.Geben Sie das erforderliche Volumen EPDC-Medium, ergänzt mit 10-mikromolaren SB431542, auf die Platte. Mischen Sie durch vorsichtiges Pipettieren und geben Sie die Suspension auf eine neue, mit Gelatine beschichtete Platte. Um EMT zu induzieren, passieren Sie die Zellen unter Verwendung des zuvor beschriebenen Protokolls und inkubieren Sie mindestens 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius in 5 % CO2.Nach Erreichen einer Konfluenz von 50-70 % aspirieren Sie das Medium und waschen die Zellen mit PBS. Stimulieren Sie anschließend die Zellen mit einem Nanogramm pro Milliliter TGF beta-3 supplementiertem EPDC-Medium und inkubieren Sie fünf Tage lang bei 37 Grad Celsius in 5% CO2 und überwachen Sie die Zellen täglich. Nach fünf Tagen sollten Zellen, die sich einer EMT unterzogen haben, eine spindelförmige Morphologie annehmen.Kultivieren Sie diese Zellen mit dem zuvor beschriebenen Protokoll unter Verwendung von EPDC-Medium ohne jegliche Supplementierung. Um die korrekte Dissektion der Epikardschicht zu validieren, wird menschliches adultes Herzgewebe vor und nach der Dissektion mit WT1- und cTnI-Antikörpern immungefärbt. Das Fehlen des Epikardmarkers WT1 nach der Dissektion deutet auf eine vollständige Entfernung der Epikardschicht hin.Das Vorhandensein des Myokardgewebemarkers cTnI deutet darauf hin, dass die subepikardiale extrazelluläre Matrix und das Myokardgewebe nach der Dissektion intakt sind. Adulte EPDCs, die in Gegenwart eines ALK-5-Kinase-Inhibitors kultiviert werden, sollten die Kopfsteinpflastermorphologie beibehalten. Der Übergang von der Kopfsteinpflastermorphologie zu einer spindelförmigen Morphologie von EPDCs nach TGF beta-3-Behandlung deutet auf einen Übergang von Epithel zu Mesenchym hin.Zur weiteren Bestätigung der EMT werden EPDCs vor und nach der TGF-beta-3-Behandlung mit einem mesenchymalen Marker alpha Glattmuskel-Aktin immungefärbt. Das Vorhandensein von mesenchymalen Markern in TGF beta-3-behandelten Zellen stellt die Induktion von EMT sicher. Hier sind die mRNA-Spiegel von EMT-verwandten Genen in adulten EPDCs dargestellt.Die TGF-beta-3-induzierte Herunterregulierung des epikardialen Markers WT1 und die Hochregulierung der mesenchymalen Marker MMP3, N-Cadherin, Periostin, alpha-SMA und Kollagen 1A1 bestätigen die Induktion von EMT. Wenn Sie diese Technik ausprobieren, ist es wichtig, daran zu denken, sie so effizient wie möglich auszuführen. Eine kürzere Isolationszeit verbessert das Überleben der Zellen.Einmal gemeistert, kann diese Technik in etwa 60 Minuten durchgeführt werden. Da diese Methode auf Primärzellen basiert, kann sich jede Isolierung anders verhalten. Daher ist es wichtig, die Zellmorphologie und -dichte zu überwachen, bevor ein Experiment beginnt.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man mit menschlichen primären Epikardzellen umgeht.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

In diesem Protokoll w e identifiziert eine neue Population von Melanozyten-ähnlichen Zellen (auch als Herz Melanozyten) in den Herzen von Mäusen und Menschen, die an Vorhofrhythmusstörungen löst bei Mäusen bei.

Isolieren Primäre Melanozyten-ähnlichen Zellen aus der Maus Herz

Primäre Zellkultur ist eine nützliche Technik für die Analyse von spezifischen Populationen von Zellen, insbesondere von transgenen Maus-Embryonen in bestimmten Entwicklungsstadien. Hierin werden embryonalen Ventrikel seziert und distanziert, und Antikörper-konjugierten Perlen erkennen und trennen die Endothelzellen für die weitere Analyse.

Isolierung von embryonalen ventrikuläre Endothelzellen

Aktuelle Erkenntnisse über die zellulären Grundlagen von Herzerkrankungen meist stützt sich auf Studien an Tiermodellen. Hier beschreiben wir und Validierung einer neuen Methode, um einzelne lebende Herzmuskelzellen von kleinen chirurgischen Proben menschlichen Myokard zu erhalten. Menschen Kardiomyozyten können für elektrophysiologische Studien-und Drogentests verwendet werden.

Isolierung und funktionelle Charakterisierung der Menschen ventrikuläre Kardiomyozyten von Fresh Chirurgische Proben

Hier beschreiben wir Methoden zur Isolierung primärer Maus-Epikardzellen durch einen Auswuchskultur-Assay und zur Bewertung der funktionellen Migration epikardialer Zellen (EPDC) unter Verwendung eines ex vivo Herzkultursystems. Diese Protokolle eignen sich zur Identifizierung genetischer und chemischer Modulatoren des epikardialen Epithel-zu-mesenchymalen Übergangs (EMT) und der Motilität.

Epikardiale Outgrowth Kulturtest und<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Beurteilung von Epikardiale abgeleiteten Zellmigration

Das Epikard ist eine essentielle Quelle für multipotente kardiovaskuläre Vorläuferzellen und parakrine Faktoren, die für die kardiovaskuläre Entwicklung und Regeneration benötigt werden. Wir beschreiben hier eine Methode zur Kultivierung embryonaler Epikardzellen von Mäusen.

In - vitro - Kultur von Epikardiale Zellen aus embryonalen Maus - Herz

Menschliche Herzgewebe birgt multi perivaskuläre Vorläuferzellpopulationen, die für myokardiale Regeneration geeignet sein können. Die hier beschriebene Technik ermöglicht die gleichzeitige Isolierung und Reinigung von zwei multi stromalen Zellpopulationen , die mit nativem Blutgefäße, dh CD146 + CD34 - Perizyten und CD34 + CD146 - Adventitia - Zellen aus dem menschlichen Herzmuskel.

Isolierung von Perivaskuläre multipotenten Vorläuferzellpopulationen aus menschlichem Herzgewebe

Mehrere Protokolle wurden entwickelt und beschrieben für die Isolierung von verschiedenen Herzzelltypen von einem Rattenherz. Hier wird ein optimiertes Protokoll beschrieben, das die Isolierung von hochwertigen Hauptkardiometertypen (Kardiomyozyten, Endothelzellen und Fibroblasten) aus einer einzigen Präparation ermöglicht, wodurch die experimentellen Kosten reduziert werden.

Gleichzeitige Isolierung von hochwertigen Kardiomyozyten, Endothelzellen und Fibroblasten aus einem erwachsenen Rattenherz

Ziel dieser Arbeit ist es, eine Methode zu entwickeln, um Kardiomyozyten reproduzierbar vom Erwachsenenherz zu isolieren und DEN DNA-Gehalt und die Keimbildung zu messen.

Isolierung von Kardiomyozyten aus festen Herzen für die Immunzytochemie und Ploidie-Analyse

Wir präsentieren ein Protokoll zur Isolierung von endokardialen und koronaren Endothelzellen aus Rattenherzen durch sequentielle Gewebeverdauung in einem Verdauungspuffer, Zellsammlung aus rezidivierenden Zentrifugenzyklen und Zellreinigung mit rattenfeindlichen CD31-Mikroperlen.

Isolierung von Endokardialen und koronaren Endothelzellen aus der ventrikulären freien Wand des Rattenherzes

Präsentiert wird ein Protokoll zur Isolierung von humanen und tierischen ventrikulären Kardiomyozyten aus vibratomegeschnittenen Myokardscheiben. Hohe Erträge von kalziumtoleranten Zellen (bis zu 200 Zellen/mg) können aus kleinen Gewebemengen (&lt;50 mg) gewonnen werden. Das Protokoll gilt für Myokard, das bis zu 36 h kalten Ischämien ausgesetzt ist.

Isolierung menschlicher ventrikulärer Kardiomyozyten aus Vibratome-Cut Myokardscheiben

Eine Methode wird beschrieben, um Myozyten und Nicht-Myozyten gleichzeitig von den Vorhöfen und Ventrikeln eines einzelnen erwachsenen Mausherzens zu isolieren. Dieses Protokoll führt zu konsistenten Erträgen von hochlebensfähigen Herzmyozyten und Nicht-Myozyten und beschreibt optimale zellspezifische Kulturbedingungen für Phänotypisierung und In-vitro-Analyse.

Gleichzeitige Isolierung und Kultur von Atrial Myozyten, ventrikulären Myozyten und Nicht-Myozyten aus einem erwachsenen Mausherz

Lernen Sie die Isolation und Kultur primärer humaner epikardialer Zellen aus Herzgewebe. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung epikardialer Zellverhaltensweisen und der epithelial-mesenchymalen Transition für kardiovaskuläre Forschung.

Die Isolation und die Kultur der primären Epicardial Zellen aus menschlichen Erwachsenen und fetalen Herzens Exemplare

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