Eine einfache Durchflusszytometrie basierten Test um festzustellen, In-vitro- Antikörper abhängige Verbesserung des Dengue-Virus mit Zika-Virus genesenden Serum

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Fähigkeit von Seren zu bestimmen, die von mit dem Zika-Virus infizierten Rhesusaffen entnommen wurden, um eine antikörperabhängige Verstärkung der Dengue-Virusinfektion in vitro zu vermitteln. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Zusammenhang mit der antikörperabhängigen Verstärkung der Dengue-Infektion durch Zika-Virus-induzierte kreuzreaktive Antikörper zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie hochwertiger, einfacher und leicht durchzuführen ist.

Dieses Verfahren wird von William Valiant, einem Doktoranden der aufstrebenden Infektionskrankheit, in meinem Labor demonstriert. Beginnen Sie mit dem Auftauen der Serumproben bei Raumtemperatur. Nach dem Auftauen 100 Mikroliter jeder Serumprobe in ein steriles Röhrchen umfüllen und 30 Minuten lang bei 56 Grad Celsius erhitzen und aktivieren.

Nehmen Sie als Nächstes 10-fache serielle Verdünnungen der Serumprobe vor, die von eins zu eins bis eins in kaltem RPMI 10 reichen. Übertragen Sie dann 10 Mikroliter jeder verdünnten Serumprobe in die Vertiefungen einer sterilen 96-Well-V-Bodenplatte. Tauen Sie anschließend Dengue-Viruspartikel eins, zwei, drei und vier Proporter-Viruspartikel in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad auf, wobei ein Volumen von etwa 170 Mikrolitern jedes RVP pro Serumprobe sichergestellt wird.

Nach dem Auftauen die Röhrchen mit den RVPs sofort auf Eis legen. Pipettieren Sie dann 10 Mikroliter RVPs in die Vertiefungen mit den Serumprobenverdünnungen in die Kontrollvertiefungen ohne Serum. Mischen Sie gründlich, indem Sie fünf- bis zehnmal auf und ab pipettieren.

Übertragen Sie die 96-Well-V-Bodenplatte in einen Inkubator und inkubieren Sie eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius in Gegenwart von 5 % Kohlendioxid. Während die 96-Well-V-Bodenplatte inkubiert, reinigen Sie die Oberfläche der Biosicherheitswerkbank mit 70 % Ethanol und lassen Sie das UV-Licht 15 Minuten lang laufen. Nehmen Sie dann einen vollständig konfluenten T-75-Kolben mit K562-Zellen aus dem Inkubator.

Mischen Sie die Zellen mit einer sterilen Fünf-Millimeter-Pipette gut und geben Sie fünf Milliliter in ein steriles konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Nehmen Sie anschließend 10 Mikroliter Zellen aus dem Röhrchen, mischen Sie es mit 10 Mikrolitern Trypanblau und geben Sie es in ein Hämozytometer. Zählen Sie die Zellen und berechnen Sie die Gesamtzahl der Zellen.

Nach dem Zentrifugieren der Zellen bei 12-Hundertfach-G für 10 Minuten wird der Überstand dekantiert und die Zellen in warmem RPMI 10 bei einer Konzentration von 80 Tausend Zellen pro 30 Mikroliter Medium wieder suspendiert. Nachdem Sie die 96-Well-V-Bodenplatte aus dem Inkubator genommen haben, übertragen Sie 30 Mikroliter K562-Zellen auf jede Wand der 96-Well-V-Bodenplatte. Und mischen Sie gründlich, indem Sie fünf- bis zehnmal auf und ab pipettieren.

Stellen Sie die Platte dann für eine Stunde wieder in den Inkubator. Nach der Inkubation zentrifugieren Sie die Platte fünf Minuten lang bei 1200 Mal G. Nach der Zentrifugation dekantieren Sie das Medium aus den Vertiefungen, indem Sie die Platte auf den Kopf stellen und in einen Behälter mit 10 % Bleiche legen.

Waschen Sie dann die Zellen in jeder Wand, indem Sie sie in 125 Mikrolitern warmem RPMI 10 wieder aufhängen und wie zuvor zentrifugieren. Nach dem Dekantieren der letzten Wäsche 100 Mikroliter warmes RPMI 10 in jede Vertiefung geben. Mit der Pipette auf und ab mischen und die Platte 48 Stunden lang bei 37 Grad Celsius in Gegenwart von 5 % Kohlendioxid inkubieren.

Zwei Tage später nehmen Sie die Platte aus dem Inkubator und stellen Sie sie in eine Biosicherheitswerkbank um. Mischen Sie den Inhalt jeder Vertiefung mit einer Mehrkanalpipette und geben Sie ihn auf eine 96-Well-U-Bodenplatte. Spülen Sie jede Vertiefung der 96-Well-V-Bodenplatte mit 100 Mikrolitern 1%Paraformaldehyd und PBS und übertragen Sie die restlichen Zellen und PBS in die entsprechenden Wells in der 96-Well-U-Bodenplatte.

Mit einer Mehrkanalpipette gründlich mischen. Decken Sie die Platte mit Alufolie ab und lassen Sie sie 30 Minuten im Inkubator ruhen, um die Zellen zu fixieren. Bereiten Sie das Durchflusszytometer vor, indem Sie ungefärbte K562-Zellen laufen lassen, um die Seiten- und Vorwärtsstreueinstellungen mit dem Ethylonkanal für die GFP-Floreszenz zu kalibrieren.

Erfassen Sie dann 30.000 bis 50.000 Zellen aus jeder Probe. Stellen Sie mit Hilfe der Durchflusszytometrie-Analysesoftware das erste Gate basierend auf der Vorwärtsstreufläche im Vergleich zur Vorwärtsstreuhöhe so ein, dass einzelne Zellen einbezogen und autofluoreszierende Dublets von der Analyse ausgeschlossen werden. Berechnen Sie den durchschnittlichen Prozentsatz der GFP-positiven Zellen für jede Bedingung und berechnen Sie dann die Faltverstärkung der Infektion für jede Serumverdünnung.

Verbesserung der Faltung des Diagramms auf der y-Achse im Vergleich zur Verdünnung auf der x-Achse und Durchführung einer statistischen Analyse mit ANOVA, gefolgt von Tukeys Post-hoc-Test für mehrere Vergleiche. Hier sind Daten eines repräsentativen Tieres mit Dengue-Virus-Ein-Reporter-Viruspartikeln dargestellt. Der Prozentsatz der GFP-positiven Zellen für die Kontrollprobe ohne Serum betrug 0,253 %Die unverdünnte Serumprobe war 2,58 % GFP-positiv.

Der Anteil der GFP-positiven Zellen erreichte einen Höchstwert von 12,8 % bei der anschließenden Serumverdünnung von ein bis zehn, gefolgt von 0,735 % bei einer Verdünnung von eins bis hundert und 0,022 % bei einer Verdünnung von ein- bis tausend. Die Antikörper-abhängige Verstärkung der Dengue-Infektion wurde für die vier Dengue-Virus-Serentypen untersucht. Die Daten zeigen, dass das Serum, das 16 Wochen nach der Infektion entnommen wurde, die Infektion von K562-Zellen durch alle Dengue-Virus-Seren bei einer Verdünnung von eins bis zehn signifikant erhöhte.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in 48 Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, die Daten innerhalb von ein bis zwei Stunden nach Abschluss des letzten Fixationsschritts von 30 Minuten zu erfassen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit infiziertem Serum äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie PSA und BSL2-Level getroffen werden sollten.