Name: Eine einfache Durchflusszytometrie basierten Test um festzustellen, In-vitro- Antikörper abhängige Verbesserung des Dengue-Virus mit Zika-Virus genesenden Serum (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Erfahren Sie eine einfache Durchflusszytometrie-Methode zur Untersuchung der antikörperabhängigen Verstärkung von Dengue-Virus-Infektionen durch Zika-Virus-Serum. Dieses Protokoll ermöglicht Hochdurchsatzanalysen für Infektionskrankheiten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Das beschriebene Projekt wurde aus Mitteln der Sonstiges Services University of Health Sciences, JJM unterstützt. Meinungen oder Aussagen, die hierin enthaltenen sind die privaten, der Autoren und nicht um sein als offizielle oder reflektierenden die Aussicht auf das Department of Defense, Sonstiges Dienstleistungen University Health Sciences oder einer anderen Agentur der USA ausgelegt Regierung.
WGV alle Experimente durchgeführt und analysiert die Daten; JJM konzipiert und betreut die Studie; WGW und JJM, schrieb die Zeitung.

Die Serumproben verwendet, um die hier beschriebenen Protokoll demonstrieren wurden von Rhesus-Makaken erhalten, die untergebracht und umsorgt in Übereinstimmung mit lokalen, staatlichen und bundesstaatlichen Richtlinien in einem Verein für die Bewertung und Zulassung von Laboratory Animal Care International (AAALAC)-akkreditierten Einrichtung. Alle Tierversuche wurden überprüft und durch institutionelle Animal Care and Use Committee genehmigt und Proben wurden durch eine sharing-Protokoll übernommen.
1. Tag 1
Hinweis: Führen Sie die Schritte, die unten beschriebenen in einem sterilen Laminar-Flow Biosafety Kabinett für Gewebekultur in einem Labor BSL-2 verwendet.
<ol><li>Tauen Sie die Serumproben bei Raumtemperatur auf und 100 µL jeder Serum-Probe in ein steriles Röhrchen. Wärme für 30 min bei 56° C in einem Wasserbad oder einer Temperatur einstellbar Thermomixer zu inaktivieren. 10-divisibel serielle Verdünnungen der Serumprobe von 1:1 bis hin zu 1:1,000 mit kalten RPMI-10 (RPMI mit 10 % fötalen Rinderserum) zu machen.</li>
	<li>10 µL seriell verdünnte Serumprobe in jede Vertiefung einer sterilen 96-Well-V-Boden-Platte zu übertragen. Gehören Sie zwei Sätze von Kontroll-Vertiefungen, RPMI-10 mit RVP nur und ohne Serumprobe und RPMI-10 nur ohne RVP und Serumprobe. Jede Serumprobe und RPMI-10 Kontrollen in Triplicates einrichten.</li>
	<li>Das Dengue-Fieber-1, 2, 3 und 4 RVP von-80 ° C Gefrierschrank und Tauwetter zu entfernen Sie in einem 37 ° C-Wasserbad. Übertragen Sie die aufgetauten RVP sofort zu Eis. Erhalten rund 170 µL RVP für jede Serumprobe (10 µL des RVP X 3 Brunnen für jeden Serum-Verdünnung (1:1, 01:10, 1: 100, 1:1, 000) und 10 µL des RVP X 3 Brunnen für jeden RPMI-10 mit RVP Steuern nur Brunnen).</li>
	<li>Pipette 10 µL des RVP in jede gut der 96-Well V-Bodenplatte mit der Serumprobe und RPMI-10 mit RVP (kein Serum) Kontroll-Vertiefungen. Fügen Sie keine RVP RPMI-10 nur (keine Serumprobe und keine RVP) Brunnen. Mischung gründlich von oben und unten pipettieren 5 – 10 mal. Fügen Sie 10 µL kalter RPMI-10 anstelle von RVP auf jedes kalte RPMI-10 nur (keine Serumprobe und keine RVP) Brunnen kontrollieren.</li>
	<li>Übertragen Sie 96-Well-V-Boden-Platte auf einem Inkubator und inkubieren Sie die Platte für 1 Stunde bei 37 ° C in Anwesenheit von 5 % CO2. Während die 96-Well-V-Bodenplatte Inkubation ist, reinigen Sie die Oberfläche der Biosicherheit Schrank mit 70 % Ethanol und laufen Sie das UV-Licht für 15 min.</li>
	<li>Entfernen Sie eine vollständig konfluierende T75 Flasche K562 Zellen aus dem Inkubator, mischen Sie die Zellen, die nun mit einer sterilen 5 mL pipettieren und übertragen Sie 5 mL der Zellen auf eine sterile 15 mL konische Rohr. Hinweis: Die K562-Zellen sind in RPMI-10 verwaltet und subkultiviert auf 1 x 106/mL.</li>
	<li>Die Anzahl der Zellen durch das Entfernen von 10 µL Zellen aus dem sterilen 15 mL konische Röhrchen und mischen mit 10 µL Tryphan blau. Zählen Sie die Zellen mit einem Hemocytometer um zu bestimmen, die Gesamtzahl der Zellen in der 15 mL konische Röhre.</li>
	<li>Die 15 mL konisch mit Zellen bei ~ 1.200 x g für 10 Minuten zentrifugieren, überstand abgießen und Aufschwemmen der Zellen im warmen RPMI-10 in einer Konzentration von 80.000 Zellen/30 µL Medien (2,66 x 106 -Zellen-/mL).</li>
	<li>Entfernen der 96-Well-V-Boden-Platte aus dem Inkubator (Schritt 1.6), 30 µL K562 Zellen in jede Vertiefung der 96-Well-V-Boden-Platte übertragen und Mischen von pipettieren rauf und runter 5 – 10 mal. Übertragen Sie 96-Well-V-Boden-Platte auf einem Inkubator und inkubieren Sie die Platte für 1 h bei 37 ° C in Anwesenheit von 5 % CO2.</li>
	<li>Entfernen Sie nach Inkubation für 1 h die 96-Well-V-Boden-Platte aus dem Inkubator und Zentrifuge bei ~ 1.200 x g für 5 Minuten. Nach Zentrifugation Dekantieren der Medien aus den Vertiefungen durch die Platte in einen Behälter mit 10 % Bleichmittel auf den Kopf drehen.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen in jedem Bohrloch von resuspending sie in 125 µL warm RPMI-10, mischen mit einer Pipette und Zentrifugieren der Platte ~ 1.200 x g für 5 min. Dekantieren der Medien durch die Platte in einen Behälter mit 10 % Bleichmittel auf den Kopf drehen. Wiederholen Sie diese Waschschritt zwei Mal.</li>
	<li>Nach dem Waschen, fügen Sie 100 µL der warmen RPMI-10 zu jedem mix gut, rauf und runter mit dem pipettieren und inkubieren Sie die Platte für 48 h bei 37 ° C in Anwesenheit von 5 % CO2.</li>
</ol>2. Tag 3
<ol><li>Entfernen Sie die 96-Well-V-Boden-Platte mit 100 µL Zellen und Medien/Brunnen aus dem Inkubator und verschieben Sie ihn auf eine biologische Kabinett. Mit einer Mehrkanal-Pipette, Mischung der Inhalt der einzelnen gut und die Zellen zu übertragen und Medien zu einem 96 gut U-Boden Platte oder, vorab mit der Bezeichnung 5 mL Polypropylenröhrchen.</li>
	<li>Spülen Sie jedem Bohrloch in der 96-Well-V-Boden-Platte mit 100 µL 1 % Paraformaldehyd (PFA) 1 x Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) und Transfer in die jeweiligen Vertiefungen in den 96 gut U-Bodenplatte oder beschrifteten 5 mL Polypropylenröhrchen vom Schritt 2.1 eine endgültige Ausbeute Konzentration von 0,5 % PFA/Brunnen oder Rohr. Mischen Sie gründlich mit einer Mehrkanal-Pipette, decken Sie die Platte mit Alu-Folie ab, und lassen Sie es sich in den Inkubator für 30 Minuten, die Zellen zu beheben.</li>
	<li>Bereiten Sie das Durchflusszytometer (siehe Tabelle der Materialien zum Beispiel) durch Ausführen von ungefärbten K562-Zellen, um die Seite und forward Scatter zusammen mit der Fluoreszenz-Einstellungen zu kalibrieren. Der einzige Fluoreszenz-Kanal erforderlich ist FL1, wie GFP die einzige Fluoreszenz emittiert aus den Zellen ist. Erwerben von ~ 30, 000-50.000 Zellen von jeder Probe. Hinweis: Jeder kann Lesen einer einzigen Fluoreszenz Durchflusszytometer kann verwendet werden, für die Datenerfassung, wie Zellen infiziert mit RVP nur grün fluoreszieren aufgrund des Vorhandenseins von GLP ertönt, und keine Fluoreszenz-Kanal benötigt.</li>
</ol>(3) Datenanalyse
<ol><li>
Analysieren Sie Daten, die auf die Verwendung von Flow Cytometry Analysesoftware Durchflusszytometer (siehe Tabelle der Materialien).
	<ol>
<li>Gruppe das erste Tor basiert auf FSC-A (forward Scatter – Bereich) Vs FSC-H (forward Scatter – Höhe) Einzelzellen und Analyse12Auto-fluoreszierende Dubletten ausschließen. Dann Tor Singulett-gated Zellen basierend auf SSC-A (Side Scatter – Bereich) Vs FSC-A Fremdkörper Autofluorescent auszuschließen.</li>
		<li>SSC-A Vs FSC-A geschlossene Zellen analysieren, für die der Ausdruck der GLP SSC-A Vs basiert GFP-A. Bestimmen Sie den Prozentsatz der GFP + Zellen für jede Verdünnung der Proben Serum und Kontrolle durch ein Tor um GFP + Zellen festlegen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Der durchschnittliche Anteil der GFP + Zellen pro Serum Probenverdünnung und Kontroll-Vertiefungen durch Division der Gesamtprozentsatz der GFP +-Zellen in dreifacher Ausfertigung Brunnen durch 3 zu bestimmen.</li>
	<li>Falte-Verbesserung der Infektion durch die Aufteilung der durchschnittliche Anteil der GFP + Zellen in Serumproben für jede Verdünnung geteilt durch den durchschnittlichen Prozentsatz der GFP +-Zellen in den RPMI-10 mit RVP (keine Serumprobe) Kontroll-Vertiefungen zu berechnen.</li>
	<li>Graph Falte-Erweiterung (y-Achse) versus Verdünnung (x-Achse), und führen Sie statistische Auswertung ANOVA, gefolgt von Tukey Post-hoc-Test für multiple Vergleiche mit.</li>
</ol>

<ol><li>George, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prior+exposure+to+zika+virus+significantly+enhances+peak+dengue-2+viremia+in+rhesus+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Prior exposure to zika virus significantly enhances peak dengue-2 viremia in rhesus macaques.</a> Sci Rep. 7 (1), 10498(2017).</li>
<li>Stettler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity%2C+cross-reactivity%2C+and+function+of+antibodies+elicited+by+Zika+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Specificity, cross-reactivity, and function of antibodies elicited by Zika virus infection.</a> Science. 353 (6301), 823-826 (2016).</li>
<li>Mattia, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dengue+reporter+virus+particles+for+measuring+neutralizing+antibodies+against+each+of+the+four+dengue+serotypes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Dengue reporter virus particles for measuring neutralizing antibodies against each of the four dengue serotypes.</a> PLoS One. 6 (11), e27252(2011).</li>
<li>Chiofalo, M. S., Teti, G., Goust, J. M., Trifiletti, R., La Via,, F, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subclass+specificity+of+the+Fc+receptor+for+human+IgG+on+K562%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Immunol%22%5BJournal%5D)">Subclass specificity of the Fc receptor for human IgG on K562.</a> Cell Immunol. 114 (2), 272-281 (1988).</li>
<li>Klein, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+the+K562+cell+line%2C+derived+from+a+patient+with+chronic+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Properties of the K562 cell line, derived from a patient with chronic myeloid leukemia.</a> Int J Cancer. 18 (4), 421-431 (1976).</li>
<li>Kliks, S. C., Nisalak, A., Brandt, W. E., Wahl, L., Burke, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody-dependent+enhancement+of+dengue+virus+growth+in+human+monocytes+as+a+risk+factor+for+dengue+hemorrhagic+fever%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Trop+Med+Hyg%22%5BJournal%5D)">Antibody-dependent enhancement of dengue virus growth in human monocytes as a risk factor for dengue hemorrhagic fever.</a> Am J Trop Med Hyg. 40 (4), 444-451 (1989).</li>
<li>Littaua, R., Kurane, I., Ennis, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+IgG+Fc+receptor+II+mediates+antibody-dependent+enhancement+of+dengue+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human IgG Fc receptor II mediates antibody-dependent enhancement of dengue virus infection.</a> J Immunol. 144 (8), 3183-3186 (1990).</li>
<li>Wang, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IgG+antibodies+to+dengue+enhanced+for+FcgammaRIIIA+binding+determine+disease+severity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">IgG antibodies to dengue enhanced for FcgammaRIIIA binding determine disease severity.</a> Science. 355 (6323), 395-398 (2017).</li>
<li>Dejnirattisai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-reacting+antibodies+enhance+dengue+virus+infection+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cross-reacting antibodies enhance dengue virus infection in humans.</a> Science. 328 (5979), 745-748 (2010).</li>
<li>Kawiecki, A. B., Christofferson, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+virus-induced+antibody+response+enhances+dengue+virus+serotype+2+replication+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Zika virus-induced antibody response enhances dengue virus serotype 2 replication in vitro.</a> J Infect Dis. 214 (9), 1357-1360 (2016).</li>
<li>Morens, D. M., Halstead, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+antibody-dependent+infection+enhancement+of+four+dengue+virus+serotypes+by+monoclonal+and+polyclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Measurement of antibody-dependent infection enhancement of four dengue virus serotypes by monoclonal and polyclonal antibodies.</a> J Gen Virol. 71 (Pt 12), 2909-2914 (1990).</li>
<li>Perfetto, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amine+reactive+dyes%3A+an+effective+tool+to+discriminate+live+and+dead+cells+in+polychromatic+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Amine reactive dyes: an effective tool to discriminate live and dead cells in polychromatic flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 313 (1-2), 199-208 (2006).</li>
<li>Priyamvada, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+Cell+responses+during+secondary+dengue+virus+infection+are+dominated+by+highly+cross-reactive%2C+memory-derived+plasmablasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">B Cell responses during secondary dengue virus infection are dominated by highly cross-reactive, memory-derived plasmablasts.</a> J Virol. 90 (12), 5574-5585 (2016).</li>
<li>Priyamvada, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+antibody+responses+after+dengue+virus+infection+are+highly+cross-reactive+to+Zika+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Human antibody responses after dengue virus infection are highly cross-reactive to Zika virus.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (28), 7852-7857 (2016).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Flaviviren wie DENV und ZIKV Teilen deutlichen Anzeichen Homologie in ihre strukturelle und nicht strukturelle Proteine, die Antikörper zu erzeugen, die mit einander13,14Kreuzreaktion. Diese kreuzreaktiven Antikörperantworten nachweislich zur Verbesserung der Infektion in Vivo und in Vitro mit einer heterologen Serotyp oder andere im Zusammenhang mit Flaviviren1,2. Kreuz zu verbessern, I...

Antikörper abhängige Verstärkung (ADE) der Infektion ist ein Prozess, wobei teilweise kreuzreaktiven Antikörperantworten induziert durch einen Serotyp des Virus verbessert die Aufnahme von einem anderen Serotyp des Virus, was zu erhöhten Virusreplikation und Virämie. ADE wurde ausgiebig in Dengue-Virusinfektionen (DENV) dokumentiert, wo die vier wichtigsten Serotypen weit verbreitet sind. Bei einem Teil der Patienten ist ADE Dengue hämorrhagisches Fieber (DHF) zugeordnet. Wir haben vor kurzem gezeigt, dass Zika-Virus (ZIKV)-Infektion signifikant hohe DENV kreuzreaktiven Antikörperantworten induziert, die ADE DENV in Vitro verursacht und wahrscheinlich dazu beigetragen, die Verbesserung der DENV Virämie in Vivo1 , 2. Antikörper-abhängige Verstärkung-Assays sind ein wertvolles Instrument zur Bewertung der Kapazität von Antikörpern gegen Sekundärinfektion mit verwandten Viren erweitern und wertvolle Einblicke in die Pathogenese der Flavivirus Infektionen und informieren die Entwicklung von Impfstoffen.
Der Test beschrieben verwendet hier DENV RVP zusammen mit K562-Zellen, die normalerweise unzulässig für Infektionen sind. RVP sind strukturell intakt Replikation inkompetenten DENV Viruspartikel, die ein Sub-genomische grün fluoreszierendes Protein (GFP) Replicon zu kodieren, die nach einer Runde Replikation3ausgedrückt wird. Als solche Zellen, die mit RVP infiziert fluoreszieren grün und leicht detektiert werden mittels Durchflusszytometrie oder Mikroskopie. Die RVP in diesem Assay verwendet wurden aus kommerziellen Quellen gewonnen. Sie können gegen andere Viren generiert und verwendet in der Probe in diesem Manuskript beschrieben. Unterdessen sind K562 Zellen einer FcγIII Rezeptor-exprimierenden Leukämie Zelllinie, die an die Fc-Region von Antikörper binden und im Beisein von Sub-Neutralisierung Konzentrationen von Antikörpern4,5infiziert werden.
ADE-Assays wurden ausgiebig in Studien zur Untersuchung der Risikofaktoren für schwere Dengue-Fieber und die Mechanismen der in-vitro- ADE abzugrenzen verwendet6,7,8. Der hier beschriebenen ADE-Assay schnell und einfach lässt sich die Kapazität des Serum zur Verbesserung von in-vitro- Infektion mit RVP und flow Cytometry, im Vergleich zu anderen Assays verwendet derzeit, die entweder erfordern die Bestimmung der Bildung von Plaque zu bestimmen Einheiten (Pfu) in Vero-Zellen oder Antikörper Färbung der infizierten Zellen6,7,8,9,10,11, beide zeitaufwendig und arbeitsintensiv sind intensive.

<table><tbody><tr><td>DENV 1-4 RVP</td><td>Integral Molecular</td><td>RVP-501</td><td></td></tr><tr><td>K562 Zellen</td><td>ATCC</td><td>CCL-243</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Corning</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GE Lebensgeschichten</td><td>SH 30910.03</td><td>10% FBS in RPMI-10</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>MP biomedizinische 1670049</td><td></td><td>100 IE Pen/ml, 100 ug Streptomycin in RPMI-10</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Cellegro</td><td>25-060-Cl</td><td>0,025 M in RPMI-10</td></tr><tr><td>MEM Nicht-essentielle Aminosäurelösung (100 mal;)</td><td>Sigma</td><td>M7145</td><td>1x in RPMI-10</td></tr><tr><td>Natriumpyruvat</td><td>Cellegro</td><td>25-000-Cl</td><td>1mM in RPMI-10</td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Fisher</td><td>Scientific MT25005CI&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sterile V-Bodenplatten</td><td>Thomas Scientific</td><td>333-8001-01V</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon Polypropylen 5 ml FACS-Röhrchen</td><td>VWR</td><td>60819-728</td><td></td></tr><tr><td>Unsterile U-Bodenplatten</td><td>Falcon</td><td>Ref 353910</td><td>Eine Alternative zu FACS-Röhrchen</td></tr><tr><td>5 ml, steril, serologische Pipette</td><td>Denville</td><td>P7127</td><td></td></tr><tr><td>200 μl sterile Pipettenspitzen</td><td>Denville</td><td>P3020 CPS</td><td></td></tr><tr><td>20uL sterile Pipettenspitzen</td><td>Denville</td><td>P1121</td><td></td></tr><tr><td>50-200uL Mehrkanalpipette</td><td>Denville</td><td>P3975-8-B</td><td></td></tr><tr><td>5-50uL Mehrkanalpipette</td><td>Denville</td><td>P3975-9-B</td><td></td></tr><tr><td>20% formadehyde</td><td>Tousimis</td><td>&nbsp;#1008B</td><td></td></tr><tr><td>Wasserbad</td><td>ThermoFisher</td><td>TSCOL35</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>2231000387</td><td>Eine Alternative zu einem Wasserbad zur Wärmeinaktivierung</td></tr><tr><td>CO2-Inkubator</td><td>ThermoFisher</td><td>13-998-213</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Flüssigbleiche</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9724348</td><td></td></tr><tr><td>Flowjo 9.8</td><td>TreeStar, Inc.</td><td></td><td>Software für die Durchflusszytometrie-Analyse</td></tr><tr><td>BD FACSDiva 6.1.2</td><td>Becton Dikinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD LSR II Durchflusszytometer</td><td>Becton Dikinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flüssigbleiche</td><td>Fisher</td><td>Scientific NC9724348</td><td></td></tr></tbody></table>

eine einfache durchflusszytometrie basierten test um festzustellen, in-vitro- antikörper abhängige verbesserung des dengue-virus mit zika-virus genesenden serum

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

Antikörper abhängige Verstärkung der Infektion hat sich gezeigt, eine wichtige Rolle in Dengue-virale Pathogenese zu spielen. Traditionelle Assays, die die Kapazität von Antikörpern oder Serum Infektion in unzulässige Zelllinien zu messen haben stützte sich auf mit viralen Ausgabe in den Medien, gefolgt von Plaque-Assays, um Infektion zu quantifizieren. Diese Tests haben in jüngerer Zeit, Dengue-Virus (DENV) Infektion in die Zell-Linien mit Gewebekulturen beschriftete Antikörper untersucht. Beide Ansätze haben Einschränkungen, die den weit verbreiteten Einsatz dieser Techniken einschränken. Hier beschreiben wir einen einfachen in Vitro Assay mit Dengue-Virus Reporter Viruspartikel (RVP), die Ausdrücken grün fluoreszierendes Protein und K562-Zellen zu Antikörper abhängige Verstärkung (ADE) der DENV Infektion mit Serum, das Rhesus entnommen wurde Makaken 16 Wochen nach der Infektion mit Zika-Virus (ZIKV). Diese Technik ist zuverlässig, beinhaltet minimale Manipulation von Zellen, beinhaltet jedoch nicht die Verwendung von live Replikation zuständigen Virus und in einem hohen Durchsatz-Format für eine quantitative Auslesen mit Durchflusszytometrie erhalten durchgeführt werden kann. Darüber hinaus kann dieser Assay leicht angepasst werden, um Antikörper abhängige Verstärkung (ADE) der andere Flavivirus Infektionen wie Gelbfieber-Virus (YFV), japanische Equine Enzephalitis-Virus (JEEV), West-Nil-Virus (WNV) etc., RVP vorliegen, zu untersuchen. Die einfache Einrichtung der Assay, Datenanalyse und Interpretation der Ergebnisse macht es sehr geeignet, um die meisten Labor-Einstellungen.

Seren von 4 Rhesus Makaken und auf ihr Potenzial zur Verbesserung DENV-1 getestet wurden gesammelt 16 Wochen nach Infektion mit ZIKV, 2, 3 und 4 Infektion in K562-Zellen. Die Tiere hatten Spitze Virämie von ~ 1 x 105 Exemplare von ZIKV RNA/mL Plasma vom 3. Tag nach der Infektion, die auf ein Niveau gesunken, die unter der Nachweisgrenze von 7 Tage nach der Infektion lagen. Keine Virämie wurde im Plasma auf 16 Wochen nach der Infektion festgestellt. Dann die RVP-Assay wurde durc...

Wir beschreiben eine einfache und leichte Protokoll zur Messung der Antikörper abhängige Verstärkung der Infektion durch Zika Virus genesenden Serum mit Dengue-Virus Reporter Viruspartikel.

Eine einfache Durchflusszytometrie basierten Test um festzustellen, In-vitro- Antikörper abhängige Verbesserung des Dengue-Virus mit Zika-Virus genesenden Serum

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Fähigkeit von Seren zu bestimmen, die von mit dem Zika-Virus infizierten Rhesusaffen entnommen wurden, um eine antikörperabhängige Verstärkung der Dengue-Virusinfektion in vitro zu vermitteln. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Zusammenhang mit der antikörperabhängigen Verstärkung der Dengue-Infektion durch Zika-Virus-induzierte kreuzreaktive Antikörper zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie hochwertiger, einfacher und leicht durchzuführen ist.Dieses Verfahren wird von William Valiant, einem Doktoranden der aufstrebenden Infektionskrankheit, in meinem Labor demonstriert. Beginnen Sie mit dem Auftauen der Serumproben bei Raumtemperatur. Nach dem Auftauen 100 Mikroliter jeder Serumprobe in ein steriles Röhrchen umfüllen und 30 Minuten lang bei 56 Grad Celsius erhitzen und aktivieren.Nehmen Sie als Nächstes 10-fache serielle Verdünnungen der Serumprobe vor, die von eins zu eins bis eins in kaltem RPMI 10 reichen. Übertragen Sie dann 10 Mikroliter jeder verdünnten Serumprobe in die Vertiefungen einer sterilen 96-Well-V-Bodenplatte. Tauen Sie anschließend Dengue-Viruspartikel eins, z

a-simple-flow-cytometry-based-assay-to-determine-vitro-antibody

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Source: Asad, S., et al. Quantification of Antibody-dependent Enhancement of the Zika Virus in Primary Human Cells. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates antibody-dependent enhancement of Zika virus infection in human primary macrophages, using dengue antibody–virus complexes to model how cross-reactive antibodies facilitate Fcγ receptor–mediated viral entry and replication for studying infection mechanisms and immune interactions.

Antibody-Dependent Enhancement of Zika Virus by Dengue Antibodies in Human Primary Macrophages

Quelle: Contreras, D., et al.. Zika-Virus-infektiöses Zellkultursystem und die in-vitro-prophylaktische Wirkung von Interferonen J. Vis. Exp. (2016)Das Video zeigt die Detektion von Zika-viralen dsRNA-Zwischenprodukten in infizierten epithelialen Zellen mittels Immunzytochemie. Infizierte Zellen werden fixiert und anschließend mit einer Blockierungslösung blockiert. Die primären und sekundären Antikörper werden hinzugefügt. Die Kerne werden mit einem fluoreszierenden Farbstoff angefärbt. Die...

Nachweis von dsRNA-Replikationsintermediaten des Zika-Virus mittels Immunzytochemie

Dieses Video zeigt einen Assay zur Messung der antikörperabhängigen Verstärkung (ADE) von Dengue-Virusinfektionen mit Hilfe des Zika-Virus-Rekonvaleszenzserums. Der Assay verwendet Dengue-Reporter-Viruspartikel (RVPs), die für ein grün fluoreszierendes Protein kodieren. Serumantikörper gegen das Zika-Virus kreuzreagieren mit RVPs und bilden einen Komplex. Die gebundenen Antikörper erhöhen die RVP-Aufnahme durch Zellen, die den Fc-Rezeptor exprimieren, was mittels Durchflusszytometrie...

Ein In-vitro-Assay zur Untersuchung der Antikörper-abhängigen Verstärkung einer Virusinfektion

Das Video zeigt einen in vitro Assay zum Screening von Interferonen mit antiviraler Aktivität gegen das Zika-Virus, einen menschlichen Krankheitserreger. Innerhalb der Wirtszelle vermehrt sich das Zika-Virus bei der Internalisierung, infiziert benachbarte Zellen und bildet unterschiedliche Zonen oder virale Plaques. Typ-I-Interferon, das als antivirales Mittel wirkt, hemmt die Virusvermehrung und verhindert so die Bildung von viralen Plaques in der Monoschicht der Wirtszelle.

Ein In-vitro-Assay zum Screening von Interferonen als potente Inhibitoren des Zika-Viruswachstums

Zika-Virus (ZIKV), ein neu auftretender Erreger, wird mit fetalen Entwicklungsstörungen und Mikrozephalie in Verbindung gebracht. Die Etablierung eines effektiven infektiösen Zellkultursystems ist entscheidend für die Erforschung der ZIKV-Replikation sowie für die Entwicklung von Impfstoffen und Medikamenten. In dieser Arbeit werden verschiedene virologische Assays zum ZIKV dargestellt und diskutiert.

Zika Virus Infectious Zellkultursystem und die<em&gt; In Vitro</em&gt; Prophylaktische Wirkung von Interferonen

Aktuellen Multiplex Diagnostik Zika, Chikungunya und Dengue-Viren erfordern komplexe Probenvorbereitung und teure Instrumentierung, und sind in geringen Ressourcen Umgebungen geeignet zu erkennen. Wir zeigen eine Diagnose, mit denen Isotherme Verstärkung mit zielgruppenspezifischer Strang verschieblich Sonden zu erkennen und diese Viren mit hoher Sensitivität und Spezifität zu unterscheiden.

Gemultiplexten isothermen Verstärkung basiert Diagnoseplattform zu erkennen, Zika, Chikungunya und Dengue-Fieber 1

Ein Protokoll, Antigen-spezifische T-Zell-Reaktionen in den Organen der Immunabwehr des Ifnar1- / - Mausmodell für die Zika-Virusinfektion (ZIKV) zu bewerten ist beschrieben. Diese Methode ist von zentraler Bedeutung für die Untersuchung der zellulären Mechanismen des Schutzes und immunpathogenese ZIKV Impfstoffe und ist auch wertvoll für die Beurteilung der Wirksamkeit.

Bewertung der Zika-Virus-spezifischen T-Zell-Reaktionen in Organe der Immunabwehr von infizierten Ifnar1- / - Mäusen

Wir beschreiben eine Methode zur Bewertung der Wirkung der vorbestehenden Immunität gegen Dengue-Virus auf der Zika-Virus-Infektion mit humanem Serum, primären humanen Zellen und Infektion Quantifizierung durch quantitative Real-Time Polymerase-Kettenreaktion.

Quantifizierung der Antikörper-abhängige Verstärkung der Zika-Virus in primären humanen Zellen

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Vermehrung des Zika-Virus (ZIKV) in Nierenzellen von Vero-Afrikanischen Grünen Meerkatzen und die Quantifizierung von ZIKV unter Verwendung zellbasierter kolorimetrischer Immundetektionsmethoden in 24-Well- und 96-Well-Formaten (Hochdurchsatz).

Virusvermehrung und zellbasierte kolorimetrische Quantifizierung

Hier demonstrieren wir die Verwendung der zellbasierten elektrischen Impedanz (CEI) als eine sehr einfache und unkomplizierte Methode, um die Infektion und Replikation des Zika-Virus in menschlichen Zellen in Echtzeit zu untersuchen. Darüber hinaus ist der CEI-Assay nützlich für die Bewertung antiviraler Verbindungen.

Zellbasierte elektrische Impedanzplattform zur Evaluierung von Zika-Virus-Inhibitoren in Echtzeit

Erfahren Sie eine einfache Durchflusszytometrie-Methode zur Untersuchung der antikörperabhängigen Verstärkung von Dengue-Virus-Infektionen durch Zika-Virus-Serum. Dieses Protokoll ermöglicht Hochdurchsatzanalysen für Infektionskrankheiten.

Eine einfache Durchflusszytometrie basierten Test um festzustellen, In-vitro- Antikörper abhängige Verbesserung des Dengue-Virus mit Zika-Virus genesenden Serum (Video) | JoVE Journal

Eine einfache Durchflusszytometrie basierten Test um festzustellen, In-vitro- Antikörper abhängige Verbesserung des Dengue-Virus mit Zika-Virus genesenden Serum

Weitere Videos entdecken