Hoher Durchsatz SiRNA Screening für Chlorpikrin und Fluorwasserstoff-induzierte Hornhaut Epithelzelle Verletzungen

Dieses Video zeigt unsere Methoden für das Hochdurchsatz-siRNA-Screening in einem Hornhautepithelzellmodell für toxische Schäden. Diese Arbeit ist wichtig, da das Hochdurchsatz-siRNA-Screening eine kosten- und zeiteffiziente Methode ist, um Signalwege und Regulatoren der zellulären Reaktion auf Giftstoffe aufzuklären. Diese Arbeit kann dazu beitragen, besser zu verstehen, wie die Hornhaut auf giftige Beleidigungen reagiert.

Bereiten Sie eine Suspension von Hornhautepithelzellen in vorgewärmtem Medium mit 0,5 Mikrogramm Hydrocortison pro Milliliter in einer Einwegmediumflasche vor. Schwenken Sie die Flasche, um die Zellen gleichmäßig aufzuhängen, und gießen Sie sie in ein Reservoir auf dem orbitalen Shaker-Nest eines automatisierten Liquid Handlers. Bewahren Sie die Zellsuspension während des Zellbeschichtungsprozesses auf einer 37-Grad-Warmhalteplatte auf.

Verwenden Sie einen automatisierten Liquid Handler, um Zellen mit einer Dichte von eintausend Zellen pro Well in 70 Mikrolitern Medium pro Well auf einer 96-Well-Platte auf Platten hinzuzufügen. Bestücken Sie mindestens 14 96-Well-Platten mit Zellen für jede zu untersuchende siRNA-Bibliotheksplatte. Lassen Sie den Orbitalschüttler während des Aussaatprozesses konstant mit 100 Zyklen pro Minute laufen und verwenden Sie für alle Schritte eine Pipettiergeschwindigkeit von 50 Mikrolitern pro Sekunde.

Mischen Sie die Zellsuspension mit dem automatisierten Liquid Handler, bevor Sie die erste Platte aussäen. Aspirieren Sie 140 Mikroliter der Zellsuspension und geben Sie 70 Mikroliter in jede Vertiefung von zwei Zellkulturplatten. Wiederholen Sie das Mischen und Dosieren, bis alle Platten mit Zellen besiedelt sind.

Füllen Sie das Reservoir für die Zellsuspension nach Bedarf auf. Nachdem die Platten ausgesät wurden, nehmen Sie sie aus dem Liquid Handler und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Übertragen Sie sie dann in einen Zellkultur-Inkubator.

Bewerten Sie die Zelldichte aller Platten am nächsten Morgen mit einem automatisierten Bildgebungssystem, das im Zellkultur-Inkubator untergebracht ist. Schließen Sie Platten aus der Studie aus, die innere Vertiefungen aufweisen, die nicht zwischen 15 und 22 Prozent konfluent sind. Transfizieren Sie die Zellen 24 Stunden nach der Aussaat mit vier Picomolen pro Vertiefung siRNA und 0,3 Mikrolitern pro Vertiefung Transfektionsreagenz wie folgt.

Erwerben Sie siRNA-Bibliotheksplatten vom Anbieter, die so konfiguriert sind, dass sie 80 siRNA-Ziele pro Platte enthalten, wobei die Spalten eins und zwölf leer bleiben. Rekonstituieren Sie die siRNA-Bibliotheksplatte mit siRNA-Puffer gemäß den Anweisungen des Herstellers auf eine Endkonzentration von zwei Picomolen pro Mikroliter für jede Vertiefung siRNA. Führen Sie alle Transfektionen mit einem automatisierten Liquid Handler und einer Pipettiergeschwindigkeit von 25 Mikrolitern pro Sekunde für alle Schritte durch.

Verwenden Sie vorkonfigurierte Tip-Boxen, um nur die Wells zu adressieren, die transfiziert werden sollen. Verwenden Sie die obere Hälfte der Bibliotheksplatte, um einen Satz von sechs Replikationsplatten zu transfizieren, die als Oberplattensatz bezeichnet werden"Verwenden Sie die untere Hälfte der Bibliotheksplatte, um einen anderen Satz von sechs Nachbildungen zu transfizieren, der als Bodenplattensatz bezeichnet wird"Zusammen bilden die zwölf Platten einen vollständigen Plattensatz, und jede Zellplatte enthält denselben Satz von Steuerelementen. Transfizieren Sie die Vertiefungen B2 bis B6 aller Platten mit siRNA aus dem negativen Pool, nachdem alle oberen und unteren Plattensätze mit Bibliotheks-siRNA transfiziert wurden.

Transfizieren Sie auch die Vertiefungen B2 bis B6 von zwei weiteren Platten, die keine Bibliotheks-siRNA mit negativer Pool-siRNA erhalten. Diese dienen als nicht verfügbar gemachte Steuerelemente. Inkubieren Sie alle Zellplatten vier Stunden lang in einem Zellkultur-Inkubator, nachdem die Transfektionsmischungen hinzugefügt wurden, und mischen Sie sie stündlich durch sanftes Klopfen.

Verwenden Sie einen automatisierten Liquid Handler, um die Platten zweimal mit vorgewärmtem Medium zu waschen, das ein bis fünf Mal in PBS verdünnt und mit 100 Mikrolitern pro gut vorgewärmtem Medium erneut zugeführt wird. Verwenden Sie für alle Schritte eine Pipettiergeschwindigkeit von 50 Mikrolitern pro Sekunde. Verwenden Sie die Wells C2 bis C6 als nicht transfizierte Kontrollen.

Bewahren Sie die Vertiefungen B7 bis B11 und C7 bis C11 nicht transfiziert auf, um sie als Arzneimittel- und Vehikelkontrollen für die Exposition gegenüber toxischen Stoffen zu verwenden. Verwenden Sie 24 Stunden nach der Transfektion einen automatischen Liquid Handler, um die Platten erneut zuzuführen. Verwenden Sie für alle Schritte eine Pipettiergeschwindigkeit von 50 Mikrolitern pro Sekunde.

Saugen Sie 100 Mikroliter aus jeder Vertiefung an und entsorgen Sie diese in einem Abfallbehälter. Füttern Sie jede Vertiefung mit 100 Mikrolitern pro Vertiefung vorgewärmtem H-Cort.medium. Leeren Sie den Abfallbehälter nach Bedarf.

Füllen Sie den Behälter bei Bedarf mit Medium auf. Zwei Tage nach der Transfektion und zwei Stunden vor der Exposition ist eine 62,5 mikromolare Lösung der Positivkontrolle Cardamonin in H-Cort herzustellen. und in Reihe B des 8-reihigen Verdünnungsbehälters geben.

Bereiten Sie eine 06,25-prozentige Lösung von DMSO in H-Cort. meduim vor und fügen Sie sie in Reihe C desselben Reservoirs hinzu. DMSO wird als Fahrzeugsteuerung verwendet.

Verwenden Sie den automatisierten Liquid Handler, um 10 Mikroliter Medium aus den Vertiefungen B7 bis B11 und C7 bis C11 jeder Zellplatte zu entnehmen und in den Reihen G und H des Reservoirs zu entsorgen. Achten Sie darauf, vorkonfigurierte Tip-Boxen zu verwenden, um nur die Wells zu adressieren, die die Positiv- und Fahrzeugkontrollen erhalten, und verwenden Sie für alle Schritte eine Pipettiergeschwindigkeit von 50 Mikrolitern pro Sekunde. Übertragen Sie 10 Mikroliter der Positiv- und Vehikelsteuerung in diese Vertiefungen und mischen Sie dreimal.

Setzen Sie diese Zellplatten wieder in den Inkubator ein. Wiederholen Sie diese Schritte für alle weiteren Zellplatten. Führen Sie alle Chemikalienexpositionsvorgänge in einem chemischen Abzug mit doppelten Nitrilhandschuhen, einem Laborkittel, Einweg-Ärmelschützern aus Polyethylen und einer Schutzbrille durch.

Dekontaminieren Sie Pipettenspitzen und Reservoire, die mit der Flusssäure in Berührung gekommen sind, sowie flüssige Flusssäure mit 2,5 Prozent Calciumgluconat vor der Entsorgung im Sondermüllstrom. Bereiten Sie für jede zu untersuchende Bibliotheksplatte eine 0,0036-prozentige Flusssäure-Mediumlösung her, indem Sie 288 Mikroliter einprozentige Flusssäure zu 80 Millilitern vorgewärmtem H-Cort hinzufügen. Medium in einer 150 Milliliter Flasche.

Schwenken Sie die Flasche und inkubieren Sie die verdünnte Flusssäure in einem 37-Grad-Inkubator in der chemischen Abzugshaube für zehn Minuten. Geben Sie die Flusssäure-Mediumlösung in ein Reagenzreservoir auf einem Plattenwärmer. Führen Sie die Belichtung mit zwei Technikern durch, die im Tandem arbeiten.

Lassen Sie den Techniker auf der rechten Seite das Zellkulturmedium mit einer Zwölfkanalpipette von der Zellplatte entfernen und geben Sie die Platte dann an den Techniker auf der linken Seite. Lassen Sie den Techniker auf der linken Seite 100 Mikroliter der Flusssäure-Mediumlösung pro Vertiefung hinzufügen. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle Zellplatten, die Giftstoffen ausgesetzt werden sollen.

Wiederholen Sie diesen Vorgang auch für nicht belichtete Kontrollplatten, indem Sie frisches Medium anstelle der Flusssäurelösung verwenden. Legen Sie die Platten für 20 Minuten in einen chemischen Abzugshauben-Inkubator und stellen Sie sie dann wieder in den Zellkultur-Inkubator. Wiederholen Sie den Schritt der Positivkontrollzugabe wie zuvor gezeigt, sobald alle Platten freigelegt und in den Zellkulturinkubator zurückgebracht wurden.

Sammeln Sie den Zellkulturüberstand und bewerten Sie die Lebensfähigkeit der Zellen mit einem MTT-Assay 24 Stunden nach der Exposition. Bereiten Sie eine Lösung von 0,5 Milligramm pro Milliliter MTT-Substrat in PBS vor, die 10 Gramm pro Liter Glukose enthält, und erwärmen Sie sie auf 37 Grad. Geben Sie die MTT-Substratlösung in ein Reservoir auf einem automatisierten Liquid Handler.

Verwenden Sie für alle Schritte eine Pipettiergeschwindigkeit von 50 Mikrolitern pro Sekunde. Konfigurieren Sie Tipp-Boxen vor, um nur die zu untersuchenden Bohrlöcher zu adressieren. Verwenden Sie den automatisierten Liquid Handler, um 95 Mikroliter Medium aus den inneren 60 Vertiefungen der Zellplatte abzusaugen und 42,5 Mikroliter in jede der beiden 384-Well-Speicherplatten zu geben.

Geben Sie sofort 100 Mikroliter der MTT-Substratlösung pro Vertiefung zu den Zellplatten und inkubieren Sie sie eine Stunde lang bei 37 Grad in einem Zellkultur-Inkubator. Verschließen Sie die 384-Well-Speicherplatten und lagern Sie sie für die spätere Analyse bei minus 80 Grad. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle oberen und unteren Plattensätze und die zugehörigen nicht belichteten Steuerelemente.

Füllen Sie den MTT-Substratbehälter nach Bedarf auf. Verwenden Sie die Spitzen bei Bedarf zwischen den Replikaten wieder, waschen Sie sie jedoch bei der Zugabe von MTT-Substratlösung und beim Wechsel zwischen Plattensätzen. Nach der einstündigen Inkubation entnehmen Sie mit dem automatisierten Liquid Handler die MTT-Substratlösung aus den inneren 60 Vertiefungen jeder Zellkulturplatte und ersetzen Sie sie durch 100 Mikroliter DMSO pro Vertiefung.

Verwenden Sie eine Pipettiergeschwindigkeit von 50 Mikrolitern pro Sekunde für alle Schritte und konfigurieren Sie die Tip-Boxen so vor, dass nur die zu testenden Wells angesprochen werden. Leeren Sie den Abfallbehälter und füllen Sie den DMSO-Behälter bei Bedarf wieder auf. Schütteln Sie die Teller auf einem Plattenschüttler drei Minuten lang.

Messen Sie die Absorption bei 570 und 690 Nanometern mit einem Plattenspektrophotometer. Subtrahieren Sie die Hintergrundextinktion bei 690 Nanometern von der Extinktion bei 570 Nanometern und mitteln Sie die Werte für jede Kontrollgruppe auf der nicht belichteten Platte. Berechnen Sie die prozentuale Viabilität, indem Sie die Absorptionswerte für jedes Ziel durch den durchschnittlichen Absorptionswert der nicht exponierten Kontrollen dividieren.

Verwenden Sie den durchschnittlichen nicht exponierten negativen Pool, um die prozentuale Zellenlebensfähigkeit für alle Ziele zu berechnen. Messen Sie die Konzentration von IL-8 in Zellkulturüberständen mit einem Assay ohne Waschkugeln gemäß den Anweisungen des Herstellers. Erstellen Sie ein Assay-Platten-Layout, um Proben und Standards aufzunehmen.

Nehmen Sie die 384-Well-Aufbewahrungsplatten aus dem Gefrierschrank mit minus 80 Grad und tauen Sie sie bei Raumtemperatur auf. Zentrifugieren Sie die Platten kurz, um die Probe am Boden der Vertiefungen zu sammeln. Geben Sie die Anti-IL-8-Akzeptorkügelchen und den biotinylierten Antikörper auf eine schwarze 384-Well-Speicherplatte.

Geben Sie das Bead-Antikörper-Gemisch in die Vertiefungen, die für die Verwendung für Proben und die Standardkurve vorgesehen sind, entsprechend dem Layout der Assay-Platte. Rekonstituieren Sie den Standard in einem Medium, das 354 mikromolares Natriumchlorid enthält. Nehmen Sie zweifache serielle Verdünnungen der Standardkurve vor und fügen Sie sie in dreifacher Ausfertigung auf eine andere schwarze 384-Well-Speicherplatte hinzu.

Verwenden Sie einen automatisierten Liquid Handler, um den Assay durchzuführen. Verwenden Sie vorkonfigurierte Tip-Boxen, um die Wells entsprechend dem Layout der Assay-Platte zu adressieren. Verwenden Sie für alle Schritte eine Pipettiergeschwindigkeit von 50 Mikrolitern pro Sekunde.

8 Mikroliter des Akzeptorbead-Antikörper-Gemischs werden auf weiße 384-Well-Assay-Platten mit flacher Vertiefung übertragen. Das Bead-Antikörper-Gemisch wird in Vertiefungen gegeben, die für die Verwendung von Proben und die Standardkurve entsprechend dem Layout der Assay-Platte vorgesehen sind. Übertragen Sie dann die Standardkurve in die entsprechenden Vertiefungen auf den Assay-Platten für die flachen Vertiefungen.

Bereiten Sie als Nächstes eine 3,54 molare Natriumchloridlösung in einem flachen Reservoir vor. Passen Sie die Salzkonzentration der Proben an die der Standardkurve an, indem Sie 4,5 Mikroliter der Natriumchloridlösung in die Proben in den schwarzen 384-Well-Lagerplatten überführen. Mischen Sie die Proben dreimal mit einem Mischvolumen von 30 Mikrolitern und übertragen Sie dann zwei Mikroliter der Proben auf die weißen flachen Well-Assay-Platten entsprechend dem Layout der Assay-Platte.

Eine Stunde lang im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubieren. Geben Sie Sekundärperlen auf eine schwarze 384-Well-Aufbewahrungsplatte. Geben Sie die Kügelchen in die Vertiefungen, die für die Verwendung für Proben und die Standardkurve gemäß dem Layout der Assay-Platte vorgesehen sind.

Übertragen Sie 10 Mikroliter der Sekundärkügelchen in Vertiefungen der weißen 384-Well-Assay-Platte, die entsprechend dem Layout der Assay-Platte eine Standardkurve oder Proben aufnehmen. Waschen Sie die Spitzen zwischen den einzelnen Tellern. Eine weitere Stunde im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubieren.

Versiegeln Sie die Assay-Platten mit durchsichtigen Plattensiegeln und scannen Sie mit einem Platten-Reader, der mit dem Bead-basierten Assay kompatibel ist. Verwenden Sie einen Abstand von 0,2 Millimetern zwischen Platte und Detektor, eine Anregungszeit von 180 Millisekunden für den Scan und eine Messzeit von 550 Millisekunden. Importieren Sie die Rohdaten aus den IL-8-Assays in eine Tabelle.

Verwenden Sie die automatische Kurvenanpassung für die Standardkurve der IL-8-Assays und konvertieren Sie dann die Rohdaten für jede Probe in Pikogramm pro Milliliter. Berechnen Sie den Durchschnitt der sechs Replikate für jedes Ziel. Berechnen Sie dann die SSMD-Werte und falten Sie die Änderung relativ zu den exponierten Negativkontrollen.

Zeigen Sie die Daten in einem Dual-Flashlight-Diagramm an, das die Faltungsänderung entlang der x-Achse und SSMD entlang der y-Achse für jedes Ziel zeigt. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass wir Methoden und Kulturbedingungen entwickelt haben, die für die Hochdurchsatz-Screening-Studie zur Augenschädigung durch Giftstoffe geeignet sind. Wir haben die Nützlichkeit dieser Methoden bewiesen, indem wir das primäre Screening einer siRNA-Bibliothek in einem Modell der Flusssäureschädigung durchgeführt haben.

Genomische Hochdurchsatzdatensätze können wesentlich zum Verständnis der Rolle beitragen, die bestimmte Gene bei Verletzungen oder Krankheiten spielen, was dazu beitragen kann, Folgestudien in vitro oder in vivo effizienter zu fokussieren.